عزل الخلايا الشحمية البنية من الأنسجة الدهنية البنية بين الكتفين لتحليل التعبير الجيني والبروتيني
Summary
تصف هذه الدراسة طريقة جديدة لعزل الخلايا الشحمية البنية للفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.
Abstract
الأنسجة الدهنية البنية (BAT) هي المسؤولة عن توليد الحرارة غير المرتعش في الثدييات ، والخلايا الشحمية البنية (BAs) هي الوحدات الوظيفية ل BAT. بتحتوي هذه القطيرات على قطرات ليبيدات متعددة الأعراق وميتوكوندريا وفيرة، وتعبر عن فصل البروتين 1 (UCP1). يتم تصنيف BAs إلى نوعين فرعيين بناء على أصلها: BAs الكلاسيكية المشتقة من الجنين (cBAs) والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة BAs. نظرا لكثافتها المنخفضة نسبيا ، لا يمكن عزل BAs عن BAT بطريقة الطرد المركزي التقليدية. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs من الفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني. في هذا البروتوكول ، تم هضم BAT بين الكتفين من الفئران البالغة بمحلول Collagenase و Dispase ، وتم إثراء BAs المنفصلة بمحلول يوديكسانول 6٪. ثم تم تحليل BAs المعزولة باستخدام كاشف Trizol للعزل المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين. بعد عزل الحمض النووي الريبي ، تم استخدام المرحلة العضوية من المحللة لاستخراج البروتين. أظهرت بياناتنا أن محلول يوديكسانول 6٪ يثري BAs بكفاءة دون التدخل في دراسات التعبير الجيني والبروتيني المتابعة. عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) هو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة. بالمقارنة مع الأنسجة الدهنية البنية ، كان لدى BAs المعزولة تعبير أعلى بكثير عن Pdgfa. باختصار ، توفر هذه الطريقة الجديدة منصة لدراسة بيولوجيا الخلايا الشحمية البنية على مستوى خلية واحدة.
Introduction
لدى كل من الفئران والبشر نوعان من الأنسجة الدهنية: الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT)1. يخزن WAT الطاقة في شكل دهون ثلاثية في الخلايا الشحمية البيضاء ، وتبدد الخلايا الشحمية البنية (BAs) من BAT الطاقة الكيميائية كحرارة2. بناء على أصلها التنموي ، يتم تصنيف BAs بشكل أكبر إلى BAs الكلاسيكية (cBAs) التي تشكلت أثناء نمو الجنين والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة من BAs (خلايا بيج / برايت ، محولة من الخلايا الشحمية البيضاء في ظل ظروف الإجهاد)3. بتكون متعددة العينات، وتعبر عن البروتين الحراري الذي يفصل البروتين 1 (UCP1)4. يعد مستودع BAT بين الكتفين (iBAT) أحد مستودعات cBAs الأولية في الثدييات الصغيرة5 ، بينما تنتشر الخلايا البيج داخل WAT6.
نظرا لطبيعتها في تبديد الطاقة ، حظيت BAs باهتمام كبير كهدف علاجي للحد من السمنة7. لاستغلال BAs لغرض علاج السمنة ، من الضروري فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في وظيفة BAs وبقائها وتجنيدها. الأنسجة الدهنية بما في ذلك BAT و WAT غير متجانسة. باستثناء الخلايا الشحمية ، تحتوي الأنسجة الدهنية على العديد من أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة والبلاعم8. على الرغم من توفر الأدوات الجينية لاستنفاد الجينات المرشحة على وجه التحديد في الفئران BAs ، مثل UCP1::Cre line9 ، فإن تقنيات تنقية BAs من BAT أو WAT محدودة ، مما يجعل من الصعب دراسة BAs على مستوى نوع الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، بدون الحصول على BAs خالصة ، لن يتم تحديد العلاقة بين BAs وغير BAs بوضوح. على سبيل المثال ، تم استخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα) كعلامة لخلايا اللحمة المتوسطة غير المتمايزة ، ويتم التعبير عنها في الخلايا البطانية والخلالية ل BAT. في BAT المجهدة الباردة ، تؤدي الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα إلى ظهور BAs10 جديدة. يتم تنشيط PDGFRα بواسطة ليجند PDGF ، وهو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة11 ؛ ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما إذا كانت BAs تؤثر على سلوك الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα عن طريق إفراز PDGF.
في الآونة الأخيرة ، تم نشر بروتوكول عزل BAs ، والذي يعتمد على فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)12. في هذا البروتوكول ، تم استخدام محلول ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 3٪ لفصل BAs عن غير BAs ، وتم تنقية BAs المخصبة بواسطة FACS. وتطبيق هذا البروتوكول مقيد بمقتضيات عملية نظام مراقبة الأصول الميدانية، التي تعتمد على كل من المعدات وخبرات تشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول جديد لعزل BAs من BAT. يمكن استخدام BAs المعزولة بواسطة هذا البروتوكول مباشرة لدراسات التعبير الجيني والبروتيني. علاوة على ذلك ، تشير البيانات المستقاة من هذه الدراسة إلى أن BAs هي مورد PDGF رئيسي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.
في بروتوكول عزل BAs المنشور ، تم استخدام محلول BSA بنسبة 3٪ لإثراء BAs12. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام BAs المخصبة التي حققها هذا البروتوكول المنشور مباشرة لتحليل تعبير البروتين. وذلك لأن BSA الم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم Z. Lin من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL138454-01 وصناديق معهد البحوث الطبية الماسونية.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
