Summary
تصف هذه الدراسة طريقة جديدة لعزل الخلايا الشحمية البنية للفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.
Abstract
الأنسجة الدهنية البنية (BAT) هي المسؤولة عن توليد الحرارة غير المرتعش في الثدييات ، والخلايا الشحمية البنية (BAs) هي الوحدات الوظيفية ل BAT. بتحتوي هذه القطيرات على قطرات ليبيدات متعددة الأعراق وميتوكوندريا وفيرة، وتعبر عن فصل البروتين 1 (UCP1). يتم تصنيف BAs إلى نوعين فرعيين بناء على أصلها: BAs الكلاسيكية المشتقة من الجنين (cBAs) والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة BAs. نظرا لكثافتها المنخفضة نسبيا ، لا يمكن عزل BAs عن BAT بطريقة الطرد المركزي التقليدية. في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs من الفئران لتحليل التعبير الجيني والبروتيني. في هذا البروتوكول ، تم هضم BAT بين الكتفين من الفئران البالغة بمحلول Collagenase و Dispase ، وتم إثراء BAs المنفصلة بمحلول يوديكسانول 6٪. ثم تم تحليل BAs المعزولة باستخدام كاشف Trizol للعزل المتزامن للحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين. بعد عزل الحمض النووي الريبي ، تم استخدام المرحلة العضوية من المحللة لاستخراج البروتين. أظهرت بياناتنا أن محلول يوديكسانول 6٪ يثري BAs بكفاءة دون التدخل في دراسات التعبير الجيني والبروتيني المتابعة. عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) هو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة. بالمقارنة مع الأنسجة الدهنية البنية ، كان لدى BAs المعزولة تعبير أعلى بكثير عن Pdgfa. باختصار ، توفر هذه الطريقة الجديدة منصة لدراسة بيولوجيا الخلايا الشحمية البنية على مستوى خلية واحدة.
Introduction
لدى كل من الفئران والبشر نوعان من الأنسجة الدهنية: الأنسجة الدهنية البيضاء (WAT) والأنسجة الدهنية البنية (BAT)1. يخزن WAT الطاقة في شكل دهون ثلاثية في الخلايا الشحمية البيضاء ، وتبدد الخلايا الشحمية البنية (BAs) من BAT الطاقة الكيميائية كحرارة2. بناء على أصلها التنموي ، يتم تصنيف BAs بشكل أكبر إلى BAs الكلاسيكية (cBAs) التي تشكلت أثناء نمو الجنين والخلايا الشحمية البيضاء المشتقة من BAs (خلايا بيج / برايت ، محولة من الخلايا الشحمية البيضاء في ظل ظروف الإجهاد)3. بتكون متعددة العينات، وتعبر عن البروتين الحراري الذي يفصل البروتين 1 (UCP1)4. يعد مستودع BAT بين الكتفين (iBAT) أحد مستودعات cBAs الأولية في الثدييات الصغيرة5 ، بينما تنتشر الخلايا البيج داخل WAT6.
نظرا لطبيعتها في تبديد الطاقة ، حظيت BAs باهتمام كبير كهدف علاجي للحد من السمنة7. لاستغلال BAs لغرض علاج السمنة ، من الضروري فهم الآليات الجزيئية التي تتحكم في وظيفة BAs وبقائها وتجنيدها. الأنسجة الدهنية بما في ذلك BAT و WAT غير متجانسة. باستثناء الخلايا الشحمية ، تحتوي الأنسجة الدهنية على العديد من أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية والخلايا الجذعية الوسيطة والبلاعم8. على الرغم من توفر الأدوات الجينية لاستنفاد الجينات المرشحة على وجه التحديد في الفئران BAs ، مثل UCP1::Cre line9 ، فإن تقنيات تنقية BAs من BAT أو WAT محدودة ، مما يجعل من الصعب دراسة BAs على مستوى نوع الخلية الواحدة. بالإضافة إلى ذلك ، بدون الحصول على BAs خالصة ، لن يتم تحديد العلاقة بين BAs وغير BAs بوضوح. على سبيل المثال ، تم استخدام مستقبلات عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية ألفا (PDGFRα) كعلامة لخلايا اللحمة المتوسطة غير المتمايزة ، ويتم التعبير عنها في الخلايا البطانية والخلالية ل BAT. في BAT المجهدة الباردة ، تؤدي الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα إلى ظهور BAs10 جديدة. يتم تنشيط PDGFRα بواسطة ليجند PDGF ، وهو عامل نمو ينظم نمو وتكاثر خلايا اللحمة المتوسطة11 ؛ ومع ذلك ، فمن غير الواضح ما إذا كانت BAs تؤثر على سلوك الخلايا السلفية الإيجابية PDGFRα عن طريق إفراز PDGF.
في الآونة الأخيرة ، تم نشر بروتوكول عزل BAs ، والذي يعتمد على فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS)12. في هذا البروتوكول ، تم استخدام محلول ألبومين مصل البقر (BSA) بنسبة 3٪ لفصل BAs عن غير BAs ، وتم تنقية BAs المخصبة بواسطة FACS. وتطبيق هذا البروتوكول مقيد بمقتضيات عملية نظام مراقبة الأصول الميدانية، التي تعتمد على كل من المعدات وخبرات تشغيل نظام مراقبة الأصول الميدانية. في هذه الدراسة ، تم تطوير بروتوكول جديد لعزل BAs من BAT. يمكن استخدام BAs المعزولة بواسطة هذا البروتوكول مباشرة لدراسات التعبير الجيني والبروتيني. علاوة على ذلك ، تشير البيانات المستقاة من هذه الدراسة إلى أن BAs هي مورد PDGF رئيسي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحفاظ على جميع الفئران في ظروف خالية من مسببات الأمراض ، وتمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية للبحوث الطبية الماسونية (IACUC). UCP1::Cre9 و Rosa 26tdتم الإبلاغ عن خطوط الفئران13 سابقا. تم الاحتفاظ بجميع الفئران في درجة حرارة الغرفة مع دورة ضوء / مظلمة لمدة 12 ساعة.
1. تحضير المحاليل والأنسجة الدهنية البنية (BAT)
- تحضير محلول الهضم ومحلول الفصل في أنابيب طرد مركزي سعة 15 مل.
- 10 مل من محلول الهضم BAT: إلى 10 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) ، أضف 3.5 مجم / مل Dispase II و 1 مجم / مل كولاجيناز II و 10 مللي مول CaCl2 لعمل محلول هضم BAT.
- 10 مل من محلول يوديكسانول 12٪ (محلول فصل): امزج 1 مل من 10x PBS ، 2 مل من 60٪ يوديكسانول ، 0.01 مل من 1 M MgCl 2 ، 0.025 مل من 1 M KCl ، 0.1 مل من 0.2 M حمض إيثيلين ديامينيترايتيك (EDTA) و 6.865 مل من ddH2O للحصول على 12٪ يوديكسانول.
- القتل الرحيم فأر بالغ واحد مع جرعة زائدة من CO2 . باختصار ، املأ قفص الماوس بنسبة 100٪ CO2 بمعدل إزاحة 10-30٪ حجم قفص في الدقيقة. بعد 5 دقائق ، تأكد من الوفاة عن طريق التحقق من عدم وجود تنفس واضح.
- تشريح الحيوان وجمع الخفافيش بين الكتفين. قم بإزالة WAT وطبقات العضلات تحت مجهر ستيريو.
- للحصول على هضم كاف ، قم بتقطيع كل فص BAT إلى ~ 3 مم3 أجزاء وضعها في قارورة نظيفة سعة 50 مل مع قضيب تحريك معدني ومحلول هضم 5 مل. قبل البدء في الهضم ، دع القارورة التي تحتوي على BAT ومخزن الهضم يجلس على الجليد لمدة 1 ساعة.
ملاحظة: في الخطوات التالية ، تم استخدام حوالي 80 ملغ BAT لعزل الخلايا الشحمية البنية.
2. إجراء عزل BAs
- ضع القارورة على محرك مغناطيسي محاط بالحاضنة. اضبط سرعة التحريك على 60 دورة في الدقيقة ودرجة حرارة الحاضنة على 35 درجة مئوية على التوالي. سيستمر الهضم لمدة 30 دقيقة تقريبا. إذا شكلت شرائح BAT كتلا حول شريط التقليب أثناء الهضم ، فاستخدم طرف ماصة سعة 1 مل لتعطيل الأنسجة المجمعة.
- ضع مرشح مصفاة 70 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي نظيف سعة 50 مل. ماصة حوالي 4 مل تعليق الخلية من خلال مصفاة. اغسل المصفاة ب 4 مل من محلول يوديكسانول 12٪. ماصة لأعلى ولأسفل لخلط الخلايا ومحلول اليوديكسانول. انقل خليط الخلية إلى أنبوبي اختبار بوليسترين شفافين سعة 5 مل.
ملاحظة: في نهاية عملية الهضم ، يجب أن يكون محلول الهضم غائما ، مما يشير إلى الهضم الكافي. استخدم محلول الهضم الطازج في كل مرة. بمجرد التحضير ، يجب استخدام محلول الهضم في غضون 2 ساعة. - كرر الخطوتين 2.2 و 2.3 مرة أخرى إذا لم يكن الهضم كافيا.
- اترك أنابيب البوليسترين الشفافة التي تحتوي على محلول الفصل و BAs على الثلج لمدة 1 ساعة. ستشكل BAs طبقة في الأعلى.
- أخرج 20 ميكرولتر من BAs المعزولة لفحص المجهر.
3. عزل الحمض النووي الريبي والبروتين من BAs
- ماصة طبقة BAs في أنبوبين للطرد المركزي الدقيق سعة 1.7 مل لعزل الحمض النووي الريبي والبروتين. قم بإزالة محلول اليوديكسانول الزائد بعناية دون تعطيل طبقة BAs.
- أضف 1 مل تريزول لعزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) والحمض النووي (DNA) والبروتين في محلول الخلية في نفس الوقت. تخلط بما فيه الكفاية لتحلل الخلايا.
- أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لفصل المراحل.
- جهاز طرد مركزي للأنبوب لمدة 9,981 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- بعد الطرد المركزي ، استخدم المرحلة المائية لعزل الحمض النووي الريبي. في هذه الدراسة ، تم استخدام إجمالي الحمض النووي الريبي للنسخ العكسي ، وتم إجراء RT-PCR الكمي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. يتم سرد تسلسل التمهيدي في جدول المواد.
- نقل 300 ميكرولتر من المرحلة العضوية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل.
- إلى المرحلة العضوية ، أضف 2.5 حجم 100٪ إيثانول ودوامة لمدة 10 ثوان.
- أضف 200 ميكرولتر من 1-برومو-3-كلوروبروبان ودوامة لمدة 10 ثوان.
- أضف 600 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج والدوامة لمدة 10 ثوان.
- دع المحلول المختلط يقف لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- جهاز طرد مركزي عند 9,981 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. في هذه الخطوة ، سيتم فصل المراحل. يتم توطين مرحلة البروتين في الطبقة الوسطى.
- إزالة المحلول المائي العلوي. أضف 1 مل 100٪ إيثانول إلى المحلول المتبقي.
- جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق ، 9,981 × جم ، 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، سوف تتشكل حبيبات البروتين. تخلص من المادة الطافية.
- اغسل الحبيبات ب 1 مل 100٪ إيثانول.
- جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق ، 9981 × جم ، 4 درجات مئوية. احفظ الحبيبات وتخلص من المادة الطافية.
- جفف الحبيبات بالهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قياس وزن بيليه الرطب. أضف محلول SDS 1٪ بنسبة 20 ميكرولتر / ملغ بيليه.
- قم بإذابة الحبيبات عن طريق وضع الأنبوب في شاكر ساخن. اضبط درجة الحرارة على 55 درجة مئوية ، والسرعة على 11 × جم. عادة ما يستغرق 5-10 دقائق لإذابة حبيبات البروتين تماما.
ملاحظة: يمكن قياس تركيز البروتين المذاب بواسطة مقايسة BCA14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحضير BAT بين الكتفين لعزل الخلايا الشحمية البنية
يوضح الشكل 1 أ عملية عزل الخلايا الشحمية البنية. ستستغرق العملية برمتها ، من إعداد BAT وحلول الهضم / الفصل إلى الحصول على BAs المعزولة حوالي 4 ساعات.
في الفئران البالغة ، توجد BAT وفيرة في المنطقة بين الكتفين. يتم تغطية هذا BAT بين الكتفين (iBAT) بطبقات العضلات و WAT (الشكل 1B). قبل البدء في إجراء الهضم ، يجب إزالة طبقات العضلات و WAT للحصول على iBAT نظيف (الشكل 1C). في بروتوكول عزل BAs المنشور ، تم استخدام BAT المفروم لعزل BAs12. في هذه الدراسة ، أدى هضم 3 مم3 حجم BAT (الشكل 1D) إلى إنتاج BAs أكثر من BAT المفروم.
فصل BAs عن غير BAs مع حل BSA 3٪
بعد الهضم iBAT، اختلطت BAs المتفككة مع غير BAs في ناتج الهضم. نظرا لأن BAs تحتوي على قطرات دهنية ، فإن كثافتها أقل من غير BAs ؛ ومع ذلك ، فإن كثافة BAs ليست منخفضة بما يكفي للسماح لها بالطفو بكفاءة إلى قمة حل PBS العادي. تم استخدام PBS الذي يحتوي على 3٪ من ألبومين مصل الأبقار (BSA) لفصل BAs عن غير BAs12 ، والذي تم تكراره بنجاح في هذه الدراسة (الشكل 2A).
Rosa 26 tdTomato هو خط فأر مراسل ، والذي يعبر عن بروتين مضانtdTomato (tdTom ) القوي بعد إعادة التركيب بوساطة Cre13. Ucp1::Cre الفئران المعدلة وراثيا تعبر عن Cre recombinase في BAs9. Ucp1::تم عبور خط الماوس Cre مع فئران Rosa 26tdTomato لتسمية BAs وراثيا باستخدام tdTom (الشكل 2B). للتحقق من صحة إجراء عزل BAs ، تم فصل iBAT من Ucp1::Cre;tdTom/+ moice. كانت معظم الخلايا المخصبة في الطبقة العليا من محلول BSA على شكل توت العليق وتحتوي على قطرات دهنية متعددة العينات. علاوة على ذلك ، كانت معظم خلايا شكل التوت هذه إيجابية tdTom (الشكل 2C) ، مما يؤكد أنها كانت خلايا دهنية بنية.
فصل BAs عن غير BAs بمحلول يوديكسانول 6٪
3٪ محلول فصل BSA المخصب BAs. لم يكن من الواضح ما إذا كان يمكن استخدام هذه BAs المعزولة لتحليل التعبير الجيني والبروتيني. ثم تم استخراج الحمض النووي الريبي والبروتين من BAs المخصبة. تم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي بنجاح وفقا لإجراء عزل الحمض النووي الريبي القياسي. ومع ذلك ، فإن بروتوكول عزل بروتين Trizol القياسي ، المعروف أيضا باسم طريقة Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (طريقة GTPC) ، لم يعمل بشكل جيد ، والذي كان مملا وله عائد بروتين منخفض للغاية. لذلك ، تم اعتماد طريقة عزل البروتين المحسنة لاستخراج البروتين من BAs المحللة ب Trizol.
في بروتوكول GTPC المحسن هذا ، تم استخدام الإيثانول وبرومو كلورو بروبان والماء لاستخراج البروتين من المرحلةالعضوية 15. بعد إضافة الإيثانول والبرومو كلوروبروبان والماء إلى الطور العضوي ، وبعد الطرد المركزي ، تشكلت حبيبات البروتين بين الطور المائي والمرحلة العضوية (الشكل 3 أ). ثم تم غسل حبيبات البروتين بالإيثانول بنسبة 100٪ وإذابتها في 1٪ SDS. تم استخدام طريقة GTPC المحسنة هذه لاستخراج البروتين من BAs المخصبة بمحلول iBAT و BSA. على الرغم من أن حبيبات البروتين BAT تم إذابتها بسهولة في 1٪ SDS, الجزء الأكبر من حبيبات البروتين المعزولة BAs لم يكن قابلا للذوبان. ثم تم فحص البروتين المذاب باستخدام هلام SDS-PAGE. كما هو موضح في هلام SDS-PAGE الملون باللون الأزرق Coomassie (الشكل 3B) ، كان هناك نطاق بروتين ضخم يبلغ حوالي 60 كيلو دالتون في BAs المعزولة ولكن ليس في عينات BAT. نظرا لأن الوزن الجزيئي ل BSA هو 66 كيلو دالتون ، ويوجد BSA وفير في محلول فصل BAs ، يجب أن يكون نطاق البروتين المهيمن هذا هو BSA. تشير هذه البيانات إلى أن BSA من محلول فصل BAs يتداخل مع استخراج البروتين.
Iodixanol هو وسط تدرج غير أيوني ومتساوي التناضح16 تم استخدامه على نطاق واسع للخلية 17 وتنقية الفيروسات المرتبطة بالغدي (AAV)18. لتجنب تداخل BSA لدراسات تعبير البروتين ، تم استخدام اليوديكسانول ليحل محل BSA في محلول فصل BAs جديد. 3٪ محلول BSA له كثافة 1.03 ، وهو مشابه ل 6٪ يوديكسانول. في محلول يوديكسانول 6٪ ، طفت BAs إلى الأعلى في 30-60 دقيقة (الشكل 3C). أظهرت BAs المعزولة بهذا المحلول شكل توت العليق النموذجي واحتوت على قطرات دهنية متعددة الأعراق (الشكل 3D). تم فصل البروتينات المستخرجة من هذه BAs المعزولة بشكل جيد في هلام SDS-PAGE (الشكل 3E).
للتحقق مما إذا كان محلول اليوديكسانول 6٪ يفصل BAs بكفاءة عن غير BAs ، قمنا بتسمية BAs وراثيا باستخدام tdTom وفحصنا الخلايا الموجودة في محلول يوديكسانول 6٪ الواضح. بعد فصل BAs عن غير BAs (الخطوة 2.4) ، تم تخفيف محلول يوديكسانول 6٪ أسفل طبقة BAs 6 مرات باستخدام PBS ثم تم طرده بالطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، تم تشكيل حبيبات صغيرة من الخلايا الحمراء في القاع ، والتي قد تكون خلايا كسر الأوعية الدموية اللحمية. كما هو موضح في الشكل 3 ، كانت الخلايا من طبقة BAs عبارة عن خلايا موجبة tdTom (الشكل 3F) ؛ ومع ذلك ، كانت الخلايا المستعادة من الحبيبات سلبية tdTom (الشكل 3G). بالإضافة إلى ذلك ، لم تكن قطرات الدهون واضحة مرئية في الخلايا السلبية tdTom. تشير هذه البيانات إلى أن بروتوكولنا الجديد يمكنه فصل BAs بكفاءة عن الخلايا غير الدهنية.
معا ، توضح هذه البيانات أن عزل BAs بمحلول BSA بنسبة 3٪ يتداخل مع متابعة دراسات الكيمياء الحيوية وتشير إلى أن محلول iodixanol بنسبة 6٪ أفضل من محلول BSA بنسبة 3٪ لعزل BAs.
تحليل التعبير الجيني والبروتيني باستخدام BAs المعزولة.
للتحقق من صحة إجراء عزل BAs الجديد هذا على المستوى الجزيئي ، تمت مقارنة التعبير عن ثلاثة جينات بين BAT و BAs المعزولة: Ucp1 و Pdgfa و Pdgfra. في BAT ، يتم التعبير عن Pdgfra في الخلايا البطانية والخلايا الخلالية ، والخلايا الإيجابية PDGFRα هي خلايا سلفية مفترضة10. كانت مستويات mRNA ل Ucp1 و Pdgfa أعلى بكثير في BAs المعزولة منها في BAT (الشكل 4A ، B). على العكس من ذلك ، تم اكتشاف mRNA ل Pdgfra فقط في BAT (الشكل 4B).
PPARγ هو عامل نسخ يتحكم في نمو الأنسجة الدهنية ، UCP1 هو بروتين الميتوكوندريا ، و PDGFRα هو بروتين مستقبلات الغشاء. تمثل هذه البروتينات الثلاثة بروتينات موزعة في مقصورات خلوية مختلفة. تم إجراء البقع الغربية لاختبار ما إذا كان البروتين المستخرج من BAs المحللة Trizol و BAT مناسبا لتحليل تعبير البروتين. تم الكشف عن UCP1 و PPARγ في كل من BAs و BAT (الشكل 4C ، D) ، مما يؤكد أن البروتين الكلي المعزول من BAs أو BAT المحللة Trizol مناسب للطخة الغربية. علاوة على ذلك ، تمشيا مع نتائج qRT-PCR ، تم إثراء بروتين UCP1 في BAs (الشكل 4C) ؛ في حين تم اكتشاف PDGFRα فقط في BAT ولكن ليس في BAs النقية (الشكل 4D). باختصار ، توضح هذه البيانات أن طريقة عزل BAs الجديدة الخاصة بنا فعالة وتشير إلى أن BAs المخصبة بهذه الطريقة يمكن استخدامها مباشرة لدراسات التعبير الجيني والبروتيني.
الشكل 1: تحضير iBAT لعزل الخلايا الشحمية البنية. (أ) سير عمل إجراء عزل الخلايا الشحمية البنية. (ب) منظر بطني للنسيج بين الكتفين الذي يحتوي على BAT و WAT وطبقات العضلات. (ج) أفضل التقنيات المتاحة بين الكتفين (iBAT). تمت إزالة طبقات العضلات و WAT المجاورة ل iBAT. د: صورة تمثيلية لقطع iBAT المستخدمة لعزل الخلايا الشحمية البنية. B-D ، شريط المقياس = 5 مم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: فصل الخلايا الشحمية البنية عن محلول الهضم. أ: صور الخلايا الشحمية البنية المتفككة قبل الانفصال وبعده. تم استخدام محلول BSA بنسبة 3٪ لفصل الخلايا الشحمية البنية عن الخلايا الشحمية غير البنية. شريط المقياس = 1 سم. (ب) عرض تخطيطي للخلايا الشحمية البنية ذات العلامات الجينية مع بروتين مضان الطماطم td. ج: صور الخلايا الشحمية البنية المعزولة. مدينة دبي للإنترنت ، تباين التداخل التفاضلي. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: استخلاص البروتين الكلي من الخلايا الشحمية البنية المحللة. أ: فصل طور البروتين عن الطور العضوي. (ب) تلطيخ كوماسي لجل SDS-PAGE. تم استخراج البروتين الكلي من BAT أو 3٪ محلول BSA الخلايا الشحمية البنية المنقاة. تمت الإشارة إلى شريط بروتين BSA بسهم. (ج) تتكون طبقة الخلايا الشحمية البنية فوق محلول يوديكسانول 6٪. شريط المقياس = 1 سم. (د) الخلايا الشحمية البنية المعزولة بمحلول يوديكسانول 6٪. تمت الإشارة إلى الخلايا الشحمية البنية بواسطة الأسهم الصفراء. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. (ه) تلطيخ كوماسي لجل SDS-PAGE. تم استخراج البروتين الكلي من BAT أو 6٪ محلول يوديكسانول المخصب BAs. (F) صور tdTom المسمى الخلايا الشحمية البنية. (ز) صور للخلايا المستعادة من محلول اليوديكسانول أسفل طبقة BAs. F و G ، شريط المقياس = 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تحليل التعبير الجيني والبروتيني للخلايا الشحمية البنية المعزولة. تم استخدام الخلايا الشحمية البنية المعزولة بطريقة اليوديكسانول في دراسات التعبير الجيني والبروتيني هذه. (أ ، ب) قياس qRT-PCR للتعبير الجيني. تم تطبيع مستويات mRNA إلى 36B4. ن = 3. اختبار الطالب t ، * ، P<0.01 ؛ **، ص<0.01. (ج) النشاف الغربي ل PPARγ و UCP1. (د) النشاف الغربي ل PDGFRα. C و D ، تم استخدام غشاء Ponceau S الملون كتحكم في التحميل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، تم تطوير طريقة جديدة لعزل BAs لتحليل التعبير الجيني والبروتيني.
في بروتوكول عزل BAs المنشور ، تم استخدام محلول BSA بنسبة 3٪ لإثراء BAs12. ومع ذلك ، لا يمكن استخدام BAs المخصبة التي حققها هذا البروتوكول المنشور مباشرة لتحليل تعبير البروتين. وذلك لأن BSA المركز الموجود في محلول BAs يتداخل مع متابعة استخراج البروتين. عندما تمت معالجة BAs المخصبة في محلول BSA بنسبة 3٪ بكاشف Trizol ، تتشكل مجاميع البروتين اللزجة ، ومعظمها غير قابل للذوبان في عملية استخراج البروتين GTPC. بالإضافة إلى ذلك ، في منتج استخراج البروتين GTPC ، كان معظم البروتين BSA (الشكل 3B). في هذا البروتوكول الجديد ، تم استبدال محلول فصل BSA بنسبة 6٪ ب 6٪ يوديكسانول لتنقية BAs. 6٪ محلول يوديكسانول فصل بكفاءة BAs عن غير BAs ، وحافظت BAs المعزولة على مورفولوجيا (الشكل 3D). متفوقة على محلول BSA 3٪ ، 6٪ محلول يوديكسانول لم يتداخل مع استخراج البروتين ، وكان البروتين المستخرج مناسبا لتحليل اللطخة الغربية (الشكل 4C ، D).
تحتوي الأنسجة الدهنية على كمية كبيرة من الدهون ، وتلوث الدهون في عينات البروتين المستخرجة يعيق قياس تركيز البروتين. في الآونة الأخيرة ، تم نشر بروتوكول لإزالة الدهون من استخراج البروتين. في هذا البروتوكول ، هناك حاجة إلى سلسلة من أجهزة الطرد المركزي ذات درجة الحرارة المنخفضة ، وهي مملة وتحتاج إلى كمية كبيرة من مواد البدء19. في الدراسة الحالية ، تم اعتماد طريقة GTPCمحسنة 15 لعزل البروتين من BAT. يختلف عن بروتوكول GTPC الكلاسيكي ، استخدم بروتوكول GTPC المحسن هذا الإيثانول وبرومو كلوروبروبان والماء لاستخراج البروتين من المرحلة العضوية. أظهرت بياناتنا أن البروتين المعزول باستخدام طريقة GTPC المحسنة هذه كان متوافقا مع قياس تركيز البروتين القائم على مقايسة حمض البيسينتشونينيك (BCA).
في بروتوكول عزل BAs الحالي ، قبل بدء عملية تفكك الإنزيم ، تم وضع خليط محلول BAT والهضم على الثلج لمدة ساعة واحدة. الغرض من هذا الإجراء هو تقليل استقلاب الخلية ومعدل التعبير الجيني20 ، وكذلك السماح لإنزيمات الهضم بالتخلل بكفاءة في الأنسجة الدهنية البنية.
تهدف الدراسة الحالية إلى تطوير طريقة مضيئة لعزل الخلايا الأديوبوكية البنية من BAT بين الكتفين لدراسة التعبير الجيني. ومع ذلك ، قد يوجد تلوث الخلايا الشحمية البيضاء في BAs المعزولة. وذلك لأن BAT بين الكتفين يتم توصيله أحيانا بواسطة أنسجة دهنية بيضاء ، والتي لا يمكن إزالتها بالكامل أثناء خطوة تحضير BAT. لا يمكن للبروتوكول الحالي فصل BAs عن WAs بناء على كثافة الخلية. لذلك ، إذا كانت درجة النقاء العالية جدا ضرورية ، فيجب فرز BAs المعزولة بواسطة FACS قبل تحليلها.
يحتوي BAT بين الكتفين (iBAT) على BAs كلاسيكية وفيرة مشتقة من سلالة خلية Myf5 أثناء التطور الجنيني21. هنا تم استخدام iBAT كمثال لعزل BAs. على غرار البروتوكولالمنشور 12 ، يمكن أيضا استخدام طريقتنا لعزل الخلايا البيج عن WAT. ومع ذلك ، للحصول على خلايا بيج نقية من WAT ، يجب تسمية الخلايا البيج ببروتين مضان وإثرائها بواسطة FACS. وفقا لبروتوكولنا الحالي ، يمكن استخدام الخلايا البيج المخصبة FACS لكل من تحليل التعبير الجيني والبروتيني ، مما سيحسن بشكل كبير من كفاءة استخدام المواد البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
اي
Acknowledgments
تم دعم Z. Lin من قبل المعاهد الوطنية للصحة HL138454-01 وصناديق معهد البحوث الطبية الماسونية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
