Summary
Denne undersøgelse beskriver en ny metode til isolering af murinbrune adipocytter til gen- og proteinekspressionsanalyse.
Abstract
Brunt fedtvæv (BAT) er ansvarlig for ikke-rystende termogenese hos pattedyr, og brune adipocytter (BA'er) er de funktionelle enheder af BAT. BA'er indeholder både multilokulære lipiddråber og rigelige mitokondrier, og de udtrykker afkobling af protein 1 (UCP1). BA'er er kategoriseret i to undertyper baseret på deres oprindelse: embryoafledte klassiske BA'er (cBA'er) og hvide adipocytter afledte BA'er. På grund af deres relativt lave densitet kan BA'er ikke isoleres fra BAT med traditionel centrifugeringsmetode. I denne undersøgelse blev der udviklet en ny metode til at isolere BA'er fra mus til gen- og proteinekspressionsanalyse. I denne protokol blev interscapular BAT fra voksne mus fordøjet med Collagenase og Dispase-opløsning, og de dissocierede BA'er blev beriget med 6% iodixanolopløsning. Isolerede BA'er blev derefter lyset med Trizol-reagens til samtidig isolering af RNA, DNA og protein. Efter RNA-isolering blev den organiske fase af lysatet anvendt til proteinekstraktion. Vores data viste, at 6% iodixanolopløsning effektivt berigede BA'er uden at forstyrre opfølgende gen- og proteinekspressionsundersøgelser. Trombocytafledt vækstfaktor (PDGF) er en vækstfaktor, der regulerer vækst og spredning af mesenkymale celler. Sammenlignet med det brune fedtvæv havde isolerede BA'er signifikant højere ekspression af Pdgfa. Sammenfattende giver denne nye metode en platform til at studere biologien af brune adipocytter på et enkelt celletypeniveau.
Introduction
Både mus og mennesker har to typer fedtvæv: hvidt fedtvæv (WAT) og brunt fedtvæv (BAT)1. WAT lagrer energi i form af triglycerider i hvide adipocytter, og de brune adipocytter (BA'er) af BAT spreder kemisk energi som varme2. Baseret på deres udviklingsmæssige oprindelse kategoriseres BA'er yderligere i klassiske BA'er (cBA'er), der dannes under embryoudvikling og hvide adipocytter afledte BA'er (beige / britceller, omdannet fra hvide adipocytter under stressforhold)3. BA'er er multilokulære og udtrykker det termogeniske proteinafkoblingsprotein 1 (UCP1)4. Interscapular BAT (iBAT) depot er et af de primære cBAs depoter i små pattedyr5, mens beige celler er spredt inden for WAT6.
På grund af deres karakter af at sprede energi har BA'er fået meget opmærksomhed som et terapeutisk mål for reduktion af fedme7. For at udnytte BA'er med det formål at behandle fedme er det vigtigt at forstå de molekylære mekanismer, der styrer BAs funktion, overlevelse og rekruttering. Fedtvæv, herunder BAT og WAT, er heterogene. Bortset fra adipocytter indeholder fedtvæv mange andre celletyper, såsom endotelceller, mesenkymale stamceller og makrofager8. Selvom genetiske værktøjer til specifikt at nedbryde kandidatgener i mus BA'er er tilgængelige, såsom UCP1::Cre linje9, er teknikker til rensning af BA'er fra BAT eller WAT begrænsede, hvilket gør det svært at studere BA'er på enkeltcelletypeniveau. Uden at opnå rene BA'er vil forholdet mellem BA'er og ikke-BA'er desuden ikke være klart afgrænset. For eksempel er blodpladeafledt vækstfaktorreceptor alfa (PDGFRα) blevet brugt som markør for udifferentierede mesenkymale celler, og det udtrykkes i endotel- og interstitielle celler i BAT. I koldstresset BAT giver PDGFRα-positive stamceller anledning til nye BA'er10. PDGFRα aktiveres af dets ligand PDGF, en vækstfaktor, der regulerer vækst og spredning af mesenkymale celler11; Det er imidlertid uklart, om BA'er påvirker adfærden af PDGFRα-positive stamceller ved at udskille PDGF.
For nylig er der offentliggjort en BAs-isolationsprotokol, som er baseret på fluorescensaktiveret cellesortering (FACS)12. I denne protokol blev 3% bovin serumalbumin (BSA) opløsning anvendt til at adskille BA'er fra ikke-BA'er, og de berigede BA'er blev yderligere renset af FACS. Anvendelsen af denne protokol er begrænset af kravet om FACS-proces, som er afhængig af både udstyr og FACS-driftserfaringer. I denne undersøgelse blev der udviklet en ny protokol til isolering af BA'er fra BAT. De BA'er, der er isoleret af denne protokol, kan anvendes direkte til gen- og proteinekspressionsundersøgelser. Desuden tyder data fra denne undersøgelse på, at BA'er er en vigtig PDGF-ressource.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev opretholdt under patogenfrie forhold, og alle procedurer blev godkendt af Masonic Medical Research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 og Rosa 26tdTomato mus linjer13 blev rapporteret tidligere. Alle mus blev holdt ved stuetemperatur med en 12 timers lys / mørk cyklus.
1. Forberedelse af opløsninger og brunt fedtvæv (BAT)
- Fordøjelsesopløsning og separationsopløsning fremstilles i 15 ml centrifugerør.
- 10 ml BAT-fordøjelsesopløsning: Til 10 ml sterilt fosfatbufferet saltvand (PBS) tilsættes 3,5 mg/ml Dispase II, 1 mg/ml Collagenase II og 10 mM CaCl2 for at fremstille BAT-fordøjelsesopløsning.
- 10 ml 12% iodixanolopløsning (separationsopløsning): Bland 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% iodixanol, 0,01 ml 1 M MgCl 2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml 0,2 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) og 6,865 ml ddH2 O for at opnå 12% iodixanol.
- Afliv en voksen mus med CO2 -overdosis. Fyld kort museburet med 100% CO2 ved en forskydningshastighed på 10-30% burvolumen pr. min. 5 minutter senere, bekræft døden ved at kontrollere, om der ikke er synlig vejrtrækning.
- Disseker dyret og saml interscapular BAT. Fjern WAT og muskellag under et stereomikroskop.
- For at få tilstrækkelig fordøjelse skæres hver BAT-lap i ~ 3 mm3 dele og placeres i en ren 50 ml kolbe med en metalrørestang og 5 ml fordøjelsesopløsning. Før fordøjelsen påbegyndes, skal kolben indeholdende BAT og fordøjelsesbuffer sidde på is i 1 time.
BEMÆRK: I de følgende trin, omkring 80 mg BAT blev brugt til brun adipocytter isolering.
2. BAs isolationsprocedure
- Kolben anbringes på en magnetisk omrører, der er lukket i en inkubator. Omrøringshastigheden indstilles til henholdsvis 60 o / min og inkubatorens temperatur til 35 °C. Fordøjelsen varer i ca. 30 min. Hvis BAT-skiverne danner klumper omkring omrørerstangen under fordøjelsen, skal du bruge en 1 ml pipettespids til at forstyrre det aggregerede væv.
- Placer et 70 μm silfilter oven på et rent 50 ml centrifugerør. Pipette omkring 4 ml cellesuspension gennem silen. Vask silen med 4 ml 12% iodixanolopløsning. Pipette op og ned for at blande cellerne og iodixanolopløsningen. Overfør celleblandingen til to klare 5 ml polystyrenreagensglas.
BEMÆRK: Ved afslutningen af fordøjelsen skal fordøjelsesopløsningen være overskyet, hvilket indikerer tilstrækkelig fordøjelse. Brug frisk fordøjelsesopløsning hver gang. Når fordøjelsesopløsningen er tilberedt, skal den anvendes inden for 2 timer. - Gentag trin 2.2 og 2.3 igen, hvis fordøjelsen ikke er tilstrækkelig.
- Lad de klare polystyrenrør, der indeholder separationsopløsningen og BA'erne, stå på is i 1 time. BA'erne danner et lag på toppen.
- Tag 20 μL af de isolerede BA'er ud til mikroskopundersøgelse.
3. RNA- og proteinisolering fra BA'er
- Pipetter BAs-laget i to 1,7 ml mikrocentrifugerør til RNA- og proteinisolering. Fjern forsigtigt den overdrevne iodixanolopløsning uden at forstyrre BAs-laget.
- Tilsæt 1 ml Trizol for samtidig at isolere RNA, DNA og protein i celleopløsningen. Bland tilstrækkeligt til at lyse cellerne.
- Tilsæt 200 μL chloroform for at adskille faserne.
- Røret centrifugeres i 9,981 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Efter centrifugering anvendes den vandige fase til RNA-isolering. I denne undersøgelse blev total RNA anvendt til omvendt transkription, og kvantitativ RT-PCR blev udført med Real-Time PCR. Primersekvenser er angivet i Materialetabel.
- Overfør 300 μL af den organiske fase til et 2 ml mikrocentrifugerør.
- Til den organiske fase tilsættes 2,5 volumen 100% ethanol og hvirvel i 10 s.
- Tilsæt 200 μL 1-Brom-3-chlorpropan og hvirvel i 10 s.
- Tilsæt 600 μL dobbeltdestilleret vand og hvirvel i 10 s.
- Lad den blandede opløsning stå i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Centrifuge ved 9,981 x g i 10 minutter ved 4 °C. På dette trin adskilles faserne. Proteinfasen er lokaliseret i mellemlaget.
- Fjern den øverste vandige opløsning. Tilsæt 1 ml 100% ethanol i den resterende opløsning.
- Centrifuge i 10 min, 9.981 x g, 4 °C. Efter centrifugering dannes proteinpillen. Kassér supernatanten.
- Vask pelleten med 1 ml 100% ethanol.
- Centrifuge i 10 min, 9981 x g, 4 °C. Gem pelleten og kassér supernatanten.
- Lufttør pelleten i 10 min ved stuetemperatur.
- Mål vægten af den våde pille. Der tilsættes 1% SDS-opløsning i et forhold på 20 μL/mg pellet.
- Opløs pelleten ved at sætte røret i en opvarmet ryster. Temperaturen indstilles til 55 °C og hastigheden til 11 x g. Det tager normalt 5-10 min at opløse proteinpillen helt.
BEMÆRK: Koncentrationen af det opløste protein kan måles ved BCA-assay14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Forberedelse af interacapular BAT til isolering af brune adipocytter
Den brune adipocytter (BA'er) isolationsproces er afbildet i figur 1A. Hele processen, fra fremstilling af BAT og fordøjelses- / separationsopløsninger til opnåelse af isolerede BA'er, vil tage omkring 4 timer.
Hos voksne mus findes der rigelig BAT i det interscapulære område. Denne interscapular BAT (iBAT) er dækket af muskellag og WAT (figur 1B). Før fordøjelsesproceduren påbegyndes, skal muskellagene og WAT fjernes for at give ren iBAT (figur 1C). I en offentliggjort BAs-isolationsprotokol blev hakket BAT brugt til BAs isolation12. I denne undersøgelse gav fordøjelsen af 3 mm3 størrelse BAT (figur 1D) flere BA'er end hakket BAT.
Adskillelse af BA'er fra ikke-BA'er med 3% BSA-opløsning
Efter iBAT-fordøjelsen blev dissocierede BA'er blandet med ikke-BA'er i fordøjelsesproduktet. Fordi BA'er indeholder lipiddråber, er deres densitet lavere end ikke-BA'er; BAs densitet er dog ikke lav nok til at lade dem effektivt flyde til toppen af en almindelig PBS-opløsning. PBS indeholdende 3% bovin serumalbumin (BSA) er blevet anvendt til at adskille BA'er fra ikke-BA'er12, hvilket blev gentaget med succes i denne undersøgelse (figur 2A).
Rosa 26tdTomato er en reporter muselinje, der udtrykker stærkt tdTomato (tdTom) fluorescensprotein efter Cre-medieret rekombination13. Ucp1::Cre transgene mus udtrykker Cre rekombinase i BA'erne9. Ucp1::Cre muselinjen blev krydset med Rosa 26tdTomato mus for genetisk at mærke BA'er med tdTom (figur 2B). Til validering af BAs isolationsprocedure blev iBAT fra Ucp1::Cre;tdTom/+ mus dissocieret. De fleste af cellerne beriget i det øverste lag af BSA-opløsning var hindbærform og indeholdt multilokulære lipiddråber. Desuden var de fleste af disse hindbærformede celler tdTom-positive (figur 2C), hvilket bekræfter, at de var brune adipocytter.
Adskillelse af BA'er fra ikke-BA'er med 6% iodixanolopløsning
3% BSA-separationsopløsning berigede BA'er. Det var uklart, om disse isolerede BA'er kunne bruges til gen- og proteinekspressionsanalyse. RNA og protein blev derefter ekstraheret fra de berigede BA'er. RNA-ekstraktion blev udført med succes i henhold til standard RNA-isolationsproceduren. Standard Trizol-proteinisoleringsprotokollen, også kendt som Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-metoden (GTPC-metode), fungerede imidlertid ikke godt, hvilket var kedeligt og havde meget lavt proteinudbytte. Derfor blev en forbedret proteinisoleringsmetode vedtaget for at ekstrahere protein fra Trizol-lyserede BA'er.
I denne forbedrede GTPC-protokol blev ethanol, brom-chlorpropan og vand brugt til ekstraktion af protein fra den organiske fase15. Efter tilsætning af ethanol, brom-chlorpropan og vand i den organiske fase og efter centrifugering dannedes proteinpellet mellem den vandige fase og den organiske fase (figur 3A). Proteinpellet blev derefter vasket med 100% ethanol og opløst i 1% SDS. Denne forbedrede GTPC-metode blev brugt til at ekstrahere protein fra iBAT- og BSA-opløsningsberigede BA'er. Selvom BAT-proteinpillen let blev opløst i 1% SDS, var størstedelen af de isolerede BA'er proteinpellet ikke opløselige. Derefter blev det opløste protein undersøgt med SDS-PAGE gel. Som vist i en Coomassie blåfarvet SDS-PAGE gel (figur 3B) var et massivt proteinbånd omkring 60 kDa til stede i de isolerede BA'er, men ikke i BAT-prøverne. Fordi molekylvægten af BSA er 66 kDa, og der findes rigelig BSA i BAs separationsopløsning, bør dette dominerende proteinbånd være BSA. Disse data tyder på, at BSA fra BAs separationsopløsning interfererer med proteinekstraktion.
Iodixanol er et nonionisk og iso-osmotisk gradientmedium16 , der har været meget udbredt til celle17 og adeno-associeret virus (AAV) oprensning18. For at undgå BSA-interferens fra proteinekspressionsundersøgelser blev iodixanol anvendt til at erstatte BSA i en ny BA-separationsopløsning. 3% BSA-opløsning har en densitet på 1,03, hvilket svarer til 6% iodixanol. I 6% iodixanolopløsning flød BA'er til toppen på 30-60 minutter (figur 3C). BA'erne isoleret med denne opløsning viste typisk hindbærform og indeholdt multilokulære lipiddråber (figur 3D). Proteiner ekstraheret fra disse isolerede BA'er blev pænt adskilt i SDS-PAGE gel (figur 3E).
For at kontrollere, om 6% iodixanolopløsningen effektivt adskilte BA'er fra ikke-BA'er, mærkede vi genetisk BA'erne med tdTom og undersøgte cellerne, der var bosiddende i den klare 6% iodixanolopløsning. Efter adskillelse af BA'erne fra ikke-BA'er (trin 2.4) blev 6% iodixanolopløsningen under BAs-laget fortyndet 6 gange med PBS og blev derefter centrifugeret ved 600 x g i 5 min. Efter centrifugering blev der dannet en lille rødcellepellet på bunden, som kan være stromale vaskulære fraktionsceller. Som vist i figur 3 var celler fra BAs-laget tdTom-positive celler (figur 3F); celler, der blev genvundet fra pelleten, var imidlertid tdTom-negative (figur 3G). Derudover var ingen åbenlyse lipiddråber synlige i tdTom-negative celler. Disse data tyder på, at vores nye protokol effektivt kan adskille BA'erne fra de fedtfri celler.
Tilsammen viser disse data, at isolering af BA'er med 3% BSA-opløsning forstyrrer opfølgende biokemiske undersøgelser og tyder på, at 6% iodixanolopløsning er bedre end 3% BSA-opløsning til isolering af BA'er.
Gen- og proteinekspressionsanalyse med isolerede BA'er.
For at validere denne nye BAs isolationsprocedure på molekylært niveau blev ekspressionen af tre gener sammenlignet mellem BAT og isolerede BA'er: Ucp1, Pdgfa og Pdgfra. I BAT udtrykkes Pdgfra i endotelceller og interstitielle celler, og PDGFRα-positive celler er formodede stamceller10. mRNA-niveauerne af Ucp1 og Pdgfa var begge signifikant højere i de isolerede BA'er end i BAT (figur 4A, B). Tværtimod blev mRNA'et for Pdgfra kun påvist i BAT (figur 4B).
PPARγ er en transkriptionel faktor, der styrer udviklingen af fedtvæv, UCP1 er et mitokondriprotein, og PDGFRα er et membranreceptorprotein. Disse tre proteiner repræsenterer proteiner fordelt i forskellige cellulære rum. Western blots blev udført for at teste, om protein ekstraheret fra Trizol-lyserede BA'er og BAT var egnet til proteinekspressionsanalyse. UCP1 og PPARγ blev påvist i både BA'er og BAT (figur 4C,D), hvilket bekræfter, at det samlede protein, der er isoleret fra de trizol-lyserede BA'er eller BAT, er egnet til western blot. I overensstemmelse med qRT-PCR-resultaterne blev UCP1-protein desuden beriget i BA'er (figur 4C); der henviser til, at PDGFRα kun blev påvist i BAT, men ikke i rene BA'er (figur 4D). Sammenfattende viser disse data, at vores nye BAs-isolationsmetode er effektiv og tyder på, at BA'er, der er beriget med denne metode, kan bruges direkte til gen- og proteinekspressionsundersøgelser.
Figur 1: Forberedelse af iBAT til isolering af brune adipocytter. (A) Arbejdsgang for isolationsproceduren for brune adipocytter. (B) Ventral visning af det interscapulære væv indeholdende BAT, WAT og muskellag. (C) Interscapular BAT (iBAT). Muskellag og WAT ved siden af iBAT blev fjernet. (D) Et repræsentativt billede af iBAT-stykker, der anvendes til isolering af brune adipocytter. B-D, Skala bar = 5 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Adskillelse af brune adipocytter fra fordøjelsesopløsning. (A) Billeder af dissocierede brune adipocytter før og efter adskillelse. 3% BSA-opløsning blev anvendt til at adskille brune adipocytter fra ikke-brune adipocytter. Skalastang = 1 cm. (B) Skematisk visning af genetisk mærkning af brune adipocytter med tdTomato fluorescensprotein. (C) Billeder af isolerede brune adipocytter. DIC, differentiel interferenskontrast. Skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ekstraktion af total protein fra lyserede brune adipocytter . (A) Adskillelse af proteinfase fra den organiske fase. (B) Coomassie farvning af SDS-PAGE gel. Total protein blev ekstraheret fra BAT eller 3% BSA-opløsning oprenset brune adipocytter. BSA-proteinbånd blev angivet med en pil. (C) Brunt adipocytlag dannet oven på 6% iodixanolopløsning. Skalastang = 1 cm. (D) Brune adipocytter isoleret med 6% iodixanolopløsning. Brune adipocytter blev indikeret med gule pile. Skalastang = 50 μm. (E) Coomassie farvning af SDS-PAGE gel. Total protein blev ekstraheret fra BAT eller 6% iodixanol opløsning beriget BA'er. (F) Billeder af tdTom mærket brune adipocytter. (G) Billeder af celler, der er genvundet fra iodixanolopløsningen under BAs-laget. F og G, skala bar = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Gen- og proteinekspressionsanalyse af isolerede brune adipocytter. Brune adipocytter isoleret med iodixanolmetoden blev anvendt i disse gen- og proteinekspressionsundersøgelser. (A,B) qRT-PCR-måling af genekspression. mRNA-niveauer blev normaliseret til 36B4. N=3. Elev t test, *, P<0.01; **, P<0,01. C) Western blotting af PPARγ og UCP1. D) Western blotting af PDGFRα. C og D, Ponceau S-farvet membran blev brugt som belastningskontrol. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne undersøgelse blev der udviklet en ny metode til isolering af BA'er til gen- og proteinekspressionsanalyse.
I en offentliggjort BAs-isolationsprotokol blev 3% BSA-opløsning brugt til at berige BA'er12. Ikke desto mindre kunne de berigede BA'er, der blev opnået ved denne offentliggjorte protokol, ikke anvendes direkte til proteinekspressionsanalyse. Dette skyldes, at den koncentrerede BSA, der findes i BAs-opløsningen, interfererer med opfølgende proteinekstraktion. Når BA'erne beriget i 3% BSA-opløsningen blev behandlet med Trizol-reagens, ville der dannes klæbrige proteinaggregater, hvoraf størstedelen ikke var opløselige i GTPC-proteinekstraktionsprocessen. Derudover var det meste af proteinet BSA (figur 3B) i GTPC-proteinekstraktionsproduktet. I denne nye protokol blev 3% BSA-separationsopløsning erstattet med 6% iodixanol til rensning af BA'er. 6% iodixanolopløsning adskilte effektivt BA'erne fra ikke-BA'er, og de isolerede BA'er havde bevaret morfologi (figur 3D). Bedre end 3% BSA-opløsning forstyrrede 6% iodixanolopløsning ikke proteinekstraktion, og det ekstraherede protein var egnet til western blot-analyse (figur 4C, D).
Fedtvæv indeholder store mængder lipider, og lipidforurening i ekstraherede proteinprøver forhindrer måling af proteinkoncentration. For nylig er en protokol til fjernelse af lipider fra proteinekstraktioner blevet offentliggjort. I denne protokol kræves en række lavtemperaturcentrifuger, hvilket er kedeligt og har brug for en stor mængde udgangsmaterialer19. I den nuværende undersøgelse blev en forbedret GTPC-metode15 vedtaget for at isolere protein fra BAT. Forskellig fra den klassiske GTPC-protokol brugte denne forbedrede GTPC-protokol ethanol, brom-chlorpropan og vand til at ekstrahere protein ud af den organiske fase. Vores data viste, at protein isoleret med denne forbedrede GTPC-metode var kompatibel med bicinchoninsyreassay (BCA) baseret proteinkoncentrationsmåling.
I den nuværende BAs-isolationsprotokol blev BAT- og fordøjelsesopløsningsblandingen lagt på is i en time før starten af enzymdissociationsprocessen. Formålet med denne procedure er at reducere cellemetabolismen og genekspressionshastigheden20 samt at lade fordøjelsesenzymerne effektivt sive ind i det brune fedtvæv.
Den nuværende undersøgelse havde til formål at udvikle en straitforward-metode til at isolere brune adiopocytter fra interscapular BAT til genekspressionsundersøgelse; Imidlertid kan hvide adipocytter kontamineres eksistere i de isolerede BA'er. Dette skyldes, at interscapular BAT undertiden er fastgjort med hvidt fedtvæv, som ikke kan fjernes fuldstændigt under BAT-forberedelsestrinnet. Den nuværende protokol kan ikke adskille BA'er fra WA'er baseret på celletæthed. Derfor, hvis meget høj renhed er afgørende, skal de isolerede BA'er sorteres efter FACS, før de analyseres.
Den interscapulære BAT (iBAT) indeholder rigelige klassiske BA'er, der stammer fra Myf5-cellelinjen under embryonal udvikling21. Her blev iBAT brugt som et eksempel til isolering af BA'er. I lighed med den offentliggjorte protokol12 kan vores metode også bruges til at isolere beige celler fra WAT. Ikke desto mindre, for at erhverve rene beige celler fra WAT, skal de beige celler mærkes med fluorescensprotein og beriges af FACS. Efter vores nuværende protokol kan FACS-berigede beige celler bruges til både gen- og proteinekspressionsanalyse, hvilket i høj grad vil forbedre effektiviteten af udnyttelsen af biologiske materialer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen
Acknowledgments
Z. Lin blev støttet af National Institutes of Health HL138454-01 og Masonic Medical Research Institute midler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
