Summary
Deze studie beschrijft een nieuwe methode voor het isoleren van muizenbruine adipocyten voor gen- en eiwitexpressieanalyse.
Abstract
Bruin vetweefsel (BAT) is verantwoordelijk voor niet-rillende thermogenese bij zoogdieren en bruine adipocyten (BA's) zijn de functionele eenheden van BAT. BA's bevatten zowel multiloculaire lipidedruppeltjes als overvloedige mitochondriën, en ze drukken ontkoppelend eiwit 1 (UCP1) uit. BA's worden gecategoriseerd in twee subtypen op basis van hun oorsprong: embryo-afgeleide klassieke BA's (cBA's) en witte adipocyten afgeleide BA's. Vanwege hun relatief lage dichtheid kunnen BA's niet worden geïsoleerd van BBT met de traditionele centrifugatiemethode. In deze studie werd een nieuwe methode ontwikkeld om BA's van muizen te isoleren voor gen- en eiwitexpressieanalyse. In dit protocol werd interscapulair BBT van volwassen muizen verteerd met Collagenase en Dispase-oplossing en werden de gedissocieerde BA's verrijkt met 6% iodixanoloplossing. Geïsoleerde BA's werden vervolgens gelyseerd met Trizol-reagens voor gelijktijdige isolatie van RNA, DNA en eiwit. Na RNA-isolatie werd de organische fase van het lysaat gebruikt voor eiwitextractie. Onze gegevens toonden aan dat 6% iodixanol-oplossing BA's efficiënt verrijkte zonder te interfereren met follow-up gen- en eiwitexpressiestudies. Bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF) is een groeifactor die de groei en proliferatie van mesenchymale cellen reguleert. In vergelijking met het bruine vetweefsel hadden geïsoleerde BA's een significant hogere expressie van Pdgfa. Samenvattend biedt deze nieuwe methode een platform voor het bestuderen van de biologie van bruine adipocyten op een niveau van één celtype.
Introduction
Zowel muizen als mensen hebben twee soorten vetweefsel: wit vetweefsel (WAT) en bruin vetweefsel (BAT)1. WAT slaat energie op in de vorm van triglyceriden in witte adipocyten en de bruine adipocyten (BA's) van BAT dissiperen chemische energie als warmte2. Op basis van hun ontwikkelingsoorsprong worden BA's verder onderverdeeld in klassieke BA's (cBA's) die zijn gevormd tijdens de ontwikkeling van embryo's en witte adipocyten afgeleide BA's (beige / brite-cellen, omgezet uit witte adipocyten onder stressomstandigheden)3. BA's zijn multiloculair en drukken het thermogene eiwit ontkoppelingseiwit 1 (UCP1)4 uit. Interscapulair BBT (iBAT) depot is een van de primaire cBA's depots bij kleine zoogdieren5, terwijl beige cellen verspreid zijn binnen WAT6.
Vanwege hun aard van het afvoeren van energie, hebben BA's veel aandacht gekregen als een therapeutisch doelwit voor het verminderen van obesitas7. Om BA's te exploiteren voor de behandeling van obesitas, is het essentieel om de moleculaire mechanismen te begrijpen die de functie, overleving en rekrutering van BA's beheersen. Vetweefsels, waaronder BAT en WAT, zijn heterogeen. Met uitzondering van adipocyten bevatten vetweefsels vele andere celtypen, zoals endotheelcellen, mesenchymale stamcellen en macrofagen8. Hoewel er genetische hulpmiddelen beschikbaar zijn om specifiek kandidaatgenen in muizen BA's uit te putten, zoals UCP1::Cre-lijn9, zijn technieken voor het zuiveren van BA's uit BAT of WAT beperkt, waardoor het moeilijk is om BA's op een eencellig type niveau te bestuderen. Bovendien zal de relatie tussen BA's en niet-BA's niet duidelijk worden afgebakend zonder het verkrijgen van zuivere BA's. Bloedplaatjes-afgeleide groeifactorreceptor alfa (PDGFRα) is bijvoorbeeld gebruikt als marker voor ongedifferentieerde mesenchymale cellen en wordt uitgedrukt in de endotheel- en interstitiële cellen van BAT. In koud gestresste BBT geven PDGFRα-positieve voorlopercellen aanleiding tot nieuwe BA's10. PDGFRα wordt geactiveerd door zijn ligand PDGF, een groeifactor die de groei en proliferatie van mesenchymale cellen reguleert11; het is echter onduidelijk of BA's het gedrag van PDGFRα-positieve voorlopercellen beïnvloeden door PDGF uit te scheiden.
Onlangs is een BAs-isolatieprotocol gepubliceerd, dat is gebaseerd op fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS)12. In dit protocol werd 3% runderserumalbumine (BSA) -oplossing gebruikt om BA's van niet-BA's te scheiden, en de verrijkte BA's werden verder gezuiverd door FACS. De toepassing van dit protocol wordt beperkt door de vereiste van het FACS-proces, dat afhankelijk is van zowel apparatuur als FACS-bedieningservaringen. In deze studie werd een nieuw protocol ontwikkeld voor het isoleren van BA's van BBT. De BA's die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen direct worden gebruikt voor gen- en eiwitexpressiestudies. Bovendien suggereren gegevens uit deze studie dat BA's een belangrijke PDGF-bron zijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle muizen werden in pathogeenvrije omstandigheden gehouden en alle procedures werden goedgekeurd door Masonic Medical research Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). UCP1::Cre9 en Rosa 26tdTomato muizen lijnen13 werden eerder gemeld. Alle muizen werden op kamertemperatuur gehouden met een licht/donker cyclus van 12 uur.
1. Voorbereiding van de oplossingen en bruin vetweefsel (BBT)
- Bereid de vergistingsoplossing en scheidingsoplossing in centrifugebuizen van 15 ml.
- 10 ml BBT-verteringsoplossing: voeg aan 10 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 3,5 mg / ml Dispase II, 1 mg / ml Collagenase II en 10 mM CaCl2 toe om BAT-verteringsoplossing te maken.
- 10 ml 12% iodixanoloplossing (scheidingsoplossing): Meng 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% iodixanol, 0,01 ml 1 M MgCl2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 6,865 ml ddH2O om 12% iodixanol te verkrijgen.
- Euthanaseer één volwassen muis met een overdosis CO2 . Kortom, vul de muizenkooi met 100% CO2 met een verplaatsingssnelheid van 10-30% kooivolume per minuut. 5 minuten later, bevestig de dood door te controleren op de afwezigheid van zichtbaar ademhalen.
- Ontleed het dier en verzamel interscapulaire BBT. Verwijder WAT en spierlagen onder een stereomicroscoop.
- Om voldoende vertering te hebben, snijdt u elke BAT-kwab in ~ 3 mm3 delen en plaatst u ze in een schone kolf van 50 ml met een metalen roerstaaf en 5 ml digestieoplossing. Voordat u met de spijsvertering begint, laat u de kolf met BAT en de digestiebuffer 1 uur op ijs staan.
OPMERKING: In de volgende stappen werd ongeveer 80 mg BBT gebruikt voor de isolatie van bruine adipocyten.
2. Ba's isolatieprocedure
- Plaats de kolf op een magneetroerder die in een couveuse is ingesloten. Stel de roersnelheid in op respectievelijk 60 tpm en de temperatuur van de incubator op 35 °C. De spijsvertering duurt ongeveer 30 min. Als de BAT-plakjes tijdens de spijsvertering klonten rond de roerstaaf vormen, gebruik dan een pipetpunt van 1 ml om de geaggregeerde weefsels te verstoren.
- Plaats een zeeffilter van 70 μm bovenop een schone centrifugebuis van 50 ml. Pipetteer rond 4 ml celsuspensie door de zeef. Was de zeef met 4 ml 12% iodixanoloplossing. Pipetteer op en neer om de cellen en de iodixanoloplossing te mengen. Breng het celmengsel over in twee heldere polystyreentestbuizen van 5 ml.
OPMERKING: Aan het einde van de spijsvertering moet de spijsverteringsoplossing troebel zijn, wat wijst op voldoende spijsvertering. Gebruik elke keer een verse verteringsoplossing. Eenmaal bereid, moet de verteeroplossing binnen 2 uur worden gebruikt. - Herhaal stap 2.2 en 2.3 nogmaals als de spijsvertering niet voldoende is.
- Laat de heldere polystyreenbuizen met de scheidingsoplossing en BA's gedurende 1 uur op ijs staan. De BA's vormen een laag aan de bovenkant.
- Verwijder 20 μL van de geïsoleerde BA's voor microscooponderzoek.
3. RNA- en eiwitisolatie van BA's
- Pipetteer de BA-laag in twee microcentrifugebuizen van 1,7 ml voor RNA- en eiwitisolatie. Verwijder voorzichtig de overmatige iodixanol-oplossing zonder de BA-laag te verstoren.
- Voeg 1 ml Trizol toe om tegelijkertijd RNA, DNA en eiwit in de celoplossing te isoleren. Meng voldoende om de cellen te lyseren.
- Voeg 200 μL Chloroform toe om de fasen te scheiden.
- Centrifugeer de buis gedurende 9.981 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
- Gebruik na centrifugatie de waterige fase voor RNA-isolatie. In deze studie werd totaal RNA gebruikt voor reverse transcriptie en kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd met Real-Time PCR. Primersequenties worden weergegeven in de tabel met materialen.
- Breng 300 μL van de organische fase over in een microcentrifugebuis van 2 ml.
- Voeg aan de organische fase 2,5 volume 100% ethanol en vortex toe gedurende 10 s.
- Voeg 200 μL 1-broom-3-chloorpropaan en vortex toe gedurende 10 s.
- Voeg 600 μL dubbel gedestilleerd water en vortex toe gedurende 10 s.
- Laat de gemengde oplossing 10 min op kamertemperatuur staan.
- Centrifugeer bij 9.981 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Bij deze stap worden de fasen gescheiden. De eiwitfase is gelokaliseerd in de middelste laag.
- Verwijder de bovenste waterige oplossing. Voeg 1 ml 100% ethanol toe aan de resterende oplossing.
- Centrifugeer gedurende 10 min, 9,981 x g, 4 °C. Na centrifugatie zal de eiwitpellet zich vormen. Gooi het supernatant weg.
- Was de pellet met 1 ml 100% ethanol.
- Centrifugeer gedurende 10 min, 9981 x g, 4 °C. Bewaar de pellet en gooi het supernatant weg.
- Droog de pellet 10 minuten aan de lucht bij kamertemperatuur.
- Meet het gewicht van de natte pellet. Voeg 1% SDS-oplossing toe in een verhouding van 20 μL/mg pellet.
- Los de pellet op door de buis in een verwarmde shaker te doen. Stel de temperatuur in op 55 °C en de snelheid op 11 x g. Het duurt meestal 5-10 minuten om de eiwitkorrel volledig op te lossen.
OPMERKING: De concentratie van het opgeloste eiwit kan worden gemeten met BCA-test14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bereiding van interacapulaire BBT voor isolatie van bruine adipocyten
Het isolatieproces van bruine adipocyten (BA's) is weergegeven in figuur 1A. Het hele proces, van het voorbereiden van BBT- en verterings-/scheidingsoplossingen tot het verkrijgen van geïsoleerde BA's, duurt ongeveer 4 uur.
Bij volwassen muizen komt een overvloedige BAT voor in het interscapulaire gebied. Deze interscapulaire BAT (iBAT) is bedekt met spierlagen en WAT (figuur 1B). Voordat de verteringsprocedure wordt gestart, moeten de spierlagen en WAT worden verwijderd om schone iBAT op te leveren (figuur 1C). In een gepubliceerd BA-isolatieprotocol werd gehakte BBT gebruikt voor BA-isolatie12. In deze studie leverde de vertering van 3 mm3 grootte BBT (figuur 1D) meer BA's op dan gehakte BBT.
Scheiding van BA's van niet-BA's met 3% BSA-oplossing
Na iBAT-vertering werden gedissocieerde BA's gemengd met niet-BA's in het verteringsproduct. Omdat BA's lipidedruppels bevatten, is hun dichtheid lager dan niet-BA's; de dichtheid van BA's is echter niet laag genoeg om ze efficiënt naar de top van een reguliere PBS-oplossing te laten zweven. PBS met 3% runderserumalbumine (BSA) is gebruikt om BA's te scheiden van niet-BA's12, wat in dit onderzoek met succes werd herhaald (figuur 2A).
Rosa 26tdTomato is een reportermuislijn, die sterke tdTomato (tdTom) fluorescentie-eiwit tot expressie brengt na Cre-gemedieerde recombinatie13. Ucp1::Cre transgene muizen drukken Cre-recombinase uit in de BA's9. Ucp1::Cre muislijn werd gekruist met Rosa 26tdTomato muizen om BA's genetisch te labelen met tdTom (Figuur 2B). Voor het valideren van de BA-isolatieprocedure werd iBAT van Ucp1::Cre;tdTom/+ muizen gedissocieerd. De meeste cellen verrijkt in de bovenste laag van de BSA-oplossing hadden de frambozenvorm en bevatten multiloculaire lipidedruppels. Bovendien waren de meeste van deze framboosvormcellen tdTom-positief (figuur 2C), wat bevestigt dat het bruine adipocyten waren.
Scheiding van BA's van niet-BA's met 6% iodixanoloplossing
3% BSA-scheidingsoplossing verrijkte BA's. Het was onduidelijk of deze geïsoleerde BA's konden worden gebruikt voor gen- en eiwitexpressieanalyse. RNA en eiwit werden vervolgens geëxtraheerd uit de verrijkte BA's. RNA-extractie werd met succes uitgevoerd volgens de standaard RNA-isolatieprocedure. Het standaard Trizol-eiwitisolatieprotocol, ook bekend als Guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform-methode (GTPC-methode), werkte echter niet goed, wat vervelend was en een zeer lage eiwitopbrengst had. Daarom werd een verbeterde eiwitisolatiemethode toegepast om eiwitten uit Trizol-lysed BA's te extraheren.
In dit verbeterde GTPC-protocol werden ethanol, broom-chloorpropaan en water gebruikt voor het extraheren van eiwitten uit de organische fase15. Na toevoeging van ethanol, broom-chloorpropaan en water aan de organische fase en na centrifugatie vormde zich eiwitpellet tussen de waterige fase en de organische fase (figuur 3A). Eiwitpellet werd vervolgens gewassen met 100% ethanol en opgelost in 1% SDS. Deze verbeterde GTPC-methode werd gebruikt om eiwitten te extraheren uit met iBAT en BSA-oplossingen verrijkte BA's. Hoewel de BBT-eiwitpellet gemakkelijk werd opgelost in 1% SDS, was een groot deel van de geïsoleerde BA-eiwitpellet niet oplosbaar. Vervolgens werd het opgeloste eiwit onderzocht met SDS-PAGE-gel. Zoals te zien is in een Coomassie blauw gekleurde SDS-PAGE gel (figuur 3B), was een massieve eiwitband rond 60 kDa aanwezig in de geïsoleerde BA's, maar niet in de BBT-monsters. Omdat het molecuulgewicht van BSA 66 kDa is en er overvloedig BSA bestaat in de BA-scheidingsoplossing, moet deze dominante eiwitband BSA zijn. Deze gegevens suggereren dat de BSA uit de BA-scheidingsoplossing interfereert met eiwitextractie.
Iodixanol is een niet-ionisch en iso-osmotisch gradiëntmedium16 dat op grote schaal is gebruikt voor cel17 en adeno-geassocieerd virus (AAV) zuivering18. Om BSA-interferentie van eiwitexpressiestudies te voorkomen, werd iodixanol gebruikt om BSA te vervangen in een nieuwe BA-scheidingsoplossing. 3% BSA-oplossing heeft een dichtheid van 1,03, wat vergelijkbaar is met 6% iodixanol. In 6% iodixanol-oplossing dreven BA's in 30-60 minuten naar de top (figuur 3C). De BA's die met deze oplossing werden geïsoleerd, vertoonden een typische frambozenvorm en bevatten multiloculaire lipidedruppeltjes (figuur 3D). Eiwitten geëxtraheerd uit deze geïsoleerde BA's werden mooi gescheiden in SDS-PAGE-gel (figuur 3E).
Om te verifiëren of de 6% iodixanol-oplossing ba's efficiënt scheidde van niet-BA's, hebben we de BA's genetisch gelabeld met tdTom en de cellen onderzocht die zich in de heldere 6% iodixanol-oplossing bevinden. Na het scheiden van de BA's van niet-BA's (stap 2.4), werd de 6% iodixanoloplossing onder de BA-laag 6 keer verdund met PBS en vervolgens gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 600 x g . Na centrifugatie werd op de bodem een kleine rode bloedcelkorrel gevormd, die mogelijk stromale vasculaire fractiecellen zijn. Zoals te zien is in figuur 3, waren cellen uit de BA-laag tdTom-positieve cellen (figuur 3F); de cellen die uit de pellet werden teruggewonnen, waren echter tdTom-negatief (figuur 3G). Bovendien waren er geen duidelijke lipidedruppeltjes zichtbaar in de tdTom-negatieve cellen. Deze gegevens suggereren dat ons nieuwe protocol de BA's efficiënt kan scheiden van de niet-vetcellen.
Samen tonen deze gegevens aan dat het isoleren van BA's met 3% BSA-oplossing interfereert met follow-up biochemiestudies en suggereren dat 6% iodixanoloplossing beter is dan 3% BSA-oplossing voor het isoleren van BA's.
Gen- en eiwitexpressieanalyse met geïsoleerde BA's.
Voor het valideren van deze nieuwe BA-isolatieprocedure op moleculair niveau werd de expressie van drie genen vergeleken tussen BBT en geïsoleerde BA's: Ucp1, Pdgfa en Pdgfra. In BAT komt Pdgfra tot expressie in endotheelcellen en interstitiële cellen, en PDGFRα-positieve cellen zijn vermeende voorlopercellen10. De mRNA-niveaus van Ucp1 en Pdgfa waren beide significant hoger in de geïsoleerde BA's dan in de BBT (figuur 4A,B). Integendeel, het mRNA van Pdgfra werd alleen gedetecteerd in BAT (figuur 4B).
PPARγ is een transcriptionele factor die de ontwikkeling van vetweefsel regelt, UCP1 is een mitochondriaal eiwit en PDGFRα is een membraanreceptoreiwit. Deze drie eiwitten vertegenwoordigen eiwitten verdeeld in verschillende cellulaire compartimenten. Western blots werden uitgevoerd om te testen of eiwit geëxtraheerd uit Trizol-lysed BA's en BAT geschikt was voor eiwitexpressieanalyse. UCP1 en PPARγ werden gedetecteerd in zowel BA's als BBT (figuur 4C,D), wat bevestigt dat het totale eiwit geïsoleerd uit de Trizol-lysed BA's of BBT geschikt is voor western blot. Bovendien werd, in overeenstemming met de qRT-PCR-resultaten, UCP1-eiwit verrijkt in BA's (figuur 4C); overwegende dat PDGFRα alleen in BBT werd aangetroffen, maar niet in zuivere BA's (figuur 4D). Samenvattend tonen deze gegevens aan dat onze nieuwe BA-isolatiemethode efficiënt is en suggereren dat BA's die met deze methode zijn verrijkt, direct kunnen worden gebruikt voor gen- en eiwitexpressiestudies.
Figuur 1: Voorbereiding van iBAT voor isolatie van bruine adipocyten. (A) Workflow van de isolatieprocedure voor bruine adipocyten. (B) Ventrale weergave van het interscapulaire weefsel dat BAT-, WAT- en spierlagen bevat. C) Interscapulaire BBT (iBAT). Spierlagen en WAT naast iBAT werden verwijderd. (D) Een representatief beeld van iBAT-stukken die worden gebruikt voor de isolatie van bruine adipocyten. B-D, Scale bar= 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Scheiding van bruine adipocyten uit digestieoplossing. (A) Afbeeldingen van gedissocieerde bruine adipocyten voor en na scheiding. 3% BSA-oplossing werd gebruikt om bruine adipocyten te scheiden van niet-bruine adipocyten. Schaalbalk = 1 cm. (B) Schematische weergave van genetische etikettering van bruine adipocyten met tdTomato fluorescentie-eiwit. (C) Afbeeldingen van geïsoleerde bruine adipocyten. DIC, differentieel interferentiecontrast. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Extractie van totaal eiwit uit gelyseerde bruine adipocyten. (A) Scheiding van eiwitfase van de organische fase. (B) Coomassie kleuring van SDS-PAGE gel. Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit BAT of 3% BSA-oplossing gezuiverde bruine adipocyten. De BSA-eiwitband werd aangegeven met een pijl. (C) Bruine adipocytenlaag gevormd bovenop 6% iodixanoloplossing. Schaalbalk = 1 cm. (D) Bruine adipocyten geïsoleerd met 6% iodixanoloplossing. Bruine adipocyten werden aangegeven met gele pijlen. Schaalbalk = 50 μm. (E) Coomassie kleuring van SDS-PAGE gel. Totaal eiwit werd geëxtraheerd uit BBT of 6% met iodixanoloplossing verrijkte BA's. (F) Afbeeldingen van tdTom gelabelde bruine adipocyten. (G) Afbeeldingen van cellen die zijn teruggewonnen uit de iodixanoloplossing onder de BA-laag. F en G, schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Gen- en eiwitexpressieanalyse van geïsoleerde bruine adipocyten. Bruine adipocyten geïsoleerd met de iodixanol-methode werd gebruikt in deze gen- en eiwitexpressiestudies. (A,B) qRT-PCR meting van genexpressie. mRNA-niveaus werden genormaliseerd tot 36B4. N=3. Student t test, *, P<0.01; **, P<0,01. (C) Western blotting van PPARγ en UCP1. d) Western blotting van PDGFRα. C en D, Ponceau S-gekleurd membraan werd gebruikt als belastingscontrole. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werd een nieuwe methode ontwikkeld voor het isoleren van BA's voor gen- en eiwitexpressieanalyse.
In een gepubliceerd BA-isolatieprotocol werd 3% BSA-oplossing gebruikt om BA's12 te verrijken. Niettemin konden de verrijkte BA's die door dit gepubliceerde protocol werden bereikt, niet direct worden gebruikt voor eiwitexpressieanalyse. Dit komt omdat de geconcentreerde BSA die in de BA-oplossing aanwezig is, interfereert met de daaropvolgende eiwitextractie. Wanneer de BA's verrijkt met de 3% BSA-oplossing werden behandeld met Trizol-reagens, zouden kleverige eiwitaggregaten ontstaan, waarvan het grootste deel niet oplosbaar was in het GTPC-eiwitextractieproces. Bovendien was in het GTPC-eiwitextractieproduct het grootste deel van het eiwit BSA (figuur 3B). In dit nieuwe protocol werd 3% BSA-scheidingsoplossing vervangen door 6% iodixanol voor het zuiveren van BA's. 6% iodixanoloplossing scheidde de BA's efficiënt van niet-BA's, en de geïsoleerde BA's hadden de morfologie behouden (figuur 3D). Superieur aan 3% BSA-oplossing, interfereerde 6% iodixanoloplossing niet met eiwitextractie en het geëxtraheerde eiwit was geschikt voor western blot-analyse (figuur 4C, D).
Vetweefsel bevat een grote hoeveelheid lipiden en lipidenbesmetting in geëxtraheerde eiwitmonsters belemmert de meting van de eiwitconcentratie. Onlangs is een protocol gepubliceerd om lipiden uit eiwitextracties te verwijderen. In dit protocol is een reeks centrifugaties bij lage temperatuur vereist, wat vervelend is en een grote hoeveelheid uitgangsmaterialen nodig heeft19. In de huidige studie werd een verbeterde GTPC-methode15 gebruikt om eiwit uit BBT te isoleren. Anders dan het klassieke GTPC-protocol, gebruikte dit verbeterde GTPC-protocol ethanol, broom-chloorpropaan en water om eiwitten uit de organische fase te halen. Onze gegevens toonden aan dat eiwit geïsoleerd met deze verbeterde GTPC-methode compatibel was met op bicinchonininezuur assay (BCA) gebaseerde eiwitconcentratiemeting.
In het huidige BA-isolatieprotocol werden vóór de start van het enzymdissociatieproces het BAT- en spijsverteringsoplossingmengsel gedurende één uur op ijs gezet. Het doel van deze procedure is om het celmetabolisme en de genexpressiesnelheid20 te verminderen, en om de spijsverteringsenzymen efficiënt in het bruine vetweefsel te laten doordringen.
De huidige studie was gericht op het ontwikkelen van een straitforward-methode om bruine adiopocyten te isoleren uit interscapulaire BAT voor genexpressiestudie; witte adipocytenbesmetting kan echter voorkomen in de geïsoleerde BA's. Dit komt omdat interscapulair BBT soms wordt gehecht door wit vetweefsel, dat niet volledig kan worden verwijderd tijdens de BBT-voorbereidingsstap. Het huidige protocol kan BA's niet scheiden van WAs op basis van celdichtheid. Daarom, als een zeer hoge zuiverheid essentieel is, moeten de geïsoleerde BA's worden gesorteerd op FACS voordat ze worden geanalyseerd.
De interscapulaire BAT (iBAT) bevat overvloedige klassieke BA's die zijn afgeleid van de Myf5-cellijn tijdens de embryonale ontwikkeling21. Hier werd iBAT gebruikt als voorbeeld voor het isoleren van BA's. Net als bij het gepubliceerde protocol12 kan onze methode ook worden gebruikt voor het isoleren van beige cellen uit WAT. Niettemin, om zuivere beige cellen van WAT te verkrijgen, moeten de beige cellen worden geëtiketteerd met fluorescentie-eiwit en worden verrijkt met FACS. Volgens ons huidige protocol kunnen de FACS-verrijkte beige cellen worden gebruikt voor zowel gen- als eiwitexpressieanalyse, wat de efficiëntie van het gebruik van biologische materialen aanzienlijk zal verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen
Acknowledgments
Z. Lin werd ondersteund door national institutes of health HL138454-01 en masonic medical research institute fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
