Summary
हम ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी और सेल ट्रैकिंग का उपयोग करके सौ माइक्रोन से मिलीमीटर आकार की कोशिकाओं की आबादी की गतिशीलता और व्यवहार के लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस परख से पता चलता है कि स्टेंटर कोएरुलस एक खोए हुए मौखिक तंत्र को पुनर्जीवित करते समय चार व्यवहारिक रूप से अलग-अलग चरणों के माध्यम से संक्रमण करता है।
Abstract
स्टेंटर कोएरुलस एककोशिकीय उत्थान के अध्ययन के लिए एक प्रसिद्ध मॉडल जीव है। व्यक्तिगत कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण से सैकड़ों जीनों का पता चला- कई मौखिक तंत्र (ओए) से जुड़े नहीं हैं- जो पुनर्जनन प्रक्रिया के दौरान चरणों में अलग-अलग विनियमित होते हैं। यह परिकल्पना की गई थी कि एक नए ओए के विकास की दिशा में सेलुलर संसाधनों के इस प्रणालीगत पुनर्गठन और जुटाने से अंतर जीन अभिव्यक्ति के चरणों के अनुरूप आंदोलन और व्यवहार में अवलोकन योग्य परिवर्तन होंगे। हालांकि, एस कोएरुलस की रूपात्मक जटिलता ने आंकड़ों और टाइमस्केल को पकड़ने के लिए एक परख के विकास की आवश्यकता थी। लघु वीडियो में कोशिकाओं को ट्रैक करने के लिए एक कस्टम स्क्रिप्ट का उपयोग किया गया था, और आंकड़े एक बड़ी आबादी (एन ~ 100) पर संकलित किए गए थे। ओए के नुकसान पर, एस कोएरुलस शुरू में निर्देशित गति की क्षमता खो देता है; फिर ~ 4 घंटे से शुरू होकर, यह ~ 8 घंटे तक गति में एक महत्वपूर्ण गिरावट प्रदर्शित करता है। यह परख गतिशीलता फेनोटाइप की स्क्रीनिंग के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है और अन्य जीवों की जांच के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Introduction
स्टेंटर कोएरुलस (स्टेंटर) एक प्रसिद्ध मॉडल जीव है जिसका उपयोग अपने बड़े आकार, कई माइक्रोसर्जिकल तकनीकों का सामना करने की क्षमता और प्रयोगशाला सेटिंग 1,2,3 में संवर्धन में आसानी के कारण एककोशिकीय उत्थान का अध्ययन करने के लिए किया गया है। प्रारंभिक उत्थान अध्ययन स्टेंटर में सबसे बड़ी और सबसे रूपात्मक रूप से विशिष्ट विशेषता पर केंद्रित है- ओए- जो पूरी तरह से रासायनिक सदमे 4,5,6 पर बहाया जाता है। खोए हुए ओए का डे नोवो प्रतिस्थापन एक नए झिल्लीदार बैंड के उद्भव के साथ शुरू होता है- सिलिया की एक सरणी जो धीरे-धीरे आठ रूपात्मक चरणों में एक कार्यात्मक ओए बनाने से पहले सेल के पूर्वकाल की ओर स्थानांतरित होजाती है 3. इन चरणों को तापमान की परवाह किए बिना क्रमिक रूप से देखा गया है, और लगभग सभी अध्ययनों के लिए एक सार्वभौमिक संदर्भ बिंदु प्रदान करतेहैं 5.
स्टेंटर पुनर्जनन के यंत्रवत विश्लेषण के लिए पुनर्जनन के समय को मापने के लिए उपकरणों की आवश्यकता होती है जो रासायनिक या आणविक स्क्रीन के हिस्से के रूप में कई नमूनों पर लागू होने के लिए पर्याप्त मजबूत और सरल होते हैं। सेल-आधारित परख करने के लिए मानक विधि इमेजिंग है, इस मामले में, पुनर्जनन के दौरान नए ओए के गठन की इमेजिंग। हालांकि, इस तरह के इमेजिंग-आधारित परख सबसे प्रभावी होते हैं जब पुनर्जन्म संरचना में अलग-अलग आणविक घटक होते हैं जिन्हें मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, ताकि उन्हें प्रतिदीप्ति छवि में आसानी से पता लगाया जा सके। स्टेंटर ओए के मामले में, ज्ञात घटक (सिलिया, बेसल निकाय) सेल की सतह के बाकी हिस्सों पर भी मौजूद हैं; इसलिए, ओए की बहाली को पहचानना केवल एक घटक की उपस्थिति या अनुपस्थिति की तलाश करके प्राप्त नहीं किया जा सकता है।
इसके बजाय, ओए का पता लगाने के लिए आकार मान्यता के कुछ रूप की आवश्यकता होगी, और यह संभवतः इस तथ्य को देखते हुए बहुत चुनौतीपूर्ण है कि स्टेंटर कोशिकाएं अक्सर तेजी से सिकुड़ा हुआ प्रक्रिया के माध्यम से आकार बदलती हैं। यह पत्र पुनर्जनन के लिए एक वैकल्पिक परख प्रस्तुत करता है जो शरीर और ओए सिलिया की गतिशील गतिविधि पर निर्भर करता है। जैसे ही ओए पुनर्जीवित होता है, नवगठित सिलिया स्थिति और गतिविधि में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिवर्तनों से गुजरता है, जो बदले में, सेल की तैराकी गतिशीलता को प्रभावित करता है। गतिशीलता का विश्लेषण करके, "कार्यात्मक उत्थान" के लिए एक परख करना संभव है जो पुनर्जीवित संरचनाओं के कार्य को मापकर उत्थान की मात्रा निर्धारित करता है। उत्थान के दौरान स्टेंटर सिलिअरी फ़ंक्शन का पिछला विश्लेषण बाहरी मीडिया में जोड़े गए ट्रेसर मोतियों के साथ संयुक्त कण छवि वेलोसिमेट्री का उपयोग करता है, पुनर्जनन के विभिन्न चरणों में प्रवाह पैटर्न में परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए7; हालाँकि, इस दृष्टिकोण के लिए व्यक्तिगत कोशिकाओं और उनके संबंधित प्रवाह क्षेत्रों की श्रमसाध्य इमेजिंग की आवश्यकता होती है, एक समय में एक।
सिलिया-जनित प्रवाह के लिए प्रॉक्सी के रूप में सेल की गति का उपयोग करके, उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग प्लेटफार्मों के साथ संगत कम-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके समानांतर में बड़ी संख्या में कोशिकाओं का विश्लेषण करना संभव होगा। इस परख, सिद्धांत रूप में, मिलीमीटर आकार के पैमाने के लिए माइक्रोन के सैकड़ों में अन्य तैराकी जीवों में विकास और कार्यात्मक उत्थान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की धारा 1 एक मल्टीवेल नमूना स्लाइड के निर्माण का वर्णन करती है, जो पूरे दिन तक कोशिकाओं की आबादी के उच्च-थ्रूपुट इमेजिंग की अनुमति देती है। अन्य सेल प्रकारों के साथ उपयोग के लिए समायोजित करने के तरीके के लिए विवरण प्रदान किए जाते हैं। प्रोटोकॉल की धारा 2 इस परख के लिए वीडियो डेटा के अधिग्रहण को कवर करती है, जिसे डिजिटल सिंगल-लेंस रिफ्लेक्स कैमरा के साथ विच्छेदन माइक्रोस्कोप पर पूरा किया जा सकता है। प्रोटोकॉल की धारा 3 मैटलैब कोड (पूरक जानकारी) का उपयोग करके सेल ट्रैकिंग और सेल गति गणना का वॉक-थ्रू प्रदान करती है। प्रोटोकॉल की धारा 4 बताती है कि परिणामों की आसान व्याख्या के लिए चित्रा 1 सी-एफ और चित्रा 2 सी में दिखाए गए अनुसार संख्यात्मक परिणामों को भूखंडों में कैसे बदलना है।
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Protocol
नोट: लगभग एक सौ एस कोएरुलस कोशिकाओं की आबादी पहले प्रकाशित जोव प्रोटोकॉल8 के अनुसार सुसंस्कृत थे।
1. नमूना तैयारी
- माइक्रोस्कोप स्लाइड की तुलना में ऊंचाई और चौड़ाई दोनों में थोड़ा छोटा 250 μm-मोटी सिलिकॉन स्पेसर शीट (सामग्री की तालिका) का एक टुकड़ा काटें। 5/16 "छेद पंच का उपयोग करके, परिपत्र कुएं बनाएं। एक अच्छी मुहर सुनिश्चित करने के लिए पड़ोसी कुओं के बीच पर्याप्त जगह छोड़ने के प्रति सचेत रहें।
नोट: पड़ोसी कुओं के बीच 3 मिमी की जगह पर्याप्त पाई गई थी। अभ्यास के साथ, दस कुओं को एक नमूना स्लाइड पर रखा जा सकता है। - 2 मिनट (चित्रा 1 ए) के लिए 10% सुक्रोज या 2% यूरिया में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करके ओए के उत्थान की शुरुआत करें। फिर, ताजा माध्यम8 के साथ तीन बार धो लें। धीरे प्रत्येक कुएं में लगभग दस स्टेंटर पिपेट। नमूना मात्रा के रूप में संभव के रूप में बारीकी से अच्छी तरह से मात्रा से मिलान करने के लिए सावधान रहें।
नोट: यहां उपयोग किए जाने वाले अच्छी तरह से आयामों के लिए, नमूना के 12.5 μL को प्रत्येक कुएं में पाइप किया गया था। - एक किनारे से शुरू होने वाले कुओं पर कवरग्लास के एक टुकड़े को धीरे से कम करके कुओं को बंद करें ( सामग्री की तालिका देखें)। कवरग्लास पर नीचे दबाने के लिए, जहां यह सिलिकॉन शीट से संपर्क करता है, एक अच्छी मुहर सुनिश्चित करने के लिए, एक संकीर्ण और थोड़ा लचीला ऑब्जेक्ट, जैसे 10 μL विंदुक टिप का उपयोग करें।
2. दृश्य प्रकाश माइक्रोस्कोपी समय चूक
- माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना रखें, और आवर्धन को सबसे कम उपलब्ध पर सेट करें जैसे कि एक अच्छी तरह से अपनी संपूर्णता में फ्रेम में फिट बैठता है।
नोट: उद्देश्य पर एक 1.6x कैमरा एडाप्टर और 1x आवर्धन इस प्रोटोकॉल के लिए माइक्रोस्कोप पर इस्तेमाल किया गया। - समय-चूक शुरू करें। प्रत्येक टाइमपॉइंट पर प्रत्येक कुएं के 30 फ्रेम प्रति सेकंड पर 10 एस वीडियो प्राप्त करें। यदि मोटर चालित एक्स-वाई चरण के साथ माइक्रोस्कोप सेटअप का उपयोग कर रहे हैं, तो पूरे समय-चूक को स्वचालित करें। अन्यथा, सुनिश्चित करें कि उपयोगकर्ता प्रत्येक टाइमपॉइंट पर प्रत्येक अच्छी तरह से रिकॉर्ड करने के लिए नमूने का मैन्युअल रूप से अनुवाद करने के लिए मौजूद है।
नोट: हीटिंग और वाष्पीकरण से बचने के लिए इमेजिंग नहीं होने पर नमूना प्रबुद्ध छोड़ने से बचें। नमूना वॉल्यूम छोटे हैं, और वाष्पीकरण हवा के बुलबुले को जन्म देगा। - फिल्मों को टीआईएफएफ, एमओवी या एवीआई के रूप में सहेजें।
नोट: ये सबसे आम गैर-मालिकाना वीडियो फ़ाइल प्रकार हैं। विशिष्ट माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर के आधार पर, वीडियो डिफ़ॉल्ट रूप से मालिकाना फ़ाइल प्रकार में सहेज सकते हैं, लेकिन फिर उपरोक्त फ़ाइल प्रकारों में से एक को निर्यात किया जा सकता है। - भौतिक पैमाने के लिए मिलीमीटर रूपांतरण कारक के लिए पिक्सेल का उपयोग करें, और एक अंशांकन करें या उपयोग किए गए कैमरे से ज्ञात पिक्सेल आकार का उपयोग करें। कैलिब्रेट करने के लिए, वीडियो के समान आवर्धन सेटिंग्स पर एक अंशांकन स्लाइड या एक स्पष्ट शासक की एक स्पष्ट छवि प्राप्त करें। किसी भी छवि देखने के कार्यक्रम का उपयोग करके, ज्ञात भौतिक दूरी के निशान के बीच पिक्सेल की संख्या की गणना करें।
नोट: उदाहरण के लिए, यदि एक शासक की छवि 1 मिमी निशान और 2 मिमी निशान को 100 पिक्सेल से अलग करने के लिए दिखाती है, तो रूपांतरण कारक 1 मिमी प्रति 100 पिक्सेल है। वैकल्पिक रूप से, कैमरा पिक्सेल आकार से इस कारक को प्राप्त करने के लिए, बस कैमरे के पिक्सेल आकार को आवर्धन से गुणा करें। उदाहरण के लिए, यदि उपयोग किए गए कैमरे में 3.45 μm पिक्सेल हैं, और उपयोग किया जाने वाला आवर्धन 1.6x था, तो रूपांतरण 3.45 μm * 1.6 = 5.52 μm प्रति 1 पिक्सेल है।
3. सेल ट्रैकिंग
- कंप्यूटर पर एक आसान-से-याद रखने वाले स्थान पर दो स्क्रिप्ट, ट्रैकसेल.एम और क्लीनट्रेस.एम डाउनलोड करें। यदि डेटा वीडियो पहले से ही इस कंप्यूटर पर नहीं हैं, तो उन्हें इस कंप्यूटर पर स्थानांतरित करें.
नोट:: डेटा वीडियो और स्क्रिप्ट एक ही फ़ोल्डर में होने की आवश्यकता नहीं है। - डेटा वीडियो को फ़ोल्डरों में व्यवस्थित करें, प्रत्येक टाइमपॉइंट के लिए एक। डेटा वीडियो में स्वचालित सेल ट्रैकिंग करने के लिए पहले स्क्रिप्ट ट्रैकसेल.एम का उपयोग करें। ट्रैकसेल.एम खोलें और स्क्रिप्ट चलाएं।
- पॉप-अप विंडो द्वारा संकेत दिए जाने पर पथ में जोड़ें चुनें., जो आमतौर पर केवल तभी होगा जब स्क्रिप्ट किसी दिए गए फ़ोल्डर से पहली बार चलाई जाती है। संकेत मिलने पर, ट्रैकिंग प्रारंभ करने के लिए एक या अधिक डेटा वीडियो का चयन करें, डेटा वीडियो (अनुभाग 2) पर नेविगेट करें। शिफ्ट-क्लिक, कंट्रोल-क्लिक, या उन्हें हाइलाइट करने के लिए फ़ाइलों पर ले जाते समय बाएं माउस बटन को दबाकर कई वीडियो फ़ाइलों का चयन करें।
- एक बार फ़ाइल नाम में फ़ाइलों की सूची से संतुष्ट होने के बाद: प्रॉम्प्ट विंडो के निचले भाग में बॉक्स, ओपन पर क्लिक करें। सभी पैरामीटर सही ढंग से सेट किए जाने की पुष्टि करने के लिए पहले एक वीडियो पर एक परीक्षण चलाएं (नीचे चर्चा देखें)।
नोट:: यह स्क्रिप्ट अब चुने गए प्रत्येक वीडियो फ़ाइल के लिए एक फ़ोल्डर बनाएगी। इसके बाद यह इस फ़ोल्डर में वीडियो के प्रत्येक फ्रेम को .jpg फ़ाइल और position_estimates.मैट नामक एक फ़ाइल के रूप में लिखेगा, जिसमें वीडियो में पाए गए सभी निशान शामिल हैं। वीडियो के आकार, वीडियो की संख्या और कंप्यूटर की गति के आधार पर, इस स्क्रिप्ट को चलाने में घंटों लग सकते हैं।
4. ट्रेस सत्यापन
- सत्यापित करें कि अनुभाग 3 में वर्णित चरणों का ठीक से पालन किया गया था जाँच करें कि आगे बढ़ने से पहले कोई त्रुटि संदेश नहीं हैं। मैन्युअल रूप से विसंगतिपूर्ण या झूठे निशान अस्वीकार करने के लिए क्लीनट्रेस.एम स्क्रिप्ट का उपयोग करें। फ़ाइल पर डबल-क्लिक करके MATLAB संपादक विंडो में क्लीनट्रेस.एम खोलें।
- संकेत पर ट्रैकसेल.m द्वारा डेटा फ़ोल्डर आउटपुट का चयन करें। इसका वीडियो फ़ाइल के समान नाम होगा, अनुभाग 3 में वर्णित फ़ोल्डरों में से एक पर नेविगेट करें। केवल एक फ़ोल्डर चुनें.
नोट: यह स्क्रिप्ट अब एक पॉप-अप विंडो में एक-एक करके निशान प्रदर्शित करेगा। उन्हें वीडियो के फ्रेम पर मढ़ा जाता है जहां ट्रेस शुरू होता है, हरे रंग में, और वीडियो का फ्रेम जहां ट्रेस समाप्त होता है, मैजेंटा में। इसलिए, एक मान्य ट्रेस को एक हरे रंग की कोशिका और एक मैजेंटा सेल को लिंक करना चाहिए। - संकेत मिलने पर, ट्रेस रखने के लिए 1 और ट्रेस को अस्वीकार करने के लिए 0 दर्ज करें। अगले ट्रेस पर जाने के लिए एंटर दबाएं।
नोट: नए निशान प्रदर्शित करने के लिए जारी रहेगा जब तक कि या तो कोई और निशान नहीं हैं, या पहले साठ दिखाए गए हैं। जब यह प्रक्रिया पूरी हो जाती है, तो स्क्रिप्ट स्वचालित रूप से आउटपुट को सहेजने के लिए क्लीन ट्रेसेस नामक एक फ़ोल्डर बनाएगी और वीडियो के पहले फ्रेम (चित्रा 1 बी) के शीर्ष पर सभी शेष निशान प्रदर्शित करेगी। यह छवि स्वचालित रूप से भविष्य के संदर्भ के लिए लेबलट्रेस.png के रूप में सहेजी जाती है। उपयोगकर्ता ने रखने के लिए जो भी निशान चुने थे, वे फ़ाइल clean_traces.मैट में सहेजे जाएंगे। - जारी रखने से पहले एक समय बिंदु में सभी वीडियो के लिए इस चरण को पूरा करें।
नोट: इस पांडुलिपि में डेटा के लिए, प्रत्येक टाइमपॉइंट पर प्रत्येक कुएं के लिए एक वीडियो का अधिग्रहण किया गया था, प्रति टाइमपॉइंट कुल दस वीडियो के लिए।
5. डेटा विज़ुअलाइज़ेशन
नोट: नेत्रहीन विभिन्न टाइमपॉइंट्स में पूरे सेल आबादी की गतिशीलता की तुलना करने के लिए, धारा 4 से सभी निशान मूल पर शुरू करने और प्रत्येक टाइमपॉइंट के लिए एक रेडियल विस्थापन बनाम समय साजिश बनाने के लिए अनुवादित किए गए थे (चित्रा 1 सी-एफ, सभी समय बिंदुओं के लिए पूरक चित्रा एस 1 देखें)।
- स्पेगेटीप्लॉट्स.एम नामक स्क्रिप्ट डाउनलोड करके शुरू करें। स्क्रिप्ट खोलें और चलाएँ। जब विंडो फ़ाइल ब्राउज़र विंडो प्रॉम्प्ट के साथ पॉप अप होती है तो ग्राफ़ करने के लिए अच्छी तरह से डेटा (clean_traces.मैट) वाले समय फ़ोल्डर का चयन करें, समय बिंदुओं में से एक के फ़ोल्डर पर नेविगेट करें। ध्यान दें कि इस फ़ोल्डर में विश्लेषण किए गए प्रत्येक वीडियो के लिए एक फ़ोल्डर होना चाहिए।
- जब संकेत दिया गया अंशांकन: प्रति मिलीमीटर पिक्सेल की संख्या क्या है?, चरण 2.4 में पाए गए अंशांकन मान में टाइप करें, और एंटर दबाएं।
नोट: स्क्रिप्ट अब इस समय सभी विश्लेषण किए गए वीडियो से निशान को एक ही साजिश (चित्रा 1 सी-एफ) में जोड़ देगा। भूखंड में बेहोश बिंदीदार हलकों 1, 2, 3 और 4 मिमी के रेडियल विस्थापन का संकेत मिलता है। - स्क्रिप्ट की लाइन 55 को बदलकर आवश्यकतानुसार प्लॉट की कुल्हाड़ियों को समायोजित करें, जो डिफ़ॉल्ट रूप से, 4 मिमी तक की त्रिज्या को शामिल करने के लिए आरआर = 4 पर सेट है। प्लॉट को सहेजें।
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Representative Results
इस परख का लक्ष्य आंदोलन पैटर्न के क्रमिक परिवर्तन और एक बड़े (एन ~ 100) पुनर्जन्म स्टेंटर आबादी के भीतर कोशिकाओं से आंदोलन की गति में चरणबद्ध वृद्धि की मात्रा निर्धारित करना है। परिणामों की व्याख्या में सहायता के लिए, इस प्रोटोकॉल में शामिल कस्टम कोड दो प्रकार के भूखंड उत्पन्न करता है: वीडियो डेटा (चित्रा 1 सी-एफ और चित्रा एस 1) के एक सेट में सभी सेल आंदोलन निशान का एक ओवरले, और उत्थान की शुरुआत के बाद से घंटे तक तैरने की गति का एक भूखंड (चित्रा 2 सी)। स्टेंटर की आबादी, जो सामान्य रूप से पुनर्जीवित हो रही है, को दिशाहीन तैराकी से निर्देशित तैराकी (चित्रा 1 जी) तक एक स्थिर संक्रमण प्रदर्शित करना चाहिए। जबकि प्रत्येक कोशिका ~ 8 घंटे तक फैले ओए पुनर्जनन प्रक्रिया के दौरान पूर्ण रूप से इस संक्रमण से गुजरती है, व्यक्तियों के बीच भिन्नता प्रवृत्तियों को स्पष्ट होने के लिए कुल मिलाकर एक बड़ी आबादी के आंदोलन को देखने की आवश्यकता होती है।
चित्रा 1 सी-एफ ओए पुनर्जनन प्रक्रिया में 2, 3, 7 और 8 घंटे पर स्टेंटर कोशिकाओं की एक ही आबादी की सामूहिक गतिशीलता दिखाता है। ये भूखंड गतिशील व्यक्तियों की संख्या में अपेक्षित वृद्धि (दृश्य निशान की संख्या) और आबादी (रेडियल विस्थापन) के भीतर सबसे अधिक गतिशील कोशिकाओं की सीमा में चार गुना वृद्धि दोनों दिखाते हैं। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि कुल्हाड़ियों चित्रा 1 सी-एफ के विभिन्न पैनलों के बीच अलग-अलग हैं, जिसमें 1 मिमी (घंटा 2), 2 मिमी (घंटे 3 और 7), और 4 मिमी (घंटा 8) गति को प्रदर्शित करने के लिए सबसे उपयुक्त के रूप में चुना गया है। 2 घंटे पर- सबसे शुरुआती समय बिंदु- कोई भी कोशिकाएं 10 एस वीडियो के दौरान 1 मिमी से अधिक नहीं चलती हैं, जबकि 9 घंटे में, कई कोशिकाएं समान लंबाई के दौरान 5 मिमी से अधिक पार करती हैं। पूरक चित्रा एस 1 पूर्णकालिक चूक के लिए इन भूखंडों को प्रदान करता है, एक सफल प्रयोग में गतिशीलता की अपेक्षित वृद्धि का स्पष्ट दृश्य देने के लिए सभी भूखंडों में उपयोग किए जाने वाले समान कुल्हाड़ियों के साथ।
भूखंडों की इस उदाहरण श्रृंखला की व्याख्या के लिए एक चेतावनी है। सबसे तेज़ तैराकी कोशिकाएं वीडियो के भीतर कुएं में तैरने में सक्षम थीं, खासकर अगर (संयोग से) वे किनारे के करीब शुरू हुईं; इस प्रकार वे पूरी तरह से एक सीधी रेखा में तैरने से प्रतिबंधित हैं, और उनकी आंदोलन सीमा, जैसा कि इस तरह से कल्पना की गई है, छोटी दिखाई देगी। हालांकि यह कोशिकाओं द्वारा यात्रा की गई दूरी को मापने के किसी भी प्रयास को जटिल बनाता है, यह गुणात्मक प्रवृत्ति को नहीं बदलता है कि आंदोलन की सीमा कम से कम 8 घंटे से अधिक बढ़ जाती है। यह ज्ञात रूपात्मक उत्थान समयरेखा (चित्रा 2 ए) 3 के अनुरूप है।
जनसंख्या के आंकड़ों को संकलित करने के लिए, ट्रैक की गई कोशिकाओं को तीन अलग-अलग श्रेणियों में वर्गीकृत किया गया था: बिना किसी दृश्यमान होल्डफास्ट के गैर-मोटाइल, दृश्यमान होल्डफास्ट के साथ गैर-मोटाइल और मोटाइल। व्यवहार की इन श्रेणियों को पहले टार्टर द्वारा परिभाषित किया गया था, लेकिन समय के साथ उनके प्रसार के लिए कभी मात्रा निर्धारित नहीं कीगई थी 3. चित्रा 2 बी उत्थान में घंटों के एक समारोह के रूप में इन श्रेणियों में रिश्तेदार सेल गिनती सारांशित एक स्टैक्ड हिस्टोग्राम दिखाता है। हर समय बिंदुओं पर, आधे से अधिक सेल आबादी अवलोकन योग्य रूप से गतिशील नहीं थी। इसके अतिरिक्त, बाद के समय में, कोशिकाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या दृश्यमान होल्डफास्ट के साथ उपनिवेशों में पाई गई, दृढ़ता से सुझाव देते हुए कि उन्होंने पर्यावरण का पता लगाया था और अधिमानतः अपनी तरह के दूसरों के पास संलग्न थे। इसका एक उदाहरण चित्रा 2 सी के अंतिम इनसेट में देखा जा सकता है।
यह परख गतिशीलता वसूली के प्रत्येक चरण के दौरान तैरने की गति की सांख्यिकीय तुलना के लिए अनुमति देता है। चित्रा 2 सी में प्रस्तुत आंकड़ों के लिए माध्य और मानक विचलन नीचे संक्षेप में प्रस्तुत किया गया है (तालिका 1)। एक बार जब इन सांख्यिकीय मात्राओं को सेल ट्रैकिंग द्वारा निकाला जाता है, तो विभिन्न चरणों में कोशिकाओं की आबादी द्वारा प्रदर्शित गति की तुलना अप्रकाशित टी-टेस्ट का उपयोग करके कड़ाई से की जा सकती है। एक ठोस उदाहरण के रूप में, दिखाए गए आंकड़ों के लिए, चरण 1 और चरण 2 में तैरने की गति की तुलना करने वाले टी-सांख्यिकी की गणना किसके द्वारा की जाती है:
जहां एक्स1 और एक्स2 क्रमशः चरण 1 और 2 के दौरान औसत गति को दर्शाते हैं; एस1 और एस2 क्रमशः चरण 1 और 2 के दौरान गति के मानक विचलन को दर्शाते हैं; एन1 और एन2 और क्रमशः चरण 1 और 2 के दौरान निकाले गए निशान की संख्या को दर्शाते हैं। परिणामी टी-सांख्यिकीय टी12 को परिकल्पना परीक्षण के लिए पी-मान में अनुवादित किया जा सकता है। चित्रा 2 सी में दिखाए गए आंकड़ों के लिए, चरण 1 से चरण 2 (पी < 0.1%) और चरण 2 से चरण 3 (पी < 0.1%) तक संक्रमण सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण हैं, जबकि चरण 3 से चरण 4 (पी > 20%) तक संक्रमण नहीं है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि चरण 4 (चित्रा 2 बी, इनसेट) के दौरान कोशिकाओं को छोटी कॉलोनियों में बसने की प्रवृत्ति, जैसा कि कच्चे वीडियो में स्पष्ट है, व्यवहार अंतर का एक उदाहरण है जो अकेले तैरने की गति के माप से अच्छी तरह से कब्जा नहीं किया गया है। यह चरण 4 (0.26 मिमी / सेकंड) के दौरान मापा गया बड़ा मानक विचलन बताता है, जिसने बदले में चरण 3 के खिलाफ तुलना करते समय कम टी-सांख्यिकी में योगदान दिया।
चित्रा 1: सेल ट्रैकिंग निर्देशित तैराकी की क्रमिक वसूली का पता चलता है( ए) सुक्रोज सदमे स्टेंटर कोरूलस को झिल्लीदार बैंड शेड करने के लिए प्रेरित करता है। (बी) कुएं में हवा के बुलबुले का संकेत धारीदार हलकों के साथ एक 10 एस वीडियो में कोशिकाओं को पुनर्जीवित करने का उदाहरण ट्रैकिंग परिणाम। (सी-एफ) 2 घंटे, 3 घंटे, 7 घंटे और 8 घंटे पर सभी प्रक्षेपवक्रों का ओवरले। डेटा के संकलन के दौरान टाइम्स को निकटतम घंटे तक गोल किया गया था। बिंदीदार हलकों एक मिलीमीटर के रेडियल विस्थापन का संकेत मिलता है। (जी) सेल गतिशीलता दिशाहीन तैराकी से विकसित होती है जो लघु परिपत्र प्रक्षेपवक्रों की विशेषता होती है ताकि लंबे साइनसोइडल प्रक्षेपवक्रों की विशेषता वाले निर्देशित तैराकी हो सके। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: मोटाइल उप-जनसंख्या ओए पुनर्जनन के माध्यम से व्यवहार के चार अलग-अलग चरणों को दर्शाती है। (ए) स्टेंटर पुनर्जनन की आकृति विज्ञान। (बी) प्रत्येक समय कोशिकाओं की सामान्यीकृत गिनती जो (नीली) गतिशील नहीं थी, जिसमें कोई दृश्यमान होल्डफास्ट नहीं था; (नारंगी) गतिशील नहीं, दृश्यमान होल्डफास्ट के साथ; (हरा) मोटाइल। कई डेटासेट जो घंटों के विभिन्न सबसेट को फैलाते हैं, इस आंकड़े के लिए संयुक्त थे, इसलिए प्रति घंटे कुल सेल गिनती 57 से 376 से अधिक थी। किंवदंती मैजेंटा और हरे रंग में झूठे रंग द्वारा कल्पना के रूप में प्रत्येक श्रेणी के तहत प्रतिनिधि कोशिकाओं को दिखाती है। (सी) तैरने की गति का बॉक्सप्लॉट; बक्से हरे रंग में इंगित औसत मूल्य के साथ प्रत्येक समय क्यू 1 से क्यू 3 चतुर्थक मूल्यों तक विस्तारित होते हैं। स्कैटर ओवरले प्रत्येक गतिशील सेल की औसत गति है। इनसेट चार चरणों में से प्रत्येक के दौरान प्रतिनिधि जनसंख्या व्यवहार दिखाता है। संक्षिप्त नाम: ओए = मौखिक उपकरण; क्यू 1 = पहला चतुर्थक; Q3 = तीसरा चतुर्थक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: फेनोटाइप स्क्रीनिंग टूल के रूप में गतिशीलता विश्लेषण के लिए बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। (ए, बी) 12 घंटे में दो कुओं से ट्रैकिंग परिणाम (सी, डी) 18 घंटे में एक ही दो कुओं से ट्रैकिंग परिणाम स्टेंटर कोशिकाएं क्लस्टर में संलग्न करने की प्राथमिकता प्रदर्शित करती हैं, कुछ कुओं के साथ दूसरों की तुलना में घंटों पहले कॉलोनियों में बसजाते हैं। धारीदार क्षेत्र कुएं में हवा के बुलबुले का संकेत देते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| माध्य (मिमी/सेकंड) | मानक विचलन (मिमी / | |
| चरण 1 | 0.14 | 0.24 |
| दूसरा चरण | 0.06 | 0.13 |
| तीसरा चरण | 0.16 | 0.16 |
| चौथा चरण | 0.15 | 0.26 |
तालिका 1: गतिशीलता वसूली के प्रत्येक चरण के दौरान तैरने की गति की तुलना।
पूरक चित्रा एस 1: उत्थान और उससे आगे के माध्यम से जनसंख्या तैराकी पैटर्न। (ए-एम) मौखिक उत्थान की दीक्षा के बाद स्टेंटर कोएरुलस कोशिकाओं की गति क्रमशः 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16 और 18 घंटे। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक वीडियो 1-3: स्क्रिप्ट डिबगिंग के लिए एस कोएरुलस के उदाहरण माइक्रोस्कोपी वीडियो। प्रोटोकॉल की धारा 5 स्क्रिप्ट सही ढंग से चल रहे हैं कि एक त्वरित पुष्टि के लिए तीन डेटा वीडियो के इस सेट पर किया जा सकता है। इसके अलावा, ये वीडियो डेटा वीडियो के लिए कंट्रास्ट और रिज़ॉल्यूशन आवश्यकताओं का एक ठोस उदाहरण प्रदान करते हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक फ़ाइलें: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
कई कण और सेल ट्रैकिंग एल्गोरिदम वर्तमान में मौजूद हैं, कुछ पूरी तरह से मुक्त हैं। लागत और उपयोगकर्ता-मित्रता अक्सर व्यापार-नापसंद होते हैं जिन्हें समझौता करने की आवश्यकता होती है। इसके अतिरिक्त, कई मौजूदा सेल-ट्रैकिंग कार्यक्रमस्टेंटर की तेज तैराकी गति के बजाय टिशू कल्चर कोशिकाओं की धीमी रेंगने की गति को ट्रैक करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं, जो तैराकी करते समय घूमता है और दिशा के अचानक परिवर्तन से गुजर सकता है। इनमें से कई विकल्पों का परीक्षण करने के बाद, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य केवल कम लागत वाले उपकरण और एक वैज्ञानिक सॉफ़्टवेयर पैकेज (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके डेटा अधिग्रहण से डेटा विज़ुअलाइज़ेशन तक सभी तरह से जाने के लिए एक-स्टॉप समाधान होना है। यह शिक्षण-केंद्रित संस्थानों या बायोफिजिक्स शिक्षण प्रयोगशालाओं में अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए विशेष रुचि रखता है जहां अधिकांश आवश्यक उपकरण पहले से ही उपलब्ध हैं, क्योंकि यह छात्रों के लिए अपने स्वयं के प्रश्न पूछने और थोड़े समय के भीतर मात्रात्मक परिणामों पर पहुंचने की बाधा को कम करता है।
इस पांडुलिपि में प्रस्तुत विधि को मिलीमीटर आकार के पैमाने पर सौ माइक्रोन में जीवों की आबादी की गतिशीलता को मात्रात्मक रूप से चिह्नित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। छोटे या बड़े जीवों के लिए आवेदन के लिए वीडियो डेटा प्राप्त करने के तरीके में बदलाव की आवश्यकता होगी। जैसा कि यहां एस कोएरुलस को पुनर्जीवित करने की आबादी पर लागू होता है, इस प्रोटोकॉल ने सेल आबादी में गतिशीलता की कार्यात्मक वसूली के लिए एक समयरेखा उत्पन्न की, जो वर्तमान में ट्रांसक्रिप्शनल टाइमलाइन के बारे में क्या जाना जाता है। उदाहरण के लिए, आरएनए अनुक्रमण से यह ज्ञात है कि सिलिअरी गतिशीलता प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले जीन का संश्लेषण पुनर्जनन प्रक्रिया में कई घंटों तक नहीं होता है,सिलिया के गठन के लंबे समय बाद 9,10। ऊपर प्रदर्शित घंटे 0-3 (चरण 1) से घंटे 4 (चरण 2) तक गतिशीलता में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण गिरावट सिलिअरी असेंबली में शामिल जीन की अभिव्यक्ति की तुलना में सिलिअरी गतिशीलता कारकों की अभिव्यक्ति में इस अंतराल के अनुरूप है। स्टेंटर पुनर्जनन का आज तक कोई ट्रांसक्रिप्टोमिक अध्ययन नौ घंटे से परे नहीं किया गया था, इसलिए जीनोमिक गतिविधि के बारे में बहुत कम जानकारी है। घंटे 8-10 (चरण 3) और घंटे 11+ (चरण 4) के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर की कमी से पता चलता है कि कोशिकाएं इस समय तक पूरी तरह से पुनर्जीवित हो गई हैं, और सेल गतिशीलता के लिए प्रासंगिक कुछ जीनों को घंटे 9 से परे अलग-अलग विनियमित किया जाना चाहिए।
इस पद्धति की दो प्रमुख सीमाएं क्लस्टर और / या स्पर्श कोशिकाओं को ट्रैक करने में विफलता हैं, और तैरने की गति या प्रक्षेपवक्र की तुलना में गति के अधिक जटिल पहलुओं को मापने में असमर्थता है। सेल ट्रैकिंग एल्गोरिदम को उन कोशिकाओं का पालन करने में कठिनाई होती है जो अस्थायी रूप से किसी अन्य सेल द्वारा नेत्रहीन रूप से बाधित होती हैं, और जब कई कोशिकाएं निकटता में कई फ्रेम खर्च करती हैं; यहां शामिल स्क्रिप्ट अपवाद नहीं है। सौभाग्य से, पूर्व की आवृत्ति को प्रभावी ढंग से एक के अंदर रखी गई कोशिकाओं की संख्या को सीमित करके कम किया जा सकता है जैसा कि अगले पैराग्राफ में चर्चा की गई है। विशेष रूप से एस कोएरुलस आबादी के लिए यहां जांच की गई, कॉलोनियों (चित्रा 3) में बसने के लिए उनकी प्राथमिकता ने इनमें से कुछ कोशिकाओं को स्क्रिप्ट द्वारा पहचाना नहीं जाना चाहिए। हालांकि, जैसा कि ये सभी कोशिकाएं बिना किसी गति के बहुत कम प्रदर्शित करती हैं, गतिशील सेल आबादी पर आंकड़े अप्रभावित हैं। इसके अतिरिक्त, वीडियो जहां कई कोशिकाएं ट्रैकिंग से बचती हैं, उन्हें पहचानना और मैन्युअल रूप से आगे के विश्लेषण से बाहर करना आसान है। गति के जटिल पहलुओं की मात्रा का ठहराव के बारे में, पूरक चित्रा एस 1 में देखे गए दिशाहीन से निर्देशित तैराकी में संक्रमण दिशा, औसत त्वरण और संभावित रूप से अन्य मापने योग्य के समय सहसंबंध में मात्रात्मक परिवर्तन का सुझाव देता है। गति और सीमा, इस प्रोटोकॉल में विश्लेषण की गई एकमात्र मात्रा, गति के केवल एक छोटे से पहलू का प्रतिनिधित्व करती है।
अंत में, प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों व्यावहारिक उपयोग में विशेष महत्व या परिणाम के हैं। पतली सिलिकॉन शीट के साथ मल्टीवेल नमूना स्लाइड की असेंबली, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग 1 में वर्णित है, अभ्यास की आवश्यकता है। कवरग्लास के साथ नमूने को सील करते समय कम से कम एक कुएं में लीक या हवा के बुलबुले पेश करना आसान है। कुओं को छोटे कवरग्लास के उपयोग की अनुमति देने के लिए कई नमूना स्लाइडों पर विभाजित किया जा सकता है, जो प्रक्रिया को आसान बना देगा (और गलतियों को कम महंगा)। यद्यपि यहां प्रस्तुत परख का उपयोग एक ही समय बिंदु पर सेल आबादी की गतिशीलता पैटर्न को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन इसे लंबे समय तक चूक (10 घंटे से अधिक) में एक ही आबादी के गतिशीलता पैटर्न की तुलना करने के लिए एक उपकरण के रूप में यहां प्रदर्शित किया गया है। किसी भी लंबे समय तक चूक के साथ, गीले नमूने का वाष्पीकरण अपरिहार्य है। ग्लास स्लाइड और कवरस्लिप दोनों के लिए इमेजिंग चैंबर में सिलिकॉन स्पेसर की एक सुरक्षित मुहर द्वारा वाष्पीकरण को कम किया जा सकता है। ऐसा न करने पर कुएं एक-दूसरे में लीक हो जाएंगे या कुओं के अंदर हवा के बुलबुले बन जाएंगे। सिलिकॉन स्पेसर के उपयोग से अपरिचित शोधकर्ताओं के लिए, पास्चुरीकृत वसंत के पानी या अन्य स्वच्छ माध्यम को उपयोग से पहले रिसाव के लिए परीक्षण करने के लिए प्रत्येक कुएं में पाइप किया जाना चाहिए। नमूना कुओं के आयामों को एस कोएरुलस के लिए अच्छी तरह से काम करने के लिए चुना गया था, जो आकार में लगभग 1 मिमी हैं। इसमें सिलिकॉन स्पेसर मोटाई (दो आयामी विमान के लिए जांच के तहत एस कोएरुलस कोशिकाओं को विवश करने के लिए चुना गया), 5/16 "व्यास, और प्रति अच्छी तरह से 10 कोशिकाएं शामिल हैं। अन्य सेल प्रकारों के लिए इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करते समय इन संख्याओं को समायोजित किया जाना चाहिए।
ट्रैकसेल.एम स्क्रिप्ट में कई मापदंडों को स्वचालित सेल पहचान और ट्रेस सत्यापन को अनुकूलित करने के लिए ट्वीक किया जा सकता है। पैरामीटर मिनसेलएरिया और मैक्ससेलएरिया (स्क्रिप्ट की लाइनें 15 और 16) उपयोगकर्ता को वर्ग पिक्सेल में सेल के लिए आकार की स्वीकार्य सीमा निर्धारित करने की अनुमति देते हैं। कौन से मान सबसे अच्छे हैं, यह सेल आकार, कैमरा पिक्सेल आकार, आवर्धन सहित प्रयोग के कई विवरणों पर निर्भर करता है, और क्या ऐसी वस्तुएं हैं जिन्हें कोशिकाओं के रूप में गलत पहचाना जा सकता है, उदाहरण के लिए, हवा के बुलबुले। प्रोटोकॉल में प्रदान किए गए सटीक उपकरण और सेटिंग्स के लिए 300 और 1500 के डिफ़ॉल्ट मान इष्टतम थे। मिनसेल एरिया और मैक्ससेल एरिया को अनुकूलित करने के बाद, छवि विपरीत बदलने के लिए पैरामीटर थ्रेसहोल्ड (लाइन 17) को ट्यून करें। गलत तरीके से सेट होने पर, सेल की रूपरेखा खराब पहचानी जाएगी या पूरी तरह से याद की जाएगी, जिससे सही ट्रैकिंग में बाधा आएगी। यदि थ्रेशोल्ड का कोई मान सही ट्रैकिंग के लिए अच्छी तरह से काम नहीं करता है, तो उच्च कंट्रास्ट वाले वीडियो के साथ प्रयास करें या जो फोकस में अधिक है। स्क्रिप्ट की पंक्ति 218, bad_trks = ढूंढें (strk_trks > 20); उन निशानों को त्यागने के लिए जिम्मेदार है जो भविष्यवाणी की गई गति (कलमन फ़िल्टर के माध्यम से) से कई बार विचलित होते हैं। जैसा कि है, स्क्रिप्ट में 20 पर बहुत अधिक सेट के लिए यह सीमा है। अधिक आक्रामक रूप से निशान छोड़ने के लिए इस पूर्णांक मान को 1 तक घटाएँ। कम आक्रामक रूप से त्यागने के लिए मूल्य बढ़ाएं। ट्रैकसेलएसएम का अधिकांश हिस्सा मल्टी-ऑब्जेक्ट ट्रैकिंग ट्यूटोरियल से http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html पर स्वतंत्र रूप से सुलभ था, जिसे पाठक अधिक विस्तार से संदर्भित कर सकता था। पूरक वीडियो 1-3 स्क्रिप्ट के परीक्षण-रन के लिए उदाहरण डेटा वीडियो हैं।
खोए हुए ओए को पूरी तरह से पुनर्जीवित करने के लिए एस कोएरुलस की क्षमता पहली बार एक सदी पहले देखी गई है, फिर भी गतिशीलता और व्यवहार कि राज्यों की वसूली के बारे में कई खुले प्रश्न बने हुए हैं। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उद्देश्य ब्राइटफील्ड इमेजिंग, स्वचालित सेल पहचान और ट्रैकिंग, और डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के संयोजन को कम करना है, जो लेखकों को मात्रात्मक रूप से पुनर्जन्म स्टेंटर की आबादी की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए नियोजित करते हैं। यह वर्कफ़्लो मोटे तौर पर सामान्य रूप से गतिशीलता की जांच पर लागू होता है, और इसमें शामिल स्क्रिप्ट और प्रोटोकॉल को समान आकार और गति की अन्य जैविक प्रणालियों के साथ काम करने के लिए आसानी से अपनाया जा सकता है, उदाहरण के लिए, पैरामेसियम और ब्लेफेरिस्मा जैसे अन्य सिलिएट्स। इसके अलावा, इमेजिंग चैंबर को बदलना (उदाहरण के लिए, विभिन्न इमेजिंग आवर्धन के साथ युग्मित सूखे कुओं या विभिन्न आकार के कुओं का उपयोग करना) इस वर्कफ़्लो की प्रयोज्यता का विस्तार करता है। स्टेंटर के लिए वर्तमान टूल किट में सर्जिकल विच्छेदन, आसमाटिक सदमे, आरएनएआई, डीएनए / आरएनए विश्लेषण और छोटे अणु अवरोधक शामिलहैं। यहां प्रस्तुत गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने की उच्च-थ्रूपुट विधि लक्षण वर्णन की एक पूरक डिग्री जोड़ती है और गतिशीलता फेनोटाइप की जांच के लिए भविष्य के काम में उपयोग की जाएगी।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
इस काम को समुद्री जैविक प्रयोगशाला व्हिटमैन अर्ली कैरियर फैलोशिप (जेवाईएस) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था। हम प्रारंभिक विश्लेषण और कोड परीक्षण में से कुछ में मदद करने के लिए इवान बर्न्स, मिट पटेल, मेलानी मेलो और स्काईलर विडमैन को स्वीकार करते हैं। हम चर्चा और सुझावों के लिए मार्क स्लैबोनिक को धन्यवाद देते हैं। डब्ल्यूएफएम एनआईएच अनुदान आर 35 जीएम 130327 से समर्थन स्वीकार करता है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m |
References
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