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Biology

세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석

Published: April 26, 2021 doi: 10.3791/62352

Summary

우리는 밝은 필드 현미경 검사 및 세포 추적을 사용하여 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 세포 집단의 운동성과 행동을 특성화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 Stentor coeruleus 가 잃어버린 구강 장치를 재생할 때 네 가지 행동 적으로 별개의 단계를 통해 전환한다는 것을 보여줍니다.

Abstract

스텐터 코에룰루스 는 단세포 재생 연구를 위한 잘 알려진 모델 유기체이다. 개별 세포에 대한 전사체 분석은 재생 과정 전반에 걸쳐 단계적으로 차별적으로 조절되는 수백 개의 유전자 (많은 구강 장치 (OA)와 관련이없는 것으로 나타났습니다. 새로운 OA의 성장을 향한 세포 자원의 이러한 전신 재구성 및 동원이 차등 유전자 발현의 단계에 시간에 상응하는 이동 및 행동의 관찰 가능한 변화를 초래할 것이라는 가설이 제기되었다. 그러나 S. coeruleus 의 형태 학적 복잡성으로 인해 통계와 시간 척도를 포착하기위한 분석의 개발이 필요했습니다. 사용자 지정 스크립트를 사용하여 짧은 비디오에서 셀을 추적하고 통계가 많은 인구 (N ~ 100)에 걸쳐 컴파일되었습니다. OA를 잃으면 S. coeruleus 는 처음에는 지시 된 움직임에 대한 능력을 상실합니다. 그런 다음 ~ 4 h에서 시작하여 ~ 8 시간까지 속도가 크게 떨어집니다. 이 분석은 운동성 표현형의 스크리닝에 유용한 도구를 제공하며 다른 유기체의 조사에 적합 할 수 있습니다.

Introduction

스텐터 코에룰루스(Stentor)는 크기가 크고, 여러 미세수술 기술을 견딜 수 있는 능력, 실험실 세팅 1,2,3에서 배양의 용이성으로 인해 단세포 재생을 연구하는 데 사용되어 온 잘 알려진 모델 유기체이다. 초기 재생 연구는 스텐터 (Stentor)에서 가장 크고 형태 학적으로 구별되는 특징 인 OA에 초점을 맞추 었으며, 이는 화학 충격 4,5,6에 완전히 흘려집니다. 잃어버린 OA의 De novo 대체는 새로운 막질 밴드의 출현으로 시작됩니다 - 여덟 가지 형태 학적 단계3에 걸쳐 기능적 OA를 형성하기 전에 점차적으로 세포의 앞쪽으로 이동하는 섬모 배열. 이들 단계는 온도에 관계없이 순차적으로 관찰되었으며, 거의 모든 연구5에 대한 보편적인 기준점을 제공한다.

스텐터 재생의 기계론적 분석에는 화학 또는 분자 스크린의 일부로 여러 샘플에 적용할 수 있을 만큼 견고하고 간단한 재생 타이밍을 측정하기 위한 도구가 필요합니다. 세포 기반 분석을 수행하기 위한 표준 방법은 영상화이며, 이 경우, 재생 동안 새로운 OA의 형성을 이미징한다. 그러나, 이러한 영상-기반 분석은 재생성 구조가 마커로 사용될 수 있는 별개의 분자 성분을 함유할 때 가장 효과적이어서, 이들이 형광 이미지에서 쉽게 검출될 수 있도록 한다. 스텐터 OA의 경우에, 공지된 성분들(섬모, 기저체)은 또한 세포 표면의 나머지 부분에 존재한다; 따라서, OA의 복원을 인식하는 것은 단순히 구성요소의 존재 또는 부재를 찾는 것만으로는 달성될 수 없다.

오히려, OA를 검출하기 위해서는 어떤 형태의 형상 인식이 필요할 것이며, 스텐 세포가 종종 빠른 수축 과정을 통해 형태를 변화시킨다는 사실을 감안할 때 이것은 잠재적으로 매우 도전적입니다. 이 논문은 신체 및 OA 섬모의 운동성 활성에 의존하는 재생을위한 대체 분석을 제시합니다. OA가 재생됨에 따라, 새로 형성된 섬모는 위치와 활성의 재현 가능한 변화를 겪으며, 이는 차례로 세포의 수영 운동성에 영향을 미칩니다. 운동성을 분석함으로써, 재생된 구조물의 기능을 정량화함으로써 재생을 정량화하는 "기능적 재생"에 대한 분석을 수행할 수 있다. 재생 중 스텐터 섬모 함수의 이전 분석은 재생7의 여러 단계에서 흐름 패턴의 변화를 관찰하기 위해 외부 매체에 추가 된 트레이서 비드와 결합 된 입자 이미지 속도 측정을 사용했습니다. 그러나이 접근법은 개별 세포 및 관련 유동 필드를 한 번에 하나씩 힘들게 이미징해야합니다.

세포 자체의 움직임을 섬모 생성 흐름의 프록시로 사용함으로써, 고처리량 스크리닝 플랫폼과 호환되는 저해상도 이미징 시스템을 사용하여 더 많은 수의 세포를 병렬로 분석할 수 있을 것이다. 이 분석은 원칙적으로 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 다른 수영 생물에서 발달 및 기능적 재생을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 1은 멀티웰 샘플 슬라이드의 구축을 설명하며, 이는 최대 하루 종일 세포 집단의 높은 처리량 이미징을 허용합니다. 다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 조정하는 방법에 대한 세부사항이 제공된다. 프로토콜의 섹션 2는 디지털 단일 렌즈 반사 카메라를 사용하여 해부 현미경에서 수행 할 수있는이 분석을위한 비디오 데이터의 수집을 다룹니다. 프로토콜의 섹션 3에서는 MATLAB 코드(추가 정보)를 사용한 셀 추적 및 셀 속도 계산에 대한 연습을 제공합니다. 프로토콜의 섹션 4에서는 결과를 쉽게 해석할 수 있도록 그림 1C-F그림 2C와 같이 수치 결과를 플롯으로 변환하는 방법을 설명합니다.

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Protocol

주: 대략 백 개의 S. 코에룰루스 세포의 집단을 이전에 공개된 JoVE 프로토콜8에 따라 배양하였다.

1. 시료 준비

  1. 250 μm 두께의 실리콘 스페이서 시트 (재료 표)의 조각을 현미경 슬라이드보다 높이와 너비 모두에서 약간 작게 자릅니다. 5/16" 구멍 펀치를 사용하여 원형 웰을 만듭니다. 좋은 밀봉을 보장하기 위해 이웃 우물 사이에 충분한 공간을 남겨 두는 것에 유의하십시오.
    참고: 이웃 우물 사이에 3mm의 공간이 충분한 것으로 확인되었습니다. 연습을 통해 열 개의 웰을 단일 샘플 슬라이드에 배치 할 수 있습니다.
  2. 세포를 2분 동안 10% 수크로오스 또는 2% 우레아에서 인큐베이션함으로써 OA의 재생을 개시한다(도 1A). 그런 다음 신선한 배지8로 세 번 씻으십시오. 각 웰에 약 열 개의 스텐터를 부드럽게 피펫하십시오. 샘플 부피를 웰 볼륨과 가능한 한 가깝게 일치시키는 것을 조심하십시오.
    참고: 여기에 사용된 웰 치수에 대해, 12.5 μL의 샘플을 각 웰 내로 피펫팅하였다.
  3. 한쪽 가장자리에서 시작하여 웰 위에 커버 글라스 조각 ( 재료 표 참조)을 부드럽게 낮추어 웰을 닫습니다. 10μL 피펫 팁과 같이 좁고 약간 유연한 물체를 사용하여 실리콘 시트와 접촉하는 커버 글라스를 눌러 밀봉을 잘 하십시오.

2. 가시 광선 현미경 검사 시간 경과

  1. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 배율을 사용 가능한 가장 낮은 크기로 설정하여 하나의 웰이 프레임 전체에 맞도록 합니다.
    참고: 이 프로토콜의 현미경에는 1.6x 카메라 어댑터와 목표의 1x 배율이 사용되었습니다.
  2. 타임랩스를 시작합니다. 각 시점에서 각 웰의 초당 30프레임에서 10초 비디오를 획득합니다. 전동 X-Y 스테이지가 있는 현미경 설정을 사용하는 경우 전체 타임랩스를 자동화합니다. 그렇지 않으면 사용자가 각 시점에 있는지 확인하여 샘플을 수동으로 변환하여 각 웰을 기록하십시오.
    참고: 가열 및 증발을 피하기 위해 이미징하지 않을 때 샘플을 비추지 마십시오. 샘플 부피는 작으며 증발은 기포로 이어집니다.
  3. 동영상을 TIFF, MOV 또는 AVI로 저장합니다.
    참고: 가장 일반적인 비독점 비디오 파일 형식입니다. 특정 현미경 소프트웨어에 따라 비디오는 기본적으로 독점 파일 형식으로 저장 될 수 있지만 앞서 언급 한 파일 형식 중 하나로 내보낼 수 있습니다.
  4. 물리적 스케일을 위해 픽셀-밀리미터 변환 계수를 사용하고, 캘리브레이션을 수행하거나 사용된 카메라에서 알려진 픽셀 크기를 사용합니다. 보정하려면 비디오와 동일한 배율 설정에서 보정 슬라이드의 선명한 이미지 또는 선명한 눈금자를 얻습니다. 이미지 보기 프로그램을 사용하여 알려진 물리적 거리의 마크 사이의 픽셀 수를 계산합니다.
    참고: 예를 들어, 눈금자의 이미지에 1mm 표시와 2mm 표시가 100픽셀로 구분되는 경우 변환 계수는 100픽셀당 1mm입니다. 또는 카메라 픽셀 크기에서 이 요소를 파생시키려면 카메라 픽셀 크기에 배율을 곱하면 됩니다. 예를 들어, 사용된 카메라의 픽셀이 3.45μm이고 사용된 배율이 1.6배인 경우 변환은 1픽셀당 3.45μm * 1.6 = 5.52μm입니다.

3. 세포 추적

  1. TrackCells.m과 CleanTraces.m이라는 두 스크립트를 컴퓨터의 기억하기 쉬운 위치에 다운로드합니다. 데이터 비디오가 아직 이 컴퓨터에 없으면 이 컴퓨터로 전송하십시오.
    참고: 데이터 비디오와 스크립트는 동일한 폴더에 있을 필요가 없습니다.
  2. 데이터 비디오를 각 시간대마다 하나씩 폴더로 구성합니다. 먼저 스크립트 TrackCells.m 을 사용하여 데이터 비디오에서 자동화된 셀 추적을 수행합니다. TrackCells.m을 열고 스크립트를 실행합니다.
  3. 팝업 창이 나타나면 경로에 추가 를 선택합니다.이 옵션은 일반적으로 스크립트가 지정된 폴더에서 처음 실행될 때만 발생합니다. 메시지가 표시되면 추적을 시작할 하나 이상의 데이터 비디오를 선택하고 데이터 비디오로 이동합니다(섹션 2). Shift 클릭, 컨트롤 클릭 또는 마우스 왼쪽 버튼을 누른 채 파일 위로 이동하여 강조 표시하여 여러 비디오 파일을 선택합니다.
  4. 프롬프트 창 하단의 파일 이름 : 상자에있는 파일 목록에 만족하면 열기를 클릭하십시오. 먼저 한 비디오에서 테스트 실행을 수행하여 모든 매개 변수가 올바르게 설정되었는지 확인합니다(아래 설명 참조).
    참고: 이 스크립트는 이제 선택한 각 비디오 파일에 대한 폴더를 만듭니다. 그런 다음 비디오의 각 프레임을 .jpg 파일과 비디오에있는 모든 흔적을 포함하는 position_estimates.mat라는 파일로이 폴더에 씁니다. 비디오 크기, 비디오 수 및 컴퓨터 속도에 따라 이 스크립트를 실행하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.

4. 추적 확인

  1. 계속하기 전에 오류 메시지가 없는지 확인하여 섹션 3에 설명된 단계를 올바르게 수행했는지 확인합니다. CleanTraces.m 스크립트를 사용하여 변칙적이거나 잘못된 추적을 수동으로 거부합니다. 파일을 두 번 클릭하여 MATLAB 편집기 창에서 CleanTraces.m을 엽니다.
  2. 프롬프트에서 TrackCells.m으로 출력 된 데이터 폴더 선택. 비디오 파일과 동일한 이름을 가지며 섹션 3에 설명 된대로 생성 된 폴더 중 하나로 이동합니다. 폴더를 하나만 선택합니다.
    참고: 이 스크립트는 이제 팝업 창에 추적을 하나씩 표시합니다. 추적이 시작되는 비디오 프레임에 녹색으로 겹쳐져 있고 추적이 끝나는 비디오 프레임의 프레임에 자홍색으로 겹쳐져 있습니다. 따라서 유효한 추적은 녹색 셀과 마젠타 셀을 연결해야 합니다.
  3. 메시지가 표시되면 추적을 유지하려면 1을 입력하고 추적을 거부하려면 0 입력합니다. Enter 키를 눌러 다음 추적으로 이동합니다.
    참고: 더 이상 추적이 없거나 처음 육십 개가 표시될 때까지 새 추적이 계속 표시됩니다. 이 프로세스가 완료되면 스크립트는 출력을 저장하기 위해 CLEAN TRACES 라는 폴더를 자동으로 만들고 나머지 모든 추적을 비디오의 첫 번째 프레임 위에 표시합니다(그림 1B). 이 이미지는 나중에 참조할 수 있도록 자동으로 LabeledTraces.png 로 저장됩니다. 사용자가 보관하도록 선택한 모든 추적은 clean_traces.mat 파일에 저장됩니다.
  4. 계속하기 전에 한 시점의 모든 비디오에 대해이 단계를 완료하십시오.
    참고: 이 원고의 데이터에 대해, 각 시점에서 각 웰에 대해 하나의 비디오를 획득하여 시간대당 총 열 개의 비디오를 획득했습니다.

5. 데이터 시각화

참고: 서로 다른 시간대에 걸쳐 전체 세포 집단의 운동성을 시각적으로 비교하기 위해 섹션 4의 모든 트레이스를 원점에서 시작하여 각 시점에 대해 하나의 방사형 변위 대 시간 플롯을 생성하도록 변환되었습니다(그림 1C-F, 모든 시점에 대한 보충 그림 S1 참조).

  1. SpaghettiPlots.m이라는 제목의 스크립트를 다운로드하여 시작하십시오. 스크립트를 열고 실행합니다. 그래프로 웰 데이터(clean_traces.mat)가 포함된 시간 폴더 선택 프롬프트와 함께 창 파일 브라우저 창이 나타나면 시점 중 하나의 폴더로 이동합니다. 이 폴더에는 분석된 각 비디오에 대한 폴더가 포함되어 있어야 합니다.
  2. 보정: 밀리미터당 픽셀 수는 얼마입니까?라는 메시지가 표시되면 2.4단계에서 찾은 보정 값을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.
    참고: 이제 스크립트는 이 시점에서 분석된 모든 비디오의 추적을 단일 플롯으로 결합합니다(그림 1C-F). 플롯에서 희미한 점선으로 표시된 원은 1, 2, 3 및 4mm의 방사상 변위를 나타냅니다.
  3. 스크립트의 행 55를 변경하여 필요에 따라 플롯의 축을 조정합니다.이 줄은 기본적으로 최대 4mm의 반지름을 포함하여 rr = 4로 설정됩니다. 플롯을 저장합니다.

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Representative Results

이 분석의 목표는 큰 (N ~ 100) 재생 스텐터 집단 내에서 세포로부터의 이동 패턴의 점진적 변화와 이동 속도의 단계적 증가를 정량화하는 것입니다. 결과 해석을 돕기 위해 이 프로토콜에 포함된 사용자 지정 코드는 비디오 데이터 집합의 모든 셀 이동 추적의 오버레이(그림 1C-F그림 S1)와 재생성 시작 이후 시간별 수영 속도 플롯의 두 가지 유형의 플롯을 생성합니다(그림 2C). 정상적으로 재생되는 스텐터 인구는 방향없는 수영에서 방향 수영으로의 꾸준한 전환을 입증해야합니다 (그림 1G). 각 세포는 ~ 8 h에 걸친 OA 재생 과정 동안이 전이를 완전히 겪지 만, 개인 간의 변화는 추세가 명확 해지기 위해 총체적으로 큰 집단의 움직임을 볼 필요가 있습니다.

1C-F는 OA 재생 과정 내로의 2, 3, 7, 및 8 h에서의 스텐터 세포의 동일한 집단의 집단적 운동성을 보여준다. 이 플롯은 운동 개체 수의 예상 증가 (가시적 인 흔적의 수)와 집단 내에서 가장 운동성 세포의 범위의 네 배 증가 (방사형 변위)를 보여줍니다. 그림 1C-F의 서로 다른 패널 간에 축이 다르며 동작을 보여주기 위해 가장 적합한 것으로 1mm(시간 2), 2mm(시간 3 및 7) 및 4mm(시간 8)가 선택되어 있습니다. 가장 빠른 시점인 2시간에서는 10초 비디오 동안 1mm 이상 움직이는 셀이 없는 반면, 9시간에서는 많은 셀이 동일한 시간 동안 5mm 이상을 횡단했습니다. 보충 그림 S1은 성공적인 실험에서 예상되는 운동성 증가에 대한보다 명확한 시각을 제공하기 위해 모든 플롯에서 동일한 축을 사용하여 전체 시간 경과에 대한 이러한 플롯을 제공합니다.

이 예제 일련의 플롯의 해석에 대한주의 사항이 하나 있습니다. 가장 빠른 수영 셀은 비디오 내에서 우물을 가로 질러 수영 할 수 있었고, 특히 (우연히) 가장자리에 가깝게 시작한 경우; 따라서 그들은 완전히 직선으로 수영하는 것이 제한되며, 이런 식으로 시각화 된 것처럼 운동 범위가 작아 보일 것입니다. 이것은 세포에 의해 이동 거리를 정량화하려는 시도를 복잡하게 만들지만, 적어도 8 시간 동안 운동 범위가 증가하는 질적 인 추세를 바꾸지는 않습니다. 이는 공지된 형태학적 재생 타임라인(그림 2A)3과 일치한다.

집단 통계를 컴파일하기 위해, 추적된 세포는 세 가지 별개의 범주로 분류되었다: 눈에 보이는 홀드패스트가 없는 비운동성, 가시적인 홀드패스트가 없는 비운동성, 그리고 모타일. 이러한 행동 범주는 이전에 Tartar에 의해 정의되었지만 시간3에 따른 유병률에 대해 정량화되지 않았습니다. 도 2B 는 재생성으로의 시간의 함수로서 이들 카테고리들에 걸친 상대적 셀 카운트들을 요약하는 누적된 히스토그램을 도시한다. 모든 시점에서, 세포 집단의 절반 이상은 관찰가능하게 운동성이 없었다. 또한, 나중에는 눈에 보이는 홀드 패스트가있는 콜로니에서 상당수의 세포가 발견되었으며, 이는 그들이 환경을 탐구하고 다른 종류의 다른 사람들 근처에 우선적으로 부착되었음을 강력하게 시사합니다. 이것의 예는 도 2C의 최종 인셋에서 볼 수 있다.

이 분석은 운동성 회복의 각 단계 동안 수영 속도의 통계적 비교를 허용합니다. 도 2C 에 제시된 데이터에 대한 평균 및 표준 편차는 아래에 요약되어 있다(표 1). 일단 이러한 통계적 양이 세포 추적에 의해 추출되면, 상이한 상들에서 세포들의 집단에 의해 나타나는 움직임은 짝을 이루지 않은 t-검정을 사용하여 엄격하게 비교될 수 있다. 구체적인 예로서, 도시된 데이터에 대해, 단계 1과 단계 2에서의 수영 속도를 비교하는 t-통계량은 다음과 같이 계산된다:

Equation 1

여기서 x1x2는 각각 단계 1 및 2 동안의 평균 속도를 나타내고; s1s2는 각각 단계 1 및 2 동안의 속도의 표준 편차를 나타내고; n1n2 각각 단계 1 및 2 동안 추출된 트레이스의 수를 나타낸다. 그 후, 결과적인 t-통계량 t12는 가설 검정을 위한 p-값으로 변환될 수 있다. 도 2C에 도시된 데이터의 경우, 단계 1에서 단계 2로의 전이 (p < 0.1 %)와 단계 2에서 단계 3 (p < 0.1 %)으로의 전환은 통계적으로 유의한 반면, 단계 3에서 상 4 (p > 20 %)로의 전환은 그렇지 않다. 원시 비디오에서 알 수 있듯이 4 단계 (그림 2B, inset) 동안 세포가 작은 식민지로 정착하는 경향은 수영 속도의 측정만으로는 잘 포착되지 않는 행동 차이의 한 예라는 점에 유의해야합니다. 이것은 4 단계 (0.26 mm / s) 동안 측정 된 큰 표준 편차를 설명하며, 이는 3 단계와 비교할 때 더 낮은 t- 통계량에 기여했습니다.

Figure 1
그림 1: 세포 추적은 지시된 수영의 점진적인 회복을 보여준다. (A) 수크로오스 쇼크는 스텐터 코에룰루스가 막형 밴드를 흘리도록 유도한다. (b) 웰 내의 기포를 나타내는 줄무늬 원이 있는 10 s 비디오에서 세포를 재생시키는 실시예 추적 결과. (C-F) 2h, 3h, 7h 및 8h에서 모든 궤적의 오버레이. 시간은 데이터 컴파일 중에 가장 가까운 시간으로 반올림되었습니다. 점선으로 표시된 원은 한 밀리미터의 방사형 변위를 나타냅니다. (G) 세포 운동성은 짧은 원형 궤적을 특징으로 하는 방향없는 수영에서 긴 정현파 궤적을 특징으로 하는 지시된 수영으로 진화한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: Motile 하위 집단은 OA 재생을 통해 행동의 네 가지 별개의 단계를 보여줍니다 . (A) 스텐터 재생의 형태학. (B) (파란색) 운동성이 아니었고 눈에 보이는 홀드패스트가 없는 각각의 시간에 세포의 정규화된 카운트; (주황색) 운동성이 아니며 눈에 보이는 홀드 패스트가 있습니다. (녹색) 모타일. 이 수치에 대해 서로 다른 시간 하위 집합에 걸쳐 있는 여러 데이터 세트가 결합되었으므로 시간당 총 셀 수는 57개에서 376개 이상이었습니다. 범례는 각 범주 아래의 대표 세포를 자홍색과 녹색으로 거짓 색상으로 시각화 한 것으로 보여줍니다. (C) 수영 속도의 박스 플롯; 상자는 매번 Q1에서 Q3 사분위수 값으로 확장되며 중앙값은 녹색으로 표시됩니다. 산란 오버레이는 각 모타일 셀의 평균 속도입니다. Inset은 네 단계 각각에서 대표적인 모집단 행동을 보여줍니다. 약어: OA = 구강 장치; Q1 = 첫 번째 사분위수; Q3 = 세 번째 사분위수. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: 표현형 스크리닝 도구로서의 운동성 분석에는 많은 수의 세포가 필요합니다 . (A, B) 12시간에서 두 웰의 추적 결과. (C, D) 18h에서 동일한 두 웰의 추적 결과. 스텐터 세포는 클러스터에 부착하는 것을 선호하며, 일부 웰은 다른 웰보다 몇 시간 더 빨리 콜로니로 정착합니다. 줄무늬 영역은 우물에 기포가 있음을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

평균(mm/s) 표준 편차(mm/s)
1단계 0.14 0.24
2단계 0.06 0.13
3단계 0.16 0.16
4단계 0.15 0.26

표 1 : 운동성 회복의 각 단계 동안의 수영 속도 비교.

보충 그림 S1 : 재생과 그 이상을 통한 인구 수영 패턴. (A-M스텐터 코에룰루스 세포의 움직임은 구강 장치 재생의 개시 후 각각 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 16, 및 18 h이다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 비디오 1-3 : 스크립트 디버깅을위한 S. coeruleus의 현미경 검사 비디오 예. 프로토콜의 섹션 5는 스크립트가 올바르게 실행되고 있는지 빠르게 확인하기 위해 이 세 개의 데이터 비디오 세트에서 수행할 수 있습니다. 또한 이러한 비디오는 데이터 비디오에 대한 대비 및 해상도 요구 사항의 구체적인 예를 제공합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

추가 파일: 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

많은 입자 및 세포 추적 알고리즘이 현재 존재하며 일부는 완전히 무료입니다. 비용과 사용자 친화성은 종종 타협이 필요한 절충안입니다. 또한, 기존의 많은 세포 추적 프로그램은 수영하는 동안 회전하고 갑작스런 방향 변화를 겪을 수있는 스텐터의 빠른 수영 운동보다는 조직 배양 세포의 느린 크롤링 움직임을 추적하도록 설계되었습니다. 이러한 많은 옵션을 테스트 한 후 여기에 제시된 프로토콜은 저비용 장비와 단일 과학 소프트웨어 패키지 (Table of Materials)만을 사용하여 데이터 수집에서 데이터 시각화에 이르기까지 모든 과정을 진행할 수있는 원 스톱 솔루션이되도록 고안되었습니다. 이것은 학생들이 자신의 질문을하고 짧은 시간 내에 양적 결과에 도달하는 장벽을 낮추기 때문에 필요한 장비의 대부분이 이미 사용 가능한 교육 중심 기관 또는 생물 물리학 교육 실험실의 연구 실험실에 특히 중요합니다.

이 원고에 제시된 방법은 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 유기체 집단의 운동성을 정량적으로 특성화하도록 조정할 수 있습니다. 더 작거나 큰 유기체에 적용하려면 비디오 데이터를 획득해야하는 방법에 대한 변경이 필요합니다. 여기에서 재생성 S. coeruleus의 집단에 적용된 바와 같이, 이 프로토콜은 세포 집단 전반에 걸친 운동성의 기능적 회복에 대한 타임라인을 산출하였으며, 이는 전사 타임라인에 대해 현재 알려진 것을 보완한다. 예를 들어, RNA 시퀀싱으로부터 섬모 운동성 단백질을 코딩하는 유전자의 합성은 섬모 자체의 형성 후 오랫동안 재생 과정으로 몇 시간까지 일어나지 않는다는 것이 알려져 있다 9,10. 위에서 입증된 시간 0-3(단계 1)에서 시간 4(단계 2)까지의 운동성의 통계적으로 유의한 감소는 섬모 조립에 관여하는 유전자의 발현과 비교하여 섬모 운동성 인자의 발현 지연과 일치한다. 현재까지 스텐터 재생에 대한 전사체 연구는 아홉 시간 이상 수행되지 않았기 때문에 게놈 활성에 대해서는 알려진 바가 거의 없다. 시간 8-10 (단계 3)과 시간 11 + (단계 4) 사이의 통계적으로 유의미한 차이가 없다는 것은 세포가이 시간에 의해 완전히 재생되었음을 시사하며, 세포 운동성과 관련된 유전자는 거의 시간 9 시간 이상으로 차별적으로 조절되어야합니다.

이 방법의 두 가지 주요 한계는 클러스터 및 / 또는 접촉 세포를 추적하지 못하고 수영 속도 또는 궤적보다 운동의 더 복잡한 측면을 정량화 할 수 없다는 것입니다. 모든 파티클/셀 추적 알고리즘은 일시적으로 다른 셀에 의해 시각적으로 막히는 셀을 따라가는 데 어려움이 있으며, 여러 셀이 가까운 거리에서 여러 프레임을 사용할 때 어려움을 겪습니다. 여기에 포함 된 스크립트도 예외는 아닙니다. 다행히도, 전자의 빈도는 다음 단락에서 논의 된 것처럼 하나의 내부에 배치 된 세포의 수를 제한함으로써 효과적으로 감소 될 수 있습니다. 특히 여기에서 조사된 S. coeruleus 집단에 대해, 콜로니에 정착하는 그들의 선호(그림 3)는 이들 세포 중 일부가 스크립트에 의해 확인되지 않도록 야기하였다. 그러나, 이들 모든 세포들이 거의 또는 전혀 움직임을 나타내지 않기 때문에, 운동성 세포 집단에 대한 통계는 영향을 받지 않는다. 또한 여러 셀이 추적을 회피하는 비디오는 쉽게 식별하고 추가 분석에서 수동으로 제외할 수 있습니다. 운동의 복잡한 측면의 정량화와 관련하여, 보충 그림 S1 에서 볼 수있는 방향없는 수영에서 방향 수영으로의 전환은 방향, 평균 가속도 및 잠재적으로 다른 측정 가능 물질의 시간 상관 관계의 양적 변화를 암시합니다. 이 프로토콜에서 분석된 유일한 양인 속도와 범위는 움직임의 작은 측면만을 나타냅니다.

마지막으로, 프로토콜의 일부 부분은 실제 사용에서 특히 중요하거나 결과입니다. 프로토콜 섹션 1에 설명된 바와 같이 얇은 실리콘 시트로 멀티웰 샘플 슬라이드를 조립하려면 연습이 필요합니다. 커버 글래스로 샘플을 밀봉하는 동안 누출이나 기포를 적어도 하나의 웰에 도입하는 것은 쉽습니다. 우물은 여러 샘플 슬라이드로 나뉘어 더 작은 커버 글라스를 사용할 수 있으므로 프로세스가 더 쉬워지고 실수가 덜 듭니다. 여기에 제시된 분석은 단일 시점에서 세포 집단의 운동성 패턴을 특성화하는 데 사용될 수 있지만, 긴 시간 경과 (10 시간 이상)에 걸쳐 단일 집단의 운동성 패턴을 비교하는 도구로 여기에서 입증됩니다. 긴 시간 경과와 마찬가지로 젖은 샘플의 증발은 피할 수 없습니다. 증발은 유리 슬라이드 및 커버슬립 모두에 대한 이미징 챔버 내의 실리콘 스페이서의 안전한 밀봉에 의해 최소화될 수 있다. 이렇게 하지 않으면 우물이 서로 새어 나오거나 우물 내부에 기포가 형성됩니다. 실리콘 스페이서의 사용에 익숙하지 않은 연구자의 경우, 저온 살균 된 샘물 또는 기타 깨끗한 매체를 사용하기 전에 누출을 테스트하기 위해 각 웰에 피펫팅해야합니다. 샘플 웰의 치수는 모두 크기가 약 1mm 인 S. coeruleus에서 잘 작동하도록 선택되었습니다. 여기에는 실리콘 스페이서 두께 (조사중인 S. coeruleus 세포를 2 차원 평면으로 제한하기 위해 선택됨), 5/16 "직경 및 웰 당 10 개의 세포가 포함됩니다. 이 숫자는 다른 세포 유형에 대해이 프로토콜을 적용 할 때 조정되어야합니다.

TrackCells.m 스크립트의 여러 매개 변수를 조정하여 자동 셀 식별 및 추적 유효성 검사를 최적화할 수 있습니다. 매개 변수 MinCellArea 및 MaxCellArea (스크립트의 행 15 및 16)을 사용하면 사용자가 셀에 대해 허용되는 크기 범위를 정사각형 픽셀로 설정할 수 있습니다. 어떤 값이 가장 좋은지는 셀 크기, 카메라 픽셀 크기, 배율, 셀로 잘못 식별 될 수있는 물체 (예 : 기포)가 있는지 여부를 포함하여 실험의 많은 세부 사항에 따라 다릅니다. 기본값인 300과 1500은 프로토콜에 제공된 정확한 장비 및 설정에 최적이었습니다. MinCellArea MaxCellArea를 최적화한 후 파라미터 임계값(줄 17)을 조정하여 이미지 대비를 변경합니다. 잘못 설정되면 셀 윤곽선이 제대로 식별되지 않거나 완전히 누락되어 올바른 추적을 방해합니다. Threshold 값이 올바른 추적을 위해 제대로 작동하지 않으면 콘트라스트가 높거나 초점이 더 높은 비디오를 사용해보십시오. 스크립트의 줄 218, bad_trks = find(strk_trks > 20); 는 (칼만 필터를 통해) 예측된 동작에서 너무 많이 벗어나는 트레이스를 버리는 역할을 한다. 그대로 스크립트에는 너무 많은 집합에 대해 20으로 설정된 임계값이 있습니다. 이 정수 값을 1까지 줄이면 추적을 더 적극적으로 삭제할 수 있습니다. 덜 공격적으로 폐기하도록 값을 늘리십시오. TrackCells.m의 대부분은 http://studentdavestutorials.weebly.com/multi-bugobject-tracking.html 에서 자유롭게 액세스 할 수있는 다중 객체 추적 자습서에서 채택되었으며, 독자는 더 자세한 내용을 참조 할 수 있습니다. 보충 비디오 1-3은 스크립트의 테스트 실행을 위한 예제 데이터 비디오입니다.

잃어버린 OA를 완전히 재생시키는 S. coeruleus 의 능력은 한 세기 전에 처음 관찰되었지만 운동성과 행동 상태의 회복에 관한 많은 열린 질문이 남아 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 브라이트 필드 이미징, 자동화 된 세포 식별 및 추적, 그리고 재생 스텐터 집단의 운동성을 정량적으로 특성화하기 위해 저자가 고용 한 데이터 시각화의 조합을 신비화하기위한 것입니다. 이 워크 플로우는 일반적으로 운동성 조사에 광범위하게 적용 할 수 있으며, 포함 된 스크립트 및 프로토콜은 비슷한 크기와 속도의 다른 생물학적 시스템, 예를 들어 ParameciumBlepharisma와 같은 다른 섬모와 함께 작동하도록 쉽게 채택 될 수 있습니다. 또한, 이미징 챔버를 변경하면(예를 들어, 상이한 이미징 배율과 결합된 건조 웰 또는 상이한 크기의 웰을 사용함) 이러한 워크플로우의 적용 가능성이 크게 확장된다. 스텐터 용 현재 도구 키트에는 외과적 해부, 삼투압 쇼크, RNAi, DNA/RNA 분석 및 소분자 억제제6이 포함되어 있습니다. 여기에 제시된 운동성을 정량화하는 높은 처리량 방법은 보완적인 수준의 특성화를 추가하며 향후 연구에서 운동성 표현형을 조사하는 데 사용될 것입니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 부분적으로 Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS)에 의해 지원되었습니다. 우리는 Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo 및 Skylar Widman이 예비 분석 및 코드 테스트 중 일부를 도운 것을 인정합니다. 토론과 제안에 대해 Mark Slabodnick에게 감사드립니다. WFM은 NIH 그랜트 R35 GM130327의 지원을 인정합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25 mm-thick silicone sheet Grace Bio-Labs CWS-S-0.25
24 x 50 mm, #1.5 coverglass Fisher Scientific NC1034527 As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide.
CCD camera We used Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT strain Chlamydomonas Resource Center CC-125
MATLAB MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox MATHWORKS needed for TrackCells.m and CleanTraces.m

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References

  1. Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
  2. Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
  3. Tartar, V. The Biology of Stentor. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).
  4. Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
  5. Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
  6. Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
  7. Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
  8. Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
  9. Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
  10. Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).

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생물학 문제 170 스텐터 코에룰루스 운동성 재생 표현형 스크리닝 현미경 타임랩스 섬모
세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 <em>스텐터</em> 의 운동성 패턴 분석
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Sheung, J. Y., Otsuka, M., Seifert,More

Sheung, J. Y., Otsuka, M., Seifert, G., Lin, A., Marshall, W. F. Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking. J. Vis. Exp. (170), e62352, doi:10.3791/62352 (2021).

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