Gangliosiden zijn siaalzuurhoudende glycosfingolipiden die bijzonder overvloedig aanwezig zijn in de hersenen. Hun amfipathische aard vereist organische /waterige extractie- en zuiveringstechnieken om optimaal herstel en nauwkeurige analyses te garanderen. Dit artikel biedt een overzicht van analytische en preparatieve schaal ganglioside extractie, zuivering en dunne laag chromatografie analyse.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Ganglioside extractie, zuivering en profilering
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gangliosiden zijn glycosfingolipiden die een of meer siaalzuurresiduen bevatten. Ze zijn te vinden op alle gewervelde cellen en weefsels, maar zijn vooral overvloedig aanwezig in de hersenen. Voornamelijk uitgedrukt op de buitenste folder van de plasmamembranen van cellen, moduleren ze de activiteiten van celoppervlakeiwitten via laterale associatie, fungeren ze als receptoren in cel-celinteracties en zijn ze doelwitten voor pathogenen en toxines. Genetische ontregeling van ganglioside biosynthese bij de mens resulteert in ernstige aangeboren aandoeningen van het zenuwstelsel. Vanwege hun amfipathische aard vereisen extractie, zuivering en analyse van gangliosiden technieken die door veel onderzoekers in de 80 jaar sinds hun ontdekking zijn geoptimaliseerd. Hier beschrijven we bench-level methoden voor de extractie, zuivering en voorlopige kwalitatieve en kwantitatieve analyses van belangrijke gangliosiden uit weefsels en cellen die in een paar uur kunnen worden voltooid. We beschrijven ook methoden voor grootschalige isolatie en zuivering van belangrijke ganglioside soorten uit de hersenen. Samen bieden deze methoden analytische en preparatieve schaaltoegang tot deze klasse van bioactieve moleculen.
Inleiding
Gangliosiden worden gedefinieerd als glycosfingolipiden met een of meer siaalzuurresiduen1. Ze komen voornamelijk tot expressie aan het celoppervlak met hun hydrofobe ceramide lipidegroep ingebed in de buitenste klep van het plasmamembraan en hun hydrofiele glycanen die zich uitstrekken tot in de extracellulaire ruimte2. Hoewel ze wijd verspreid zijn in gewervelde cellen en weefsels, zijn ze vooral overvloedig aanwezig in de hersenen van gewervelde dieren3, waar ze voor het eerst werden ontdekt en benoemd4.
De structuren van ganglioside glycanen ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Weefselverzameling werd uitgevoerd onder omstandigheden die zijn geautoriseerd door het Johns Hopkins Animal Care and Use Committee.
1. Kleinschalige ganglioside extractie en gedeeltelijke zuivering
LET OP: Gebruik de juiste ventilatie bij het werken met vluchtige en giftige oplosmiddelen. Vermijd plastic overal; oplosmiddelen zullen chemische componenten uit veel kunststoffen halen die de daaropvolgende analyses verstoren. Polytetrafluorethyleen (PTFE) is een uitzondering; Ptfe-gevoerde sluitingen moeten worden gebruikt om glazen opslagflacons af te sluiten.
- Extractie
- Weeg een enkel vers of ont....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De in rubriek 1 (kleinschalig) beschreven methoden bieden gangliosiden in voldoende hoeveelheid en zuiverheid voor kwalitatieve en kwantitatieve bepaling van belangrijke hersengangliosiden. Herstel van muizenhersenen is ~ 1 μmol ganglioside per g nat gewicht in de hersenen (1 nmol / μL) wanneer bereid zoals beschreven. TLC-resolutie van 1 μL (1 nmol) met behulp van sectie 3 biedt voldoende materiaal voor resorcinoldetectie en lost alle belangrijke hersengangliosiden op zoals weergegeven voor wilde en genetisch gemodifice.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De methoden voor kleine en grootschalige ganglioside-extractie en -isolatie die hier worden gerapporteerd, zijn niet uniek - er zijn veel verschillende oplosmiddelextractie- en zuiveringsbenaderingen die uitstekende resultaten opleveren12. De hier gerapporteerde methoden voor kleinschalige zuivering uit de hersenen, van Fredman en Svennerholm13, bleken het herstel te optimaliseren en hebben gedurende vele jaren in ons laboratorium bewezen robuust en eenvoudig te zijn. Isola.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs stellen geen tegenstrijdige belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door national institutes of health (NIH) Common Fund for Glycoscience grant U01CA241953. MJP werd ondersteund door het Chemistry-Biology Interface Program van Johns Hopkins (T32GM080189).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bovine brain, stripped | PelFreez | 57105-1 | |
| Ganglioside standards | Matreya | GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063 | |
| Glass bottle with PTFE-lined cap | Fisher Scientific | 02-911-739 | |
| Glass centrifuge bottle | Fisher Scientific | 05-586B | |
| Glass culture tubes, 16 x 125 mm | VWR | 60825-430 | voor het verzamelen van HPLC-fracties |
| Glass separatory funnel (2 L) | Pyrex | 6400-2L | |
| Injection syringe - Hamilton 1750 gastight 500 µl | Hamilton | 81265 | |
| p-Anisaldehyde, 98% | Sigma-Aldrich | A88107 | |
| Potter-Elvhjem Homogenizer | Fisher Scientific | 08-414-14A | Kies de juiste volume-optie |
| Reprosil 100 NH2 10µm 5x4mm guard columns | Analytics-Shop | AAVRS1N-100540-5 | |
| Reprospher 100 NH2, 5 μm, 250 mm x 20 mm HPLC column | Analytics-Shop | op maat gepakt | andere maten beschikbaar |
| Resorcinol | Sigma-Aldrich | 30752-1 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-300 | |
| Sample loop for Model 7725 Injector (5 ml) | Sigma-Aldrich | 57632 | |
| Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g) | Waters | WAT043350 | |
| Sep-Pak tC18 Plus Short Cartridge, 400 mg | Waters | WAT036810 | |
| Spotting syringe - Hamilton 701N 10 µl | Hamilton | 80300 | |
| Thick-walled 13-mm diameter test tubes with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-933A | |
| Threaded 2-ml vials with PFTE lined caps | Fisher Scientific | 14-955-323 | Voor ganglioside-opslag |
| TLC plates, HPTLC Silica gel 60 F254 Multiformat | Fisher Scientific | M1056350001 | Fluorescentie-impregnering (F254) stabiliseert het sorbentoppervlak |
| TLC reagent sprayer | Fisher Scientific | 05-723-26A | |
| TLC running chamber for 10 x 10 cm plates | Camag | 22.5155 | |
| Waring 1-Liter Stainless Steal Explosion Resistant Blender | Waring | E8520 |
Referenties
- Schnaar, R. L. The Biology of Gangliosides. Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).
- DeMarco, M. L., Woods, R. J. Atomic-resolution conformational analysis of....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
