Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией, регулирующей несколько биологических путей. Масс-спектрометрия является лучшей технологией для глобального профилирования R-метил-протеома в сочетании с биохимическими подходами к обогащению модифицированными пептидами. Рабочий процесс, предназначенный для высокой достоверности идентификации глобального R-метилирования в клетках человека, описан здесь.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Протеомический подход на основе масс-спектрометрии для глобального анализа R-метилирования белка с высокой степенью достоверности
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией белка (PTM), участвующей в регуляции нескольких клеточных путей, включая обработку РНК, трансдукцию сигналов, реакцию на повреждение ДНК, биогенез микроРНК и трансляцию.
В последние годы, благодаря биохимическим и аналитическим разработкам, протеомика на основе масс-спектрометрии (МС) стала наиболее эффективной стратегией для характеристики клеточного метилпротеома с односайтовым разрешением. Однако идентификация и профилирование R-метилирования белка in vivo при РС остается сложным и подверженным ошибкам, главным образом из-за субстохиометрического характера этой модификации и наличия различных замен аминокислот и химической метилэтерификации кислотных остатков, которые являются изобарическими к метилированию. Таким образом, необходимы методы обогащения для улучшения идентификации R-метилпептидов и ортогональные стратегии валидации для снижения коэффициентов ложного обнаружения (FDR) в исследованиях метилпротеомики.
Здесь описан протокол, специально разработанный для идентификации и количественного определения R-метилпептидов с высокой степенью достоверности из клеточных образцов, который связывает метаболическую маркировку клеток с тяжелым изотоп-кодированным метионином (hmSILAC) и двойным перевариванием протеазы в растворе цельноклеточного экстракта, за которым следует оффлайн-фракционирование хроматографии с высоким рН (HpH-RP) и аффинное обогащение R-метил-пептидов с использованием анти-пан-R-метиловых антител. При анализе MS с высоким разрешением необработанные данные сначала обрабатываются с помощью программного пакета MaxQuant, а затем результаты анализируются hmSEEKER, программным обеспечением, предназначенным для углубленного поиска пиковых пар MS, соответствующих легким и тяжелым метил-пептидам в выходных файлах MaxQuant.
Введение
Аргинин (R)-метилирование представляет собой посттрансляционную модификацию (PTM), которая украшает около 1% протеома млекопитающих1. Белковые аргининметилтрансферазы (PRMT) представляют собой ферменты, катализирующие реакцию R-метилирования путем осаждения одной или двух метильных групп к атомам азота (N) группы гуанидино боковой цепи R симметричным или асимметричным образом. У млекопитающих PRMT могут быть сгруппированы в три класса - тип I, тип II и тип III - в зависимости от их способности депонировать как монометилирование (ММА), так и асимметричное диметилирование (ADMA), ММА и симметричное диметилирование (SDMA) или только ММА, соответст....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Культивирование клеток и экстракция белка (требуется время: 3 - 4 недели)
- Выращивайте клетки HeLa параллельно в средах, снабженных либо легким (L), либо тяжелым (H) метионином соответственно (см. Таблицу 1 для композиции среды). По крайней мере, после восьми делений клеток соберите аликвоту клеток из каждого канала SILAC и выполните тест на инкорпорацию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы проверить эффективность включения, проверьте с помощью анализа LC-MS / MS, что процент тяжелого метионина (Met-4) в тяжелом канале максимально близок к 100%. Проанализируйте аликвоту тяжело меченых ячеек LC-MS/MS (настройки см. в таблице 2), затем обр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
В статье описан рабочий процесс для высокодоверной идентификации глобального R-метилирования белка, который основан на сочетании ферментативного переваривания белкового экстракта с двумя различными протеазами параллельно, с последующим фракционированием жидкой хроматографии HpH-RP протеолитических пептидов и иммуноаффинным обогащением R-метил-пептидов анти-пан-R-метиловыми антителами (рисунок 1).
Клетки выращивали в присутствии метионина, либо природного (Light, L.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Высоконадежная идентификация метилирования белка/пептида in vivo глобальной протеомикой на основе РС является сложной задачей из-за риска высокого FDR, с несколькими аминокислотными замещениями и метилэтерификацией, происходящими во время подготовки образца, которые являются изобарическими для метилирования и могут вызвать неправильные назначения в отсутствие ортогональных стратегий валидации РС. Субстохиометрический характер этого ПТМ еще больше усложняет задачу глобальной метилпротеомики, но может быть преодол.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
MM и EM являются аспирантами Европейской школы молекулярной медицины (SEMM). EM является получателем 3-летней стипендии FIRC-AIRC (Код проекта: 22506). Глобальные анализы R-метил-протеомов в группе туберкулеза поддерживаются грантом AIRC IG (Код проекта: 21834).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Бикарбонат аммония (АМБИК) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Персульфат аммония (APS) | Сигма-Олдрич | 497363 | |
| C18 Sep-Pak колонки vacc 6cc (1g) | Воды | WAT036905 | |
| коллоидное окрашивание Кумасси Мгновенное | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, без ЭДТА | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Ингибитор протеазы |
| Диализированная фетальная бычья сыворотка (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-дитиотреитол (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | запрошено | со стабилем глутамином и без метионина |
| EASY-nano LC 1200 хроматографическая система | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray ВЭЖХ колонки | ThermoFisher | ES907 | |
| глицерол | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa элементы | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Йодоацетамид (IAA) | Сигма-Олдрич | 144-48-9 | |
| Юпитер C12-RP колонка | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-метионин | Sigma-Aldrich | M5308 | Светлый (L) Метионин |
| L-метионин-(метил-13C,d3) | Сигма-Олдрич | 299154 | тяжелый (H) Метионин |
| Лисаргиназа | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Соникатор для разрушения клеток Microtip 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′ -тетраметилэтилендиамин (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Пенициллин-стрептомицин | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | ингибитор фосфатазы |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0,1% муравьиной кислоты (v/v) в ацетонитриле, класс | LC-MSThermoFisher | 85175 | LC-MS растворитель B |
| для прокалывания 0,1% муравьиной кислоты (v/v) в воде, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS растворитель A |
| для прокалывания Ацетонитрил (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Вода, LC-MS | Grade ThermoFisher | 51140 | |
| Полиакриламид | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan антитела α-ADMA | Клеточная сигнальная технология | 13474 | |
| Антитела PTMScan α-MMA | Клеточная сигнальная технология | 12235 | |
| Антитела PTMScan α-SDMA | Клеточная сигнальная технология | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Спектрометр | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade модифицированный трипсин | Promega | V5113 | |
| Трифторуксусная кислота | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 ВЭЖХ | Dionex | ||
| Мочевина | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Вакуумный концентратор 5301 | Eppendorf | Speed vac |
Ссылки
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
