Test di screening farmacologico e radioterapico a medio rendimento utilizzando organoidi derivati da pazienti

Sommario

Descriviamo protocolli dettagliati per l'utilizzo di organoidi derivati da pazienti per lo screening della sensibilità alla terapia a medio rendimento. Le terapie testate includono la chemioterapia, la radioterapia e la chemio-radioterapia. I livelli di adenosina trifosfato sono utilizzati come lettura funzionale.

Abstract

I modelli di organoidi derivati da pazienti (PDO) consentono l'espansione e il mantenimento a lungo termine di cellule epiteliali primarie cresciute in tre dimensioni e in uno stato quasi nativo. Quando derivati da tessuto tumorale resecato o biopsiato, gli organoidi ricapitolano fedelmente la morfologia tumorale in vivo e possono essere utilizzati per studiare la risposta alla terapia in vitro. Le biobanche di organoidi tumorali riflettono la grande varietà di tumori clinici e pazienti e quindi sono molto promettenti per le applicazioni precliniche e cliniche. Questo articolo presenta un metodo per lo screening farmacologico a medio rendimento utilizzando il carcinoma a cellule squamose della testa e del collo e gli organoidi di adenocarcinoma colorettale. Questo approccio può essere facilmente adottato per l'uso con qualsiasi modello di organoide derivato da tessuti, sia normale che malato. Vengono descritti i metodi per l'esposizione in vitro di organoidi alla chemioterapia e alla radioterapia (sia in modalità di trattamento singolo che in combinazione). La sopravvivenza cellulare dopo 5 giorni di esposizione al farmaco viene valutata misurando i livelli di adenosina trifosfato (ATP). La sensibilità ai farmaci è misurata dalla concentrazione inibitoria semimassima (IC₅₀), dall'area sotto la curva (AUC) e dal tasso di crescita (GR). Questi parametri possono fornire informazioni sul fatto che una coltura di organoidi sia considerata sensibile o resistente a un particolare trattamento.

Introduzione

I modelli di organoidi creati da cellule staminali adulte e cresciuti in una matrice extracellulare (ECM) tridimensionale (3D) e in uno specifico cocktail di fattori di crescita (noti anche come organoidi HUB) stanno guadagnando terreno come piattaforme di screening oncologico preclinico. Le colture di organoidi derivati da pazienti (PDO) possono essere stabilite da biopsie di tessuti normali e malati entro 1-2 settimane e possono essere estese per un minimo di 1-2 mesi fino a periodi di tempo illimitati. La crioconservazione consente l'utilizzo a lungo termine di colture ben caratterizzate. A differenza dei tradizionali modelli di li....

Protocollo

NOTA: Prima di utilizzare questo protocollo, assicurarsi che vengano seguite le linee guida del comitato etico per la ricerca umana dell'istituto. La raccolta dei tessuti dei pazienti e dei dati descritti in questo protocollo è stata eseguita seguendo le linee guida EUREC e seguendo le leggi europee, nazionali e locali. Tutti gli organoidi sono stati derivati da pazienti consenzienti e il consenso può essere revocato in qualsiasi momento.

1. Prima dello screening

1. Confermare l'identità dei modelli di nuova costituzione (ad esempio, mediante istologia e/o sequenziamento del DNA ^1,2,3....

Risultati

Lo scopo di questo esperimento è stato quello di esaminare la sensibilità degli organoidi HNSCC alla chemioterapia e alla radioterapia come agenti singoli. Abbiamo anche testato la riproducibilità dei risultati eseguendo l'esperimento più volte con un intervallo di una settimana, ottenendo diverse repliche biologiche (esperimenti 1-3) (Figura 2). Seguendo il protocollo, il giorno 0, le PDO HNSCC sono state raccolte da 6 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti e tranciate enzimaticamente e mecca.......

Discussione

Questo articolo e il video descrivono come eseguire lo screening dei farmaci a medio rendimento utilizzando i PDO. Questo protocollo può, con ottimizzazione, essere adottato per lo screening di organoidi derivati da tipi di tessuto diversi da quelli qui descritti. Determinare il periodo di passaggio ideale prima dello screening è importante in quanto questo varia per le singole colture di organoidi e dipende dal tipo di tessuto. La densità e la dimensione degli organoidi seminati per poz.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Attrezzatura necessaria
Lettore di piastre a bioluminescenza a 384 pozzetti; ad es. lettore di piastre Tecan Spark 10M	Microscopio
con lente ad ampio campo visivo (2,5x)
Dispenser digitale; ad es. Tecan D300e	Tecan		Irradiatore
	a fascio di fotoni da 6 MV per l'erogazione di farmaciElekta modello Synergy, Elekta Svezia
Movimentatore di liquidi con ugello grande (" tubo standard") Cassette;
ad es. Dispenser di reagenti Multidrop Combi	Thermo Scientific
Contenitore in plastica con inserto portapiastre per radioterapia
Apparecchiature standard per la coltura dei tessuti (armadio LAF, incubatore, centrifuga, bagnomaria, ecc.)
Materiali necessari
1,5 mL provette
in plastica Provette
Pipette
Piastre
Piastra nera a fondo trasparente a bassissimo attacco da 384 pozzetti; ad es. Corning 384 nero piatto	Corning	4588
Breathe-Easy  membrana di tenuta	Membrana	poliuretanica pretagliata
Vetrino			Vetrino a 10 camere con griglia emocitometrica
Dispenser di reagenti Combi Multidrop Cassetta di erogazione per tubi standard	Thermo Scientific
Plugged Pasteur' s pipetta di cui il puntale è stato serrato a fiamma
Reversibile 20/40/70/100 µ m filtri: PluriStrainer	Pluriselect	ad es. 43-50020-03
Puntali per pipette sterili P1000, P200, P20 e P2 e puntali filtranti a bassa ritenzione (ad es. puntali in zaffiro)	Greiner	750266
Cassette T8 Plus e D4 Plus	HP/Tecan
Reagenti necessari
100 x Glutamax			L-glutammina sostituto
1 M HEPES
30% (v/v) Tween-20 diluito in PBS
70% EtOH
Advanced-DMEM/F12	Thermo Scientific	12634-010
CellTiter-Glo Saggio di vitalità cellulare 3D	Promega	G9681
Composti per testare lo screening, inclusa la staurosporina o altri controlli positivi
Dispase II	Sigma-Aldrich	D4693
DMSO
ECM per CRC: fattore di crescita ridotto Matrigel,	Corning	356231
per HNSCC PDO: BME, estratto di membrana basale Cultrex RGF, tipo R1	R& D Systems	3433-005-R1
Terreno di crescita ad espansione (specifico per ogni tipo di organoide)
Fattori di crescita degli organoidi (specifici per ogni tipo di organoide)
PBS
Pen/Strep (100 U/mL)
Inibitore ROCK: Y-27632	Abmole	M1817
TrypLE
Pacchetti software richiesti:
GraphPad Prism
Microsoft Excel

a campo chiaro Tecan Software di editor del metodo di controllo delle scintille fatto in casain plastica da 15 e 50 mLin plastica sterili da 5, 10 e 25 mLper colture cellulari a 6 pozzettiMerck per uso medico con adesivo acrilico Glasstic , ECM senza fenolo