Summary
Hier beschreven is een gevestigde methode om de mate van HIV-1 beperking te bepalen door het cellulaire remmende eiwit SAMHD1. Menselijke myeloïde afstamming U937-cellen worden getransduceerd met een SAMHD1-expressievector die YFP co-expressie geeft, gedifferentieerd en vervolgens uitgedaagd met HIV-RFP. Het niveau van beperking wordt bepaald door flowcytometrie-analyse.
Abstract
Steriel α-motief/histidine-aspartaat domeinbevattend eiwit 1 (SAMHD1) remt de replicatie van HIV-1 in rustige myeloïde cellen. U937-cellen worden veel gebruikt als een handig celsysteem voor het analyseren van SAMHD1-activiteit vanwege een laag niveau van SAMHD1-RNA-expressie, wat leidt tot niet-detecteerbare endogene eiwitexpressie. Op basis van vergelijkbare assays ontwikkeld in het Stoye-laboratorium om andere retrovirale restrictiefactoren te karakteriseren, ontwikkelde het Bishop-lab een tweekleurige restrictietest om SAMHD1 in U937-cellen te analyseren. Murine Leukemie Virus-achtige deeltjes die SAMHD1 tot expressie brengen, naast YFP uitgedrukt uit een IRES, worden gebruikt om U937-cellen te transduceren. Cellen worden vervolgens behandeld met phorbol myristate acetaat om differentiatie tot een rustig fenotype te induceren. Na differentiatie worden cellen geïnfecteerd met HIV-1-virusachtige deeltjes die een fluorescerende verslaggever tot expressie brengen. Na 48 uur worden cellen geoogst en geanalyseerd door flowcytometrie. Het aandeel hiv-geïnfecteerde cellen in de SAMHD1-tot expressie brengende populatie wordt vergeleken met dat in interne controlecellen zonder SAMHD1. Deze vergelijking laat een beperkingsverhouding zien. SAMHD1-expressie leidt tot een vijfvoudige vermindering van hiv-infectie, wat overeenkomt met een beperkingsverhouding van 0,2. Onze recente vervanging van RFP door de oorspronkelijke GFP als het reporter-gen voor HIV-infectie heeft flowcytometrie-analyse vergemakkelijkt.
Deze test is met succes gebruikt om het effect van aminozuursubstituties op SAMHD1-beperking te karakteriseren door te transduceren met virussen die coderen voor veranderde SAMHD1-eiwitten, afgeleid van site-gerichte mutagenese van de expressievector. De katalytische sitesubstituties HD206-7AA vertonen bijvoorbeeld een restrictiefenotype van 1, wat wijst op een verlies van restrictieactiviteit. Ook kan de gevoeligheid van verschillende testervirussen worden bepaald. De test kan verder worden aangepast om het effect van differentiatiestatus, metabole status en SAMHD1-modifiers op te nemen om de relatie tussen SAMHD1, celmetabooltoestand en virale beperking beter te begrijpen.
Introduction
Steriel α-motief/histidine-aspartaat domeinbevattend eiwit 1 (SAMHD1) belemmert de replicatie van Humaan Immunodeficiëntie Virus type 1 (HIV-1) in rustige cellen van de myeloïde afstamming. SAMHD1 blokkeert replicatie door zijn enzymatische activiteit als een dNTP trifosfohydrolase, wat resulteert in verlaagde niveaus van intracellulaire dNTPs. Als gevolg hiervan kan HIV-1 het proces van reverse transcriptie niet efficiënt uitvoeren. In de paar jaar sinds deze eerste waarneming is veel vooruitgang geboekt, met name wat betreft de bijdrage van specifieke domeinen en aminozuren aan de antivirale activiteit van SAMHD1. Deze inzichten zijn gemaakt met behulp van biochemische assays en celsystemen die de fysiologisch relevante rustige myeloïde omgeving nabootsen. U937-cellen1 worden veel gebruikt als een handig myeloïde celsysteem voor het analyseren van SAMHD1-activiteit. Dit komt door een gebrek aan endogene SAMHD1-expressie, waarvan wordt gedacht dat dit te wijten is aan lage RNA-niveaus in vergelijking met SAMHD1-tot expressie brengende cellen (een gebied van lopend onderzoek). Hier beschrijft het protocol de transiënte transductie van U937-cellen met virusachtige deeltjes die SAMHD1 co-expressie brengen en een geel fluorescerend eiwit (YFP) -verslaggever om het mechanisme van SAMHD1-beperking van HIV-1 te onderzoeken. Dergelijke voorbijgaande tweekleurige flowcytometrietests om retrovirale beperkingen te onderzoeken, werden voor het eerst ontwikkeld in het Stoye-laboratorium2 en zijn sindsdien aangepast om andere restrictiefactoren te onderzoeken, waaronder de tripartiete motief (TRIM) -eiwitten3. Geïnspireerd door deze assays ontwikkelde het Bishop-lab een tweekleurentest om SAMHD1-beperking in U937-cellen te analyseren.
De workflow voor het experiment is weergegeven in figuur 1. Murine Leukaemia Virus (MLV)-achtige deeltjes die een bi-cistronic bericht bevatten dat codeert voor SAMHD1 naast YFP uitgedrukt uit een IRES, worden gebruikt om U937-cellen te transduceren. Cellen worden vervolgens behandeld met phorbolmyristaatacetaat (PMA) om differentiatie tot een rustig fenotype te induceren. Cellen worden vervolgens geïnfecteerd met HIV-1-virusachtige deeltjes die rood fluorescerend eiwit (RFP) tot expressie brengen. Na 48 uur worden de cellen geoogst en geanalyseerd door middel van tweekleurige flowcytometrie. Deze test wordt ook gebruikt met YFP en groen fluorescerend eiwit (GFP), waarvoor minder standaard filtercombinaties nodig zijn voor flowcytometrie-analyse. Het gebruik van HIV-RFP zorgt voor een eenvoudigere compensatie en dus is de test gemakkelijker toegankelijk voor minder ervaren flowcytometriegebruikers en haalbaar met de meeste cytometers.
Tijdens de analyse wordt het aandeel hiv-geïnfecteerde cellen vergeleken tussen SAMHD1-tot expressie brengende cellen en cellen zonder SAMHD1 binnen dezelfde bron van cellen. Dit biedt een interne controle in de put / flow cytometrie buis, wat een belangrijk kenmerk is. De vergelijking van infectieniveaus in getransduceerde en niet-getransduceerde cellen onthult een beperkingsverhouding. Een verhouding van 1,0 geeft aan dat de getransduceerde factor geen effect heeft op de infectiviteit. Wild type SAMHD1-expressie leidt tot een vijfvoudige vermindering van hiv-infectie in deze test, wat overeenkomt met een beperkingsverhouding van 0,2. Hoewel dit effect bescheiden is in vergelijking met meer klassieke restrictiefactoren zoals TRIM5, is het effect niettemin reproduceerbaar en maakt het de classificatie van gemodificeerde SAMHD1-expressoren mogelijk in degenen die op een gelijkwaardige manier beperken als het wild-type eiwit, degenen die niet beperken en die met een intermediair fenotype.
Deze test is met succes gebruikt om de restrictiefenotypen van SAMHD1-domein- en aminozuurmutanten te karakteriseren door te transduceren met virussen die coderen voor mutante SAMHD1-sequenties. Bijvoorbeeld, de katalytische site substituties HD206-7AA niet beperken in deze test. Ook kan de gevoeligheid van verschillende testervirussen worden bepaald. Hiv-1 reverse transcriptase mutanten zijn bijvoorbeeld gevoeliger voor SAMHD1-gemedieerde beperking (bijv. 151V4). Dit protocol schetst de details van virusachtige deeltjes (VLP) productie, transductie van U937 met SAMHD1 expressievectoren, infectie met HIV met een fluorescerende reporter en de daaropvolgende analyse door flowcytometrie. In dit artikel wordt besproken welke gegevens u kunt verwachten en hoe u suboptimale resultaten kunt voorkomen. Ten slotte worden alternatieve toepassingen voor de test geschetst, naast het onderzoeken van verschillende SAMHD1-varianten om het samenspel tussen SAMHD1, dNTP-niveaus en virale infectie grondiger te begrijpen. Gezien de rol van SAMHD1 in het centrum van het celmetabolisme, met extra links naar kanker, blijft dit een gebied van intens belang.
Protocol
Dit protocol bevat geen studies met dieren of menselijke deelnemers uitgevoerd door een van de auteurs. Alle stappen van dit protocol werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en gedragscodes van de instellingen waar ze werden uitgevoerd.
1. Transfectie van 293T-cellen voor VLP-productie (zowel SAMHD1-expressievectoren als tester HIV-deeltjes)
OPMERKING: De belangrijkste bijdragen aan de succesvolle productie van virusdeeltjes zijn de gezondheid van de producent 293T-cellen, samenvloeiing bij transfectie en tijdstip van oogst. Laboratoria hebben meestal hun favoriete transfectiereagentia en protocol voor retrovirale deeltjesproductie. Het volgende protocol levert infectieuze deeltjes van goede kwaliteit op, maar gelijkwaardige protocollen zouden ook geschikt zijn voor deze toepassing. Om 293T-cellen van goede kwaliteit te behouden, passage minstens drie keer per week om een constante groeisnelheid te behouden. Cellen moeten worden gezaaid in de logfase van de groei voor efficiënte transfectie.
- Dag 1: Zaai het vereiste aantal 10 cm schalen met een 1/4 split uit een bijna-samenvloeiende schaal van 293T-cellen om de volgende dag ongeveer 60% samenvloeiing op te leveren (ongeveer 5 x 105 cellen / ml). Verschillende dichtheden moeten mogelijk worden gezaaid om de volgende dag een geschikte dichtheid voor transfectie te bereiken bij het werken met een nieuwe celvoorraad.
- Dag 2 (ochtend): Controleer op ongeveer 60% samenvloeiing door microscopie en vervang voorzichtig media op cellen door 10 ml verse Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM).
- Dag 2 (middag, minimaal 4 uur na mediawissel): Transfect voor VLP productie.
- Vul het DNA-verdunningsmengsel aan met elk 3 μg gag-pol expressorplasmide, Long-terminal repeat (LTR)-driven reporter plasmide en Vesicular Stomatitis Virus G protein (VSV-G) expressorplasmide (totaal 9 μg, zie OPMERKING) in 600 μL serumvrije DMEM. Vortex en centrifuge kort (15 s, >500 x g).
- Voeg 20 μL transfectiereagens (zie materiaaltabel), vortex (niet centrifugeren) toe en incubeer bij 20 °C gedurende 15-20 min. Voeg de transfectiemix druppelsgewijs toe aan het bord, draai voorzichtig om te mengen en keer terug naar de incubator.
OPMERKING: Gebruik voor MLV VLP die SAMHD1 uitdrukt KB4 5,6 (gag-pol expressor plasmid), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (LTR-aangedreven reporterplasmide) en pczVSV-G7. Gebruik voor HIV-RFP VLP p8.91 8,9 (gag-pol expressor plasmid), SCRPSY10 (LTR-driven reporter plasmid) en pczVSV-G. Alternatieven worden besproken in de Tabel van Materialen. Plasmideverhoudingen moeten mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende plasmide/ transfectiesystemen.
- Dag 3 (late ochtend): Verwijder de media voorzichtig uit de cellen door te pipetteren, was met 5 ml verse DMEM en vervang door 5 ml verse DMEM.
- Dag 4 (ochtend): Oogst het virus door het supernatant uit de cellen te halen en vervang het door 5 ml verse DMEM. Laat het VLP-bevattende supernatant door een 0,45 nm filter, aliquot en breng over naar -70 °C voor opslag. Zorg ervoor dat de aliquots geschikt zijn voor geplande experimenten (250 μL als suggestie), omdat herhaalde vries-dooicycli zullen resulteren in een verlies van virale titer.
- Dag 5 (ochtend): Oogst het virus zoals in 1,5 maar gooi de platen weg na het verzamelen van het supernatant.
2. Titereren van nieuwe VLP voorafgaand aan gebruik
- Dag 1: Zaad 293T bij 2 x 105 cellen per put van een 24-well plaat - 4 putjes per te titreren virus, inclusief een virus van bekende infectiviteit voor elke ruggengraat. Optimaliseer de zaaidichtheid voor een bepaalde celvoorraad.
- Dag 2: Observeer de plaat om de samenvloeiing te controleren (idealiter ~70%). Ontdooi het virusbevattende supernatant uit stap 1.5 en 1.6. Voeg 0, 10, 25 of 100 μL toe aan elk putje.
- Dag 4 (ochtend): Oogst de cellen voor analyse door flowcytometrie.
- Verwijder de media door voorzichtig te pipetteren of te aspiratie. Was de cellen voorzichtig met 250 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de cellen van de plaat door op en neer te pipetteren met 250 μL PBS en breng over naar een microcentrifugebuis. Voeg 250 μL 4% paraformaldehyde toe (waarbij de uiteindelijke concentratie op 2% komt).
LET OP: Paraformaldehyde is giftig. Het mag niet worden gemengd met desinfectiemiddelen op basis van chloor. - Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellet in 200 μL PBS of alternatieve flowcytometriebuffer. Analyseer op RFP of YFP, indien van toepassing, door middel van flowcytometrie. Normaliseer de infectiviteit van een bepaald virusbestand tegen waarden voor een bestand met bekende infectiviteit.
OPMERKING: VLP kan ook worden genormaliseerd door p24 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA); dit is echter niet noodzakelijkerwijs een goede indicator voor VLP-infectiviteit, vooral wanneer VLP-voorraden in verschillende transfecties worden bereid. Gepubliceerde mediane weefselkweek infectieuze dosis of multipliciteit van infectie (TCID50/MOI) methoden11 kunnen ook relatieve kwantificering bieden, hoewel deze niet goed zijn vastgesteld voor MLV. Relatieve fluorescentie biedt een kosteneffectief alternatief voor commerciële reverse transcriptase ELISA-methoden.
- Verwijder de media door voorzichtig te pipetteren of te aspiratie. Was de cellen voorzichtig met 250 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Verwijder de cellen van de plaat door op en neer te pipetteren met 250 μL PBS en breng over naar een microcentrifugebuis. Voeg 250 μL 4% paraformaldehyde toe (waarbij de uiteindelijke concentratie op 2% komt).
3. Transductie van U937 met VLP die SAMHD1 en YFP uitdrukt
OPMERKING: Stap 3-6 vormt het beperkingsexperiment. Dagen zijn geteld voor het gemak van de planning.
- Dag 1 (middag): Ontdooi VLP voor transductie inclusief MLV-Wild-type SAMHD1-YFP (positieve controle), MLV-SAMHD1 (HD206-7AA)-YFP (negatieve controle) en variant MLV-SAMHD1-YFP (experimentele monsters). Verdun de genormaliseerde VLP tot een laatste volume van 500 μL met Roswell Park Memorial Institute 1640 media (RPMI) in een microfugebuis, voeg 0,5 μL polybreen (10 mg / ml) toe en meng door te vegen.
- Als VLP niet vooraf kan worden getitreerd, gebruik dan in eerste instantie 100 μL. Gebruik een maximale verhouding van 1:1 van VLP tot RPMI om door VLP geïnduceerde toxiciteit te beperken. Streef naar ongeveer 30% transductie.
- Aliquot 5 x 105 U937 cellen in een steriele microfuge buis voor elke transductie conditie. Pellet door centrifugatie bij 500 x g gedurende 5 minuten, en verwijder het supernatant (inclusief twee extra buizen als niet-getransduceerde controles voor flowcytometrie). Resuspendeer de celpellet in 500 μL verdunde VLP (of RPMI voor niet-getransduceerde controles) en breng over in een put van een 24-well plaat.
- Spinoculaat in een tafelcentrifuge bij 800 x g gedurende 90 min bij 20 °C. Voeg 1 ml rpmi toe aan de put en laat gedurende 3 dagen herstellen in een incubator van 37 °C.
4. Differentiatie van getransduceerde U937
- Dag 4 (ochtend): Suspensieer de cellen opnieuw door voorzichtig te pipetteren en breng 350 μL over in elk van de 4 putten van een 12-well plaat. Voeg 700 μL 37 °C RPMI met 150 nM PMA toe aan elke put, wat een eindconcentratie van 100 nM oplevert en laat gedurende 3 dagen differentiëren.
OPMERKING: PMA wordt gekocht als een poeder en moet worden geresuspendeerd tot 1 mM in DMSO en in het donker worden bewaard. Een werkvoorraad van 100 μM moet worden bereid door 1/10 van de 1 mM-voorraad met DMSO te verdunnen.
5. Infectie van gedifferentieerde, SAMHD1-expresserende U937 met HIV-RFP
- Dag 7: Observeer de cellen door microscopie. Zorg ervoor dat de cellen hechten. Haal de media uit alle putten, voeg 1 ml RPMI toe aan put 1 van elke set van 4, waardoor niet-getransduceerde, niet-geïnfecteerde controle en enkele kleurregelaars mogelijk zijn. Voeg 0,5 ml RPMI met ongeveer 10 μL HIV-1-RFP (ongeveer 10 ng p24 als richtlijn) toe aan alle andere putten. Streef naar ongeveer 50% infectie.
- Dag 8 (ochtend): Voeg 0,5 ml RPMI toe aan elk van de geïnfecteerde putten.
6. Flowcytometrie analyse
OPMERKING: Het is een goede gewoonte om een levende dode vlek op te nemen in flowcytometriepijplijnen. Als de U937-cellen echter van goede kwaliteit zijn, kan deze stap worden weggelaten zonder negatieve gevolgen voor downstream-analyse. Voorzichtig pipetteren van trypsinized cellen zou gemakkelijk moeten resulteren in een single cell suspensie.
- Dag 10 (ochtend): Haal de media uit de putjes en was één keer met PBS. Voeg 300 μL celdissociatie-enzym (of trypsine) toe gedurende 5-10 min. Voeg een extra 300 μL PBS toe, resuspendeer grondig en zorg ervoor dat alle cellen van de plaat zijn gekomen en breng over naar flowcytometriebuizen.
- Voeg 300 μL 4% paraformaldehyde toe (waarbij de uiteindelijke concentratie op 2% komt). Pelleteer de cellen door centrifugeren bij 500 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en resuspenseer de celpellet in 200 μL PBS of alternatieve flowcytometriebuffer. Analyseren door flowcytometrie.
OPMERKING: De onderstaande stappen zijn voor een Fortessa-analyzer, maar gelijkwaardige analyse kan worden bereikt met behulp van elke analyzer die RFP- en YFP-fluorescentie kan lezen. Raadpleeg de lokale flowcytometrie-ondersteuning of een andere ervaren onderzoeker voordat u een flowcytometrieanalyse opzet. Wanneer veel monsters tegelijkertijd moeten worden gescreend, kan een sampler met hoge doorvoer geschikt zijn. In dit geval wordt een groter celnummer en volume geadviseerd.
7. Flowcytometrie analyse
- Schakel de cytometer 10 minuten voordat deze nodig is in en schakel de computer in. Controleer of het afval leeg is en of de schedetank vol is.
- Log in op het apparaat en open de analysesoftware.
- Beweeg de arm naar de zijkant, haal de waterbuis eraf, stel het debiet in op Hoog en druk op Prime. Wacht tot het licht uitgaat en herhaal dit nog drie keer.
- Zet het water weer aan en loop 3 minuten op hoog en schakel dan over naar Laag en druk op Stand-by totdat u doorgaat met acquisitie.
- Ondertussen het experiment opgezet binnen de software:
- Selecteer Experiment/Nieuw experiment (naam volgens lokale richtlijnen). Verwijder in de inspecteur de niet-vereiste fluorchromen, waardoor Blue Laser 530/30 en Yellow Laser 610/20 of de aanbevolen laser- en filtercombinaties voor YFP en RFP voor de machine overblijven.
- Klik met de rechtermuisknop op het experiment en kies Cytometerinstellingen / Toepassingsinstellingen / Werkblad maken. Maak op het werkblad een Forward Scatter-Area (FSC-A)/Side Scatter Area (FSC-A) dot blot en YFP histogram, RFP histogram en GFP/YFP dot blot door op het bijbehorende pictogram te klikken en de assen te wijzigen door op het aslabel te klikken.
- Klik met de rechtermuisknop nogmaals op Experiment en voeg Nieuw exemplaar toe. Hernoem indien nodig. Open het monster door op het plusteken te klikken om een nieuwe buis te onthullen.
- Open het acquisitiedashboard vanuit View, laad het niet-geïnfecteerde, niet-getransduceerde besturingselement en druk op Acquire. Pas FSC- en SSC-spanningen in het dashboard aan om cellen in het kwadrant linksonder te plaatsen (geen cellen op de assen). Poort rond deze populatie P1. Klik met de rechtermuisknop op andere percelen en selecteer toon P1 om puin uit de daaropvolgende analyse te verwijderen.
- Laad het besturingselement voor één kleur voor YFP (alleen wild-type SAMHD1) en verkrijg. Pas de YFP-spanning in het dashboard aan zodat de meest fluorescerende cellen zich binnen het bereik van de detector bevinden (niet aan de rand van de as). Herhaal dit voor RFP-besturing met één kleur.
- Voer automatische compensatie uit met behulp van de niet-getransduceerde, niet-geïnfecteerde en eenkleurige besturingselementen.
- Selecteer Experiment > Compensatie instellen > Compensatiebesturingselementen maken in het menu om naar een normaal werkblad te schakelen. Selecteer niet-gekleurd normaal werkblad, druk op Uitvoeren en verwerven voor het niet-gekleurde besturingselement.
- Teken een poort rond de intacte cellen (P1) en noteer. Verwijder de buis en zet het apparaat op stand-by. Klik met de rechtermuisknop op P1, klik op Toepassen op alle compensatiecontroles.
- Schakel over naar het normale RFP-werkblad en druk op Uitvoeren. Neem de RFP-besturing met één kleur op en zet het apparaat op stand-by. De software moet automatisch de positieve populatie selecteren.
- Herhaal dit voor YFP-regeling voor één kleur. Selecteer Experimenteer > compensatie instellen > compensatie berekenen > koppelen en opslaan.
- Schakel over naar het algemene werkblad. Verkrijg de cellen die zijn getransduceerd met wild type SAMHD1, geïnfecteerd met HIV-RFP en controleer of vier verschillende populaties te zien zijn in de hoeken van de kwadranten die verticaal en horizontaal zijn uitgelijnd voor respectievelijk YFP en RFP. Verwijder de buis en druk op Stand-by.
- Laad het niet-getransduceerde, niet-geïnfecteerde monster opnieuw, druk op Uitvoeren en Registreer 30.000 gebeurtenissen met P1 als stoppoort. Herhaal dit voor de resterende monsters (inclusief andere besturingselementen). Wijzig de naam van de voorbeelden tijdens het uitvoeren of post hoc. Eenmaal geëxporteerd, kunnen bestanden niet worden hernoemd.
- Exporteer de gegevens als .fcs-bestanden en reinig de fluidics volgens lokale instructies.
8. Data-analyse
OPMERKING: De stappen die volgen komen overeen met de analyse in FlowJo v10; gelijkwaardige stappen kunnen echter eenvoudig worden uitgevoerd in andere analysesoftware.
- Open de software en sleep alle .fcs-bestanden naar het dashboard. Selecteer de compensatiebesturingselementen en sleep ze naar de compensatiesubmap. Open het bestand voor de niet-getransduceerde, niet-geïnfecteerde buis door te dubbelklikken, waardoor de FSC-A/SSC-A-plot wordt weergegeven.
- Selecteer het gereedschap polygoon en poort op de intacte celpopulatie, met uitzondering van puin in de linkerbenedenhoek. Geef deze cellen de naam. Sleep deze poort naar de hele populatie buizen in de balk Alle monsters . Blader door elk afzonderlijk monster met behulp van de horizontale pijlknoppen om ervoor te zorgen dat gating geschikt is voor elke buis.
- Dubbelklik op de celpopulatie voor het niet-getransduceerde, niet-geïnfecteerde monster en pas de assen aan op FSC-hoogte (H) versus FSC-gebied (A). Selecteer de enkele grote populatie met behulp van een rechthoekige poort om doubletten uit te sluiten. De software zal automatisch voorstellen om deze Single Cells een naam te geven.
- Sleep deze poort naar alle celpopulaties en controleer opnieuw of de gating geschikt is voor alle monsters. Selecteer de single cells populatie voor het niet-geïnfecteerde, niet-getransduceerde monster, verander de assen in gecompenseerde blauwe laser (y, YFP) versus gecompenseerde gele laser (x, RFP). Druk op T op de as en selecteer Biexponentiële schaal voor x en y.
- Selecteer de Quadrant Gating Tool en klik rechtsboven op de negatieve celpopulatie. Pas deze voorlopige gating toe op alle populaties met één cel door naar de balk Alle voorbeelden te slepen. Wanneer de kwadrantpoorten de populaties niet naar behoren scheiden, kan het nodig zijn om individuele kwadranten af te sluiten met behulp van het polygoongereedschap, zoals in figuur 2.
- Scrol naar het wildtype SAMHD1-only sample (alleen YFP) en controleer of de gating tussen de untranduced (YFP negatief) en YFP positive correct is. Het kan helpen om over te schakelen naar contourweergave om negatieve van zwakke YFP-cellen te onderscheiden. Als de bovenste YFP +ve-cellen wijd verspreid zijn, past u de bovenste verticale poort naar rechts aan.
- Blader door alle voorbeelden en controleer de gating met betrekking tot YFP-positiviteit. Gebruik de beste verdeling tussen YFP negatief en positief die geldig is voor alle monsters.
OPMERKING: De compensatie is berekend op basis van het wild-type SAMHD1 YFP-expressieniveau. Als de infectieniveaus sterk verschillen tussen verschillende SAMHD1-YFP-getransduceerde cellen, moet de compensatie mogelijk worden aangepast. Het heeft daarom de voorkeur dat YFP VLP voorafgaand aan gebruik wordt genormaliseerd. - Scrol naar de niet-getransduceerde, hiv-RFP geïnfecteerde buis en controleer of de gating tussen niet-geïnfecteerde RFP-negatieve en geïnfecteerde RFP-positieve correct is. Pas indien nodig aan, gebruik indien nodig de contourweergave en blader door de resterende monsters om te controleren of de gating geldig is voor alle monsters.
- Elk monster vereist dubbele negatieven (Q4: linksonder, niet-getransduceerd, niet-geïnfecteerd), YFP-positief (Q1: linksboven, SAMHD1-expressie, niet-geïnfecteerd), RFP-positief (Q3: rechtsonder, niet-getransduceerd, HIV-geïnfecteerd) en dubbel positief (Q2: rechtsboven, SAMHD1 drukt HIV-geïnfecteerd uit). Open de tabeleditor door op het pictogram te klikken en sleep de vier kwadrantpoorten naar het dashboard. Selecteer Excel Exporteren en klik op Tabel maken. Sla de gegenereerde spreadsheet op volgens de lokale bestandsnaamgevingsconventies.
- Als u representaties van plots en gatingstrategieën wilt exporteren, klikt u op het pictogram Layout Editor . Selecteer elke populatie en sleep naar de editor met de vereiste assen, labeling en spatiëring.
- Als u een lay-out wilt maken met dezelfde plots die voor alle voorbeelden worden weergegeven, selecteert u één kolom en drukt u op Batch. Druk op Schalen naar breedte en vermijd vervolgens pagina-einden. Opslaan in de vereiste bestandsindeling.
- Bereken in de geëxporteerde spreadsheet de beperkingsverhouding door kolommen te genereren van percentage RFP van YFP-ves (RFP+ve / (double negatives + RFP+ve)) en percentage RFP van YFP+ves (double positives / (double positives + YFP+ve)) en vervolgens een laatste kolom van (%RFP van YFP+ve / %RFP van YFP-ve), zie Figuur 1. Gemiddelde van de replicatiegegevens voor elke SAMHD1-constructie en bereken of de beperkingswaarden voor geteste SAMHD1-varianten significant verschillen van wild-type en/of 206-7AA met behulp van geschikte data-analysesoftware.
Representative Results
De resultaten van de bovenstaande analyse moeten een beperkingsverhouding van 0,25 of lager opleveren voor de wild-type SAMHD1 positieve controle en 1,0 voor de negatieve controle. Als deze twee kwaliteitscontroles geldig zijn, overweeg dan de statistische significantie van de resultaten. SAMHD1-varianten die geen significant verschil vertonen met wild type, dragen daarom substituties die in deze context geen invloed hebben op de SAMHD1-beperking. Degenen die significant verschillen van wilde types vertonen een verminderde beperking. Als deze niet significant verschillen van de negatieve controle, missen ze de mogelijkheid om in deze context te beperken (figuur 4 linkerpanelen).
Als de wild-type SAMHD1-beperkingswaarde groter is dan 0,3, kunnen de resultaten voor testervirussen indicatief zijn, maar kunnen ze niet worden vertrouwd. Ineffectieve beperking door wild-type eiwit kan het gevolg zijn van het gebruik van U937-cellen te vroeg na herstel van reconstitutie (binnen 2 weken), of wanneer ze te oud zijn (>2-3 maanden). Deze parameters moeten mogelijk empirisch worden bepaald voor een bepaalde celvoorraad. Doorgaans geldt dat hoe lager de doorgang, hoe betrouwbaarder de cellen differentiëren en daarom de juiste omgeving bieden voor SAMHD1-beperking. Ongepast infectieniveau met SAMHD1-YFP of HIV-RFP kan ook leiden tot problemen met zowel compensatie als downstreambepaling van de beperkingsverhouding. Een voorbeeld wordt geïllustreerd in de rechterpanelen van figuur 4.
Als de negatieve controle afwijkt van 1,0 (buiten het bereik van 0,9-1,2), kan dit wijzen op een probleem met de analyse, hetzij het aandeel geïnfecteerde cellen, gatingstrategie of de gezondheid van de cellen beïnvloeden de test. Raadpleeg de bovenstaande opmerkingen.
Figuur 1: Schematisch schetsprotocol. VLP, virusachtige deeltjes, PMA, phorbol myristate acetaat. Genummerde fasen komen overeen met fasen in het protocol. Figuur geproduceerd met behulp van BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schema van retrovirale plasmiden. (A) Verpakkingsvectoren (B) Transfervectoren (C) VSV-G enveloppenexpressor. Belangrijke coderings- en regelgevingselementen worden weergegeven. Raadpleeg voor meer informatie de materiaaltabel. CMV IE: cytomegalovirus onmiddellijk-vroege promotor, BGH: groeihormoon voor runderen, pA: polyA, RRE: Rev Response Element, CMV-LTR: samengestelde CMV-HIV-1 LTR promotor, Psi: HIV-1 verpakkingssignaal, cPPT / CTS: centraal polypurinekanaal / centrale beëindigingssequentie, SV40: simian vacuolating virus 40. Figuur geproduceerd met behulp van BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Gatingstrategie voor flowcytometrie-analyse. (A) Compensatiecontroles: linkerpaneel toont FSC-A/SSC-A-gating op in-tactcellen voor de niet-getransduceerde, niet-geïnfecteerde controle. Centrale en rechtervensters tonen schermafbeeldingen van compensatiebesturingselementen in één kleur voor YFP (midden) en RFP (rechts) met niet-gecompenseerde gegevens in zwart en gecompenseerd in blauw. (B) Overeenkomstige compensatiematrix en waarnemingspunten voor compensatiecontroles hierboven. (C) Gating-strategie. Vuil wordt geëlimineerd door analyse van alle cellen door FSC-A/SSC-A (linkerpaneel). Doublets worden uitgesloten door te gaten op FSC-hoogte versus -oppervlak (centraal paneel). Het rechterpaneel toont een voorbeeld van HIV-1-beperking door wild-type SAMHD1. Assen tonen gecompenseerde blauwe en gele laserfluorescentie die overeenkomt met respectievelijk YFP (SAMHD1) en RFP (HIV)-positieve cellen. Kwadrantpoorten worden getrokken door vergelijking van negatieve en eenkleurige besturingselementen voor RFP en YFP. Cijfers geven het percentage van de ouderpopulatie aan. Compensatiewaarden voor YFP met GFP zullen veel hoger zijn, maar het is mogelijk om te discrimineren met behulp van geschikte filtersets. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Verwachte resultaten: ideale versus suboptimale gegevens. (A) Representatieve YFP/RFP-plots voor optimale (links) en suboptimale (rechts) gegevens. Cijfers geven het percentage van de ouderpopulatie aan. In het rechterpaneel is de hiv-infectie te laag, waardoor er problemen zijn met compensatie en gating. De restrictieratio is met 0,5 hoger dan verwacht. (B) Waarnemingspunten van de beperkingsverhouding voor varianten van SAMHD1 met betrekking tot wild type (WT, rood) of de negatieve controle (HD206-7AA, zwart) gegenereerd met behulp van statistische software. Elk punt vertegenwoordigt een replicatiewaarde. Gemiddelde en standaarddeviatie worden weergegeven. Gepaarde t-tests tussen elke groep waren significant in alle gevallen te verwachten waar getoond. Links: Ideale gegevens - WT toont de verwachte beperking van ongeveer 0,2, negatief toont 1,0. De variant R372D (grijs) verschilt aanzienlijk van WT, maar is niet significant van de negatieve controle en heeft dus het vermogen om te beperken verloren. Rechts: Suboptimale gegevens. Hier gedraagt het negatieve zich zoals verwacht, maar in alle zes replicaties vertoont de WT slechts een beperkingsratio van 0,5, vanwege de lage infectiegraad. De lage variantie binnen de groepen betekent dat R143H een intermediair fenotype vertoont dat statistisch verschilt van WT en het negatieve, terwijl G209S niet beperkt; dit moet echter worden herhaald met verse cellen, omdat de positieve controle niet de verwachte beperkingsverhouding heeft gegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Zoals besproken in de bovenstaande opmerkingen, zijn de kritieke aspecten van het protocol gericht op het behouden van het juiste celfenotype voor VLP-productie en voor het creëren van de juiste omgeving voor het observeren van SAMHD1-beperking. Ten eerste is de nauwkeurige analyse van beperking door tweekleurige flowcytometrie afhankelijk van het bereiken van geschikte verhoudingen van getransduceerde en geïnfecteerde cellen, zodat er voldoende cellen in elk gebied van het plot zijn voor analyse. Als zodanig moet de onderzoeker streven naar een MOI van minder dan 1 (zie Protocol). Transductie- en infectiepercentages die te hoog of te laag zijn, leiden tot problemen met de analyse als gevolg van een gebrek aan niet-geïnfecteerde of dubbel geïnfecteerde cellen. Evenzo is een vergelijkbare transductiesnelheid voor SAMHD1-vectoren die moeten worden vergeleken, de sleutel tot het mogelijk maken van dezelfde compensatiematrix en gating om op het hele experiment te worden toegepast, waardoor het vertrouwen in de daaropvolgende analyse toeneemt.
Ten tweede is de leeftijd van de gebruikte U937-cellen een belangrijke factor in de vraag of ze met succes differentiëren. Succesvolle differentiatie kan worden gecontroleerd door observatie van therapietrouw, een verminderde verzuring van de media in de loop van de tijd na differentiatie en adequate beperking door de wildtype positieve controle in de test. Differentiatie van maximaal 5 dagen is succesvol geweest.
Een van de belangrijkste voordelen van deze test is de flexibiliteit. Een verscheidenheid aan gemodificeerde versies van SAMHD1 (domeinen, aminozuren, soortensequenties) kan worden getest via eenvoudige site-gerichte mutagenese van de vector of klonen. Ook varianten van het testervirus kunnen worden onderzocht. De test is eerder gebruikt om aan te tonen dat HIV-1 reverse transcriptase mutanten met verminderde capaciteit om dNTP te binden gevoeliger zijn voor SAMHD1-beperking. Hetzelfde principe kan worden gebruikt om de beperking van andere virussen door SAMHD1 te testen. Bovendien kunnen verschillende differentiatieomstandigheden of kunstmatige manipulatie van intracellulaire dNTP-concentraties worden gebruikt om de interactie tussen intracellulaire aandoeningen en SAMHD1-activiteit, een gebied van actief onderzoek in het Bishop-lab, verder te onderzoeken. De interactie van SAMHD1 met verschillende nucleoside reverse transcriptaseremmers is ook beschreven en het effect van SAMHD1 aangetoond met behulp van deze test aangepast voor gebruik in primaire cellen 12,13,14,15.
Aanpassing van het protocol voor gebruik in primaire cellen overwint de beperking die wordt gesteld door metabole fenotypen in getransformeerde cellen te onderzoeken. Het bestaande formaat maakt echter een handig en minder technisch uitdagend protocol mogelijk voor analyse met hoge doorvoer, vooral met behulp van een flowcytometer met een sampler met hoge doorvoer. Bij het aanpassen van het protocol moet rekening worden gehouden met de gevoeligheid van de inwendig niet-getransformeerde cellen voor omstandereffecten (bijv. Immuunsignalering).
Zoals met veel aspecten van celbiologie, is het essentieel dat dergelijke testen worden gebruikt als onderdeel van een holistische benadering voor het begrijpen van een bepaald fenomeen. Het parallelle gebruik van biochemische assays voor SAMHD1-activiteit16, kwantificering van intracellulaire dNTP-pools en observatie van SAMHD1-mutante fenotypen bij mensen, ex vivo en in diermodellen (uitgevoerd door laboratoria over de hele wereld, sommige beschreven in dit nummer) zijn de sleutel tot het evoluerende begrip van dit complexe eiwit.
Disclosures
Ten behoeve van Open Access hebben de auteurs een CC BY-licentie voor openbaar auteursrecht toegepast op elke door de auteur geaccepteerde manuscriptversie die voortvloeit uit deze inzending. De geuite meningen zijn die van de auteur (s) en niet noodzakelijkerwijs die van het NIHR of het ministerie van Volksgezondheid en Sociale Zorg.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het Francis Crick Institute, dat zijn kernfinanciering ontvangt van Cancer Research UK (FC001042 en FC001162), de UK Medical Research Council (FC001042 en FC001162) en de Wellcome trust (FC001042 en FC001162) en door een Wellcome Trust Investigator Award aan JPS (108012/Z/15/Z). Het werk aan de Universiteit van Cambridge werd medegefinancierd door het NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, The Evelyn Trust (16/21), The Rosetrees Trust (M590) en de UK Medical Research Council (MR/S009752/1). De laatste door het VK gefinancierde prijs maakt deel uit van het EDCTP2-programma dat door de Europese Unie wordt ondersteund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| 0.45 µm syringe filters | Sartorius | FCT122 | |
| 10 cm dishes | Corning | 430167 | virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance |
| 12 well plates | Greiner | 665180 | |
| 24 well plates | Greiner | 662160 | |
| BD LSRFortessa cell analyzer | BD Bioscience | 649225 | alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence |
| DMEM | Sigma | D6429 | ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. |
| DMSO | Fisher | BP-231-100 | |
| fetal bovine serum | Gibco | 10500064 | |
| Flowjo | BD Bioscience | - | alternative analysis software can be used |
| light microscope | - | - | Any bright field light microscope |
| p8.91 | - | - | HIV GagPol expressor (PMID: 8602510) |
| paraformaldehyde (4 % in PBS) | Alfa Aesar | J61889 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher | 15140122 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma | P8139 | |
| polybrene | Sigma | TR-1003 | |
| pKB4 | - | - | Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841) |
| pLGatewaySAMHD1eYFP | - | - | MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1). |
| pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP |
- | - | As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues |
| Prism | Graphpad | - | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable |
| pVSV-G | - | - | VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/) |
| RPMI | ThermoFisher | 21875034 | |
| screw-cap tubes | StarLab | E1415-2231 | |
| SCRPSY | - | - | HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/ |
| stripettes 10 mL | Corning | 10084450 | |
| stripettes 5 mL | Corning | 10420201 | |
| TrypLE express | Gibco | 12604021 | Trypsin will also be suitable |
| Turbofect | ThermoFisher | R0531 | alternative transfection reagents will also work well |
| U937 cells | ATCC | CRL-1593.2 |
References
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
- Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
- Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).
- Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10 (2010).
- Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
- Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
- Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
- Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
- Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, Clifton, N.J. 27-35 (2009).
- Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
- Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
- Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
- Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
- Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).
