Aluminiumfolie werd microchirurgisch ingebracht tussen de teelballen van Spodoptera litura om de fusie van testis te belemmeren. De procedure omvat invriezen, bevestigen, desinfecteren, incisie, plaatsen van de barrière, hechten, postoperatief voeren en inspectie. Deze aanpak biedt een methode om weefselvorming te verstoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Microchirurgische obstructie van teelballenfusie in Spodoptera litura
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In plaats van genetische methoden zoals RNA-interferentie (RNAi) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen (CRISPR) / CRISPR-geassocieerde endonuclease Cas9 te gebruiken, werd een fysieke barrière microchirurgisch ingebracht tussen de teelballen van Spodoptera litura om de impact van deze microchirurgie op de groei en reproductie ervan te bestuderen. Na het inbrengen van aluminiumfolie tussen de teelballen verliep de insectenvervelling tijdens de metamorfose normaal. De groei en ontwikkeling van insecten waren niet opmerkelijk veranderd; het aantal spermabundels veranderde echter als de fusie van teelballen werd gestopt door de microchirurgie. Deze bevindingen impliceren dat het blokkeren van testiculaire fusie het mannelijke voortplantingsvermogen kan beïnvloeden. De methode kan verder worden toegepast om de communicatie tussen organen te onderbreken om de functie van specifieke signaalroutes te bestuderen. In vergelijking met conventionele chirurgie vereist microchirurgie alleen bevriezingsanesing, wat de voorkeur heeft boven kooldioxide-anesthesie. Microchirurgie minimaliseert ook het operatiegebied en vergemakkelijkt de wondgenezing. De selectie van materialen met specifieke functies moet echter verder worden onderzocht. Het vermijden van weefselletsel is cruciaal bij het maken van incisies tijdens de operatie.
Inleiding
Fusie is een veel voorkomend fenomeen bij de ontwikkeling van weefsels of organen. Voorbeelden zijn dorsale sluiting en thoraxsluiting bij Drosophila1 en morfogenese van het gehemelte, morfogenese van neurale buizen en morfogenese van het hart bij muizen en kippen2. CRISPR en RNAi zijn toegepast om de rol van genen in het fusieproces te onderzoeken2,3,4.
Spodoptera litura (S. litura, Lepidoptera: Noctuidae) is een schadelijke polyfagote plaag die wijd verspreid is in tropische en subtropische gebieden van Azië, waaronder China4,5,6. De brede verspreiding van S. litura wordt deels toegeschreven aan zijn krachtige voortplantingsvermogen, dat relevant is voor de ontwikkeling van geslachtsklieren. Mannelijke onvruchtbaarheid is een benadering om deze plaag onder controle te houden. Zoals te zien is in de schematische figuur van de testiculaire structuur, worden de testikels omsloten door de testiculaire schede, inclusief de externe schede (peritoneale schede) en de binnenste basale lamina. De basale lamina strekt zich inwendig uit tot het folliculaire epitheel en scheidt het binnenste gedeelte van de testis in vier kamers genaamd follikels (figuur 1).
In de follikels ontwikkelt spermatogonia zich na mitose en meiose tot spermatozoa en vervolgens worden de spermatozoa in de spermazakken in dezelfde richting uitgelijnd om spermabundels te vormen7. Tijdens spermatogenese differentiëren de primaire spermatocyten in eupyreensperma's of apyreensperma's. Spermatocyten in de larvale fase ontwikkelen zich tot eupyreensperma met een lange staart verbonden met een kop van een langwerpige kern; deze kunnen eieren bevruchten. Omgekeerd ontwikkelen spermatocyten in de mid-popale fase zich tot apyreensperma met een afgedankte kern; deze zaadcellen helpen bij de overleving, beweging en bevruchting van eupyreensperma9,10. De 6e dag van de pop is de periode waarin de teelballen overvloedige eupyreen- en apyreenspermabundels hebben.
Figuur 1: Schematisch diagram van de testiculaire structuur van Lepidoptera insecten11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Testiculaire fusie komt voor bij de meeste insecten van de Lepidoptera-orde11,12, vooral bij die soorten die landbouwongedierte zijn. Testiculaire fusie verwijst naar een paar testikels die bilateraal groeien in de larvale fase, elkaar naderen en zich aan elkaar hechten en uiteindelijk integreren in een enkele gonade11. In Spodoptera litura gebeurt het tijdens metamorfose van het larvale naar het popstadium. Vanaf dag 1 van de 5e instar (L5D1) tot dag 4 van de 6e instar (L6D4) groeit het paar teelballen geleidelijk in omvang en wordt de kleur lichtgeel van ivoorwit. Het wordt zwak rood als het de prepupale fase bereikt (L6D5 tot L6D6). Twee bilaterale symmetrische teelballen naderen elkaar tijdens het prepupale stadium, versmelten tot één en draaien tegen de klok in (doral view) om een enkele testis te produceren in de pop- en volwassen fase11. Dit fenomeen komt niet voor bij zijderupsen, die een aanzienlijk economisch belang hebben en al 5000 jaar worden gedomesticeerd13. Er wordt dus aangenomen dat de fusie van de teelballen het voortplantingsvermogen verbetert.
Om de betekenis van Spodoptera litura testiculaire fusie te bepalen, is het belangrijk om de effecten van het blokkeren van het proces te onderzoeken. In dit protocol werd aluminiumfolie microchirurgisch ingebracht tussen de teelballen om ze gescheiden te houden, en de daaruit voortvloeiende veranderingen in de ontwikkeling van de insecten en hun teelballen werden bestudeerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Insectenopfok en -onderhoud
- Kweek de Spodoptera litura-larven in omgevingssimulatiekamers met een kunstmatig dieet totdat ze dag 4 van de 6e instar (L6D4) bereiken. Selecteer mannelijke larven wanneer de wormen de eerste dag van de 6e instar (L6D0) binnenkomen op basis van de omgekeerde driehoekvormige structuur op het achtste achterlijf14.
OPMERKING: De kweek- en onderhoudstechnieken voor larven zijn eerder gepubliceerd4,14.
2. Prechirurgische bereiding
- Snijd de aluminiumfolie in rechthoekige stukken met afgeronde hoeken (1 mm x 2 mm, figuur 2).
- Steriliseer het operatieplatform en gerelateerde items (tafeloppervlak, microscoop, ijskast, insectendoos, wasbak, pinnen en draad) door 75% alcohol op hun oppervlak te spuiten en af te vegen.
- Steriliseer chirurgisch gereedschap (inclusief de aluminiumfolie) met een hogedrukstoomsterilisator gedurende 30 minuten en plaats ze in een verwarmings- en droogoven bij 120 °C.
- Zorg ervoor dat de operators schone laboratoriumkleding, chirurgische maskers en steriele handschoenen dragen.
3. Microchirurgische plaatsing van een barrière tussen de teelballen
OPMERKING: De algemene werkstroom is als volgt: Invriezen → fixeren → desinfectie → incisie → barrièreplaatsing → hechten→ postoperatieve voeding en inspectie
- Plaats mannelijke larven (L6D4) gedurende 10-30 minuten op ijs om ze tijdens de operatie verdoofd te houden.
- Plaats een larve op de wasbak met de dorsale kant naar boven en bevestig vervolgens de kop en de staart van de larve met pinnen en draden, waarbij het operatiegebied het dorsale oppervlak op het 9e lichaamssegment wordt weergegeven (figuur 3A).
- Desinfecteer het operatiegebied door 3% jodiumtinctuur met een wattenstaafje op de opperhuid (9e lichaamssegment) aan te brengen, gevolgd door 70% alcohol om het jodium te verwijderen (figuur 3B).
OPMERKING: Focus op de larve door grove en fijne afstelling van de chirurgische microscoop (figuur 3C). Plaats het wasbakje op een grotere kweekschaal gevuld met ijs om de verdoving te bewaren. - Maak een 2 mm lange incisie op de dorsale epidermis van het 9e lichaamssegment. Gebruik vervolgens een steriel wattenstaafje om lekkende hemolymfe- en vetlichamen te verwijderen en een duidelijk beeld van het operatiegebied te krijgen.
OPMERKING: Het is belangrijk om het hart te vermijden tijdens de procedure. Dit kan worden gedaan door de incisie iets naast de middellijn in het 9e lichaamssegment of bij het gewricht tussen het 9e en 10e lichaamssegment te maken om te voorkomen dat de teelballen eruit springen als gevolg van de larvale interne druk. Maak tijdens het gebruik van het scalpel eerst een verticale spleet met het mes (figuur 4A) en draai deze vervolgens 45° naar de opperhuid voordat u gelijkmatig en continu door de opperhuid snijdt (figuur 4B). - Gebruik een chirurgisch pincet om een stuk aluminiumfolie tussen de teelballen in te brengen (figuur 5).
- Sluit aan het einde van de operatie de incisie om infectie te voorkomen en laat de larven herstellen van de operatie.
- Sluit de opperhuid met een lopende hechting (figuur 6).
- Gebruik een naaldhouder en een chirurgisch pincet om een chirurgische vierkante knoop te binden, waarvoor twee tegengestelde spiegelbeeldige eenvoudige knopen nodig zijn (figuur 6D, E).
- Gebruik een schaar om de overtollige hechtdraad van de lusstaarten te knippen, waardoor een draad van 2 mm achterblijft.
- Leg na het hechten de larve voorzichtig in de kweekbak en onderhoud ze in een schone omgevingssimulatiekamer. Blijf de larven observeren.
OPMERKING: De wond stopt met het lekken van hemolymfe en de larven herstellen geleidelijk na de operatie. De wormen blijven hun metamorfose voltooien.
Figuur 2: Fysieke barrière voorbereid met aluminiumfolie (1 mm x 2 mm). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Vóór incisie. (A) Het fixeren van de larve. (B) Desinfectie van de opperhuid van het operatiegebied. C) Het uitvoeren van een operatie onder de microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Incisie. (A) Snijd de larven verticaal met het mes. (B) Draai het mes 45° in de richting van de opperhuid voordat u doorsnijdt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Het inbrengen van de fysieke barrière (aluminiumfolie) tussen de teelballen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Hechten. (A) Steek de naald in. (B) Trek de naald terug. (C) Trek de naald op en klem deze vast. (D) Knoop de eerste eenvoudige knoop. (E) Knoop de tegengestelde spiegelbeeldige eenvoudige knoop. (F) Knip overtollige hechtdraad door. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De effecten van microchirurgie op de groei en ontwikkeling van Spodoptera litura
De microchirurgie liet een 2 mm lange wond achter op de dorsale larvale epidermis die uiteindelijk stopte met het lekken van hemolymfe en genas. De larven doorliepen prepupale en popstadia en sloten zich af, wat aangeeft dat de microchirurgie geen grote invloed had op groei en ontwikkeling. Toen de larven tot poppen vermolten, werden de hechtdraden samen met de opperhuid weggego...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Na microchirurgisch belemmeren van teelballenfusie in Spodoptera litura, nam het aantal spermabundels af, wat de hypothese ondersteunde dat deze fusie gunstig is voor het voortplantingsvermogen. Chirurgische manipulatie wordt al sinds het begin van de 20e eeuw gebruikt om de fysiologische ontwikkeling van insecten te bestuderen. Om te bepalen of de hersenzenuw wordt gereguleerd door metamorfose van insecten, voerden sommige onderzoekers procedures uit zoals ligatie en onthoofding op verschillende inse...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Nrs.:31772519, 31720103916; ) en een open subsidie van het State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, South West University (Nr.: sklsgb2013003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 75% Wrijfalcohol | Qingdao Hainuo Nuowei Disinfection Technology Co., Ltd | Q/370285HNW 001-2019 | |
| Gekleurde prikpennen | Deli Group Co.,LTD | 0042 | |
| Hoornvlijmschaar | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-S221A | Geboogde en stompe punt |
| Glad Aluminiumfolie | Clorox China(Guangzhou) Limited | 831457 | 10 cm*2,5 cm*0,6 |
| Medische wattenstaafjes (Steriele) | Winner Medical Co., Ltd. | 601-022921-01 | |
| Medische Jodiumkatoenen staafje | Winner Medical Co., Ltd. | 608-000247 | |
| Naaldhouder | Shanghai Medical Instruments (Group) Ltd., Corp. | J32030 | 14 cm fijne naald |
| Steriele chirurgische mesjes | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | #11 | |
| Mesjeshouder | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Supplies Co., LTD | K6-10 | Recht 3# |
| Hechtdraad met naald | Ningbo Medical Stitch Needle Co., Ltd | naald: 3/8 Cirkel, 2,5*8 ; Draad: Nylon, 6/0, 25 cm | |
| Bindtangen | Suzhou Xiehe Medical Device Co., Ltd | MR-F201T-3 | Rechte punt; lange handgreep; 0,12 mm-brede kop |
Referenties
- Zeitlinger, J., Bohmann, D. Thorax closure in Drosophila: involvement of Fos and the JNK pathway. Development. 126 (17), 3947-3956 (1999).
- Ray, H. J., Niswander, L. Mechanisms of tissue fusion during development. Development. 139 (10), 1701-1711 (2012).
- Ducuing, A., Keeley, C., Mollereau, B., Vincent, S. A. DPP-mediated feed-forward loop canalizes morphogenesis during Drosophila dorsal closure. The Journal of Cell Biology. 208 (2), 239-248 (2015).
- Du, Q., et al. Identification and functional characterization of doublesex gene in the testis of Spodoptera litura. Insect Science. 26 (6), 1000-1010 (2019).
- Qin, H. G., Ding, J., Ye, Z. X., Huang, S. J., Luo, R. H. Dynamic analysis of experimental population of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 13 (2), 45-48 (2004).
- Guan, B. B., et al. The research in biology and ecology of Spodoptera litura. Journal of Biosafety. 8 (1), 57-61 (1999).
- Wen, L., et al. The testis development and spermatogenesis in Spodopture litura (lepidoptera: noctuidae). Journal of South China Normal University (Natural Science Edition. 51 (4), 47-56 (2019).
- Friedländer, M., Seth, R. K., Reynolds, S. E. Eupyrene and apyrene sperm: dichotomous spermatogenesis in Lepidoptera. Advances in Insect Physiology. 32, 206(2010).
- Cook, P. A., Wedell, N. Non-fertile sperm delay female remating. Nature. 397 (6719), 486(1999).
- Iriki, S. On the function of apyrene spermatozoa in the silk worm. Zoological Magazine. 53, 123-124 (1941).
- Liu, L., Feng, Q. L. The study of fusion of testis in Lepidoptera insects. Journal of South China Normal University (Natural Science Edition). 46 (5), 1-7 (2014).
- Klowden, M. J. Physiological systems in insects. , Elsevier/Academic Press. Amsterdam, NL; Boston, MA. (2007).
- Xu, J., et al. Transgenic characterization of two testis-specific promoters in the silkworm, Bombyx mori. Insect Molecular Biology. 24 (2), 183-190 (2015).
- Guo, X. R., Zheng, S. C., Liu, L., Feng, Q. L. The sterol carrier protein 2/3-oxoacyl-CoA thiolase (SCPx) is involved in cholesterol uptake in the midgut of Spodoptera litura: gene cloning, expression, localization and functional analyses. BioMed Central Molecular Biology. 10, 102(2009).
- Kopeć, S. Studies on the necessity of the brain for the inception of insect metamorphosis. Biological Bulletin. 42 (6), 323-342 (1922).
- Wigglesworth, V. B. Factors controlling moulting and 'metamorphosis' in an insect. Nature. 133 (5), 725-726 (1934).
- Williams, C. N. Physiology of insect diapause; the role of the brain in the production and termination of pupal dormancy in the giant silkworm, Platysamia cecropia. Biological Bulletin. 90 (3), 234-243 (1946).
- Fukuda, S. Hormonal control of molting and pupation in the silkworm. Proceedings of the Imperial Academy Tokyo. 16 (8), 417-420 (1940).
- Tian, H. J., Liu, Z. P., Bai, Y. Y. Common methods to detect Sperm quality of mammalian. Journal of Economic Zoology. 8 (4), 198-201 (2004).
- Ji, X. S., Chen, S. L., Zhao, Y., Tian, Y. S. Progress in the quality evaluation of fish sperm. Chinese Fishery Science. 14 (6), 1048-1054 (2007).
- Baulny, B. O. D., Vern, Y. L., Kerboeuf, D., Maisse, G. Flow cytometric evaluation of mitochondrial activity and membrane integrity in fresh and cryopreserved rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) spermatozoa. Cryobiology. 34 (2), 141-149 (1997).
- Krasznai, Z., Márián, T., Balkay, I., Emri, M., Trón, L. Permeabilization and structural changes in the membrane of common carp (Cyprinus carpio L.) sperm induced by hypo-osmotic shock. Aquaculture. 129 (1), 134(1995).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry & Physiology Toxicology & Pharmacology Cbp. 130 (4), 425-433 (2001).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardized fertilization in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55 (3), 751-769 (2001).
- Seth, R. K., Kaur, J. J., Rao, D. K., Reynolds, S. E. Effects of larval exposure to sublethal concentrations of the ecdysteroid agonists RH-5849 and tebufenozide (RH-5992) on male reproductive physiology in Spodoptera litura. Journal of Insect Physiology. 50 (6), 505-517 (2004).
- Sweeney, R. M., Watterson, R. L. Rib development in chick embryos analyzed by means of tantalum foil blocks. American Journal of Anatomy. 126 (2), 127-149 (1969).
- Wilde, S., Logan, M. P. Application of impermeable barriers combined with candidate factor soaked beads to study inductive signals in the chick. Journal of Visualized Experiments. (117), e54618(2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
