O melanoma é uma doença muito agressiva que rapidamente se espalha para outros órgãos. Este protocolo descreve a aplicação de imagens de ultrassom de ultra-alta frequência, juntamente com renderização 3D, para monitorar o volume dos linfonodos inguinais no modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático.
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Artigo de método
Análise do volume do nódulo linfático por ultra-alta frequência ultrassom no modelo de camundongos geneticamente modificado braf/pten de melanoma
Neste artigo
Resumo
Resumo
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox camundongos geneticamente modificados (camundongos Braf/Pten) são amplamente utilizados como um modelo in vivo de melanoma metastático. Uma vez que um tumor primário tenha sido induzido pelo tratamento de tamoxifen, um aumento da carga metastática é observado dentro de 4-6 semanas após a indução. Este artigo mostra como imagens ultra-altas de frequência ultra-alta-freqüência ultrasound (UHFUS) podem ser exploradas para monitorar o aumento do envolvimento metastático dos linfonodos inguinais medindo o aumento de seu volume.
O sistema UHFUS é usado para digitalizar camundongos anestesiados com uma sonda linear UHFUS (22-55 MHz, resolução axial de 40 μm). As imagens do modo B dos linfonodos inguinais (ambos os lados esquerdo e direito) são adquiridas em uma visão de eixo curto, posicionando os animais em recumbência dorsal. Os registros de ultrassom são adquiridos usando um tamanho de passo de 44 μm em um braço mecânico motorizado. Posteriormente, aquisições bidimensionais (2D) do modo B são importadas para a plataforma de software para pós-processamento de imagens de ultrassom, e os linfonodos inguinais são identificados e segmentados semi-automaticamente nas imagens 2D transversais adquiridas. Finalmente, uma reconstrução total do volume tridimensional (3D) é obtida automaticamente juntamente com a renderização do volume do linfonodo, que também é expressa como uma medição absoluta.
Esta técnica in vivo não invasiva é muito bem tolerada e permite o agendamento de múltiplas sessões de imagem no mesmo animal experimental ao longo de 2 semanas. É, portanto, ideal avaliar o impacto do tratamento farmacológico sobre a doença metastática.
Introdução
O melanoma é uma forma agressiva de câncer de pele que muitas vezes se espalha para outros locais de pele (metástases subcutâneas), bem como para linfonodos, pulmões, fígado, cérebro e ossos1. Na última década, novos medicamentos foram introduzidos na prática clínica e contribuíram para melhorar a expectativa de vida de pacientes com melanoma metastático. No entanto, permanecem limitações, incluindo tempo variável e grau de resposta, efeitos colaterais graves e a insurgência da resistência adquirida1. Portanto, é crucial detectar a propagação metastática em seus estágios iniciais, ou seja, quando chega aos linfonodos loc....
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Protocolo
Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Ministério da Saúde italiano (protocolos animais nº 754/2015-PR e nº 684/2018-PR).
1. Indução de melanoma
NOTA: Tyr de seis semanas de idade::CreER+, BrafCA/+,Ratos Ptenlox/lox [B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten)] foram usados neste estudo (ver a Tabela de Materiais).
- Trate os camundongos com 4-hidroxitamoxifen (4-HT) aplicando 3 μL de 5 mM 4-HT em ~1 cm2 de pele raspada da parte superior das costas, como descrito anteriormente11,....
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Resultados
Após a pintura da pele de Tyr:::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox ratos com 4-HT, a atividade cre é induzida, devido à qual há uma mudança no nível genômico de wt Braf para BrafV600E, enquanto Pten é perdido (Figura 3A). Em 2-3 semanas, camundongos desenvolvem tumores primários no local com 100% de penetração. Após quatro semanas a partir do tratamento 4-HT (t0), os tumores primários atingem um volume de 50-100 mm3, e seu crescimento po.......
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Discussão
Os dados obtidos neste estudo atestam a capacidade da ultrassom de monitorar o envolvimento metastático de linfonodos inguinais do modelo de camundongo Braf/Pten de melanoma metastático. Como mostrado anteriormente16, esta técnica é especialmente útil para avaliar a eficácia do tratamento medicamentoso. Isso porque permite o monitoramento da alteração no volume de linfonodos no mesmo animal ao longo do tempo, comparando as medidas coletadas no t1 andt2 com as cole.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores gostariam de agradecer a S. Burchielli (FTGM, Pisa) por sua ajuda com procedimentos animais. Este trabalho foi apoiado pelo ISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologica financiamento institucional para lp; MFAG #17095 concedido pela AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro ao LP.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| 4-hidroxitamoxifeno | Merck | H6278 | medicamento usado para indução tumoral |
| B6. Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) camundongos | The Jackson Laboratory | 013590 | |
| Blu gel | Sooft Ialia | solução oftálmica gel | |
| BRAFV600E anticorpo | Spring Bioscience Corporation | E19290 | |
| IsoFlo (isoflorano) | Zoetis | líquido para anestesia gasosa | |
| MLANA anticorpo | Thermo Fisher Gel Scientific | M2-7C10 | |
| Sigma Parker | gel de eletrodo | ||
| Gel transônico transparente | Telic SAU | gel de ultrassom | |
| Veet | Reckitt Benckiser IT | creme depilatório | |
| Sistema compacto de anestesia dupla | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Sistema de anestesia à base de isoflurano equipado com cone nasal e câmara de indução | |
| MX550S | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Sonda linear UHFUS | |
| Vevo 3100 | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Sistema UHFUS | |
| Estação de imagem Vevo | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Estação de imagem UHFUS e Unidade de Monitoramento Fisiológico Avançado dotada de placa aquecida | |
| Vevo Lab | Fujifilm, Visualsonics Inc. | Plataforma de software para pós-processamento de imagens de ultrassom |
Referências
- Schvartsman, G., et al. Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice. Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).
- Blum, A., et al.
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Reimpressões e permissões
