Summary
Detta protokoll för immunofluorescerande märkning av både växtvirusproteiner och vektorinsektsproteiner i utskurna insektstrån kan användas för att studera interaktioner mellan virus- och vektorinsekter, insektsproteinfunktioner och molekylära mekanismer bakom virusöverföring.
Abstract
De flesta växtvirus i naturen överförs från en växt till en annan av hemipteran insekter. En hög populationstäthet av vektorinsekter som är mycket effektiva vid virusöverföring spelar en nyckelroll i virusepidemier på fält. Att studera virus-insektsvektorinteraktioner kan öka vår förståelse av virusöverföring och epidemier i syfte att utforma nya strategier för att kontrollera växtvirus och deras vektorinsekter. Immunofluorescensmärkning har använts i stor utsträckning för att analysera interaktioner mellan patogener och värdar och används här i den vitryggiga växthopparen (WBPH, Sogatella furcifera), som effektivt överför södra risets svarta streckade dvärgvirus (SRBSDV, släktet Fijivirus, familjen Reoviridae), för att lokalisera virionerna och insektsproteinerna i midgutepitelcellerna. Med hjälp av laserskanningskonfokalmikroskopi studerade vi de morfologiska egenskaperna hos midgutepitelceller, cellulär lokalisering av insektsproteiner och samlokalisering av virioner och ett insektsprotein. Detta protokoll kan användas för att studera virusaktiviteter hos insekter, funktioner hos insektsproteiner och interaktioner mellan virus och vektorinsekter.
Introduction
De mest beskrivna växtvirusen överförs av insekter från ordningen Hemiptera som inkluderar bladlöss, vitflugor, bladhoppare, växthoppare och thrips 1,2. De piercing-sugande munstyckena av hemipteraninsekter genomborrar växtvävnaden för att mata och utsöndra saliv, samtidigt som viruset överförs effektivt2. Olika överföringsmekanismer av växtvirus av vektorinsekter har beskrivits. Dessa inkluderar icke-beständiga, semipersistent och persistenta. Den långlivade typen är antingen icke-förökningsbar eller förökningsmedel3,4, men för båda dessa typer måste det överförda viruset röra sig genom insektens kropp. I persistent-propagative mode infekterar och replikerar virus initialt i epitelcellerna i insektens tarm, sprider sig sedan till olika vävnader och så småningom in i spottkörtlarna, varifrån de sedan kan införas i en växt genom saliven under insektsmatning 5,6. Långlivade överförda virus rör sig genom olika organ och replikeras i sina insektsvektorer, vilket kräver specifika interaktioner mellan virus och vektorkomponenter i olika stadier 7,8.
Virala proteiner och insektsproteiner måste interagera för att underlätta kritiska processer för virusigenkänning, infektion, replikation eller spridning i vektorinsekterna 9,10. Även om optisk mikroskopi kan användas för att observera cellulära strukturer hos insekter, kan den inte visa virionfördelning, cellulär lokalisering eller samlokalisering av virala proteiner och insektsprotein eller ultrastrukturen hos insektsvävnader och celler. Immunofluorescensmärkning utfördes först av Coons et al. i musens fagocytiska celler genom märkning av specifika fluoresceinantikroppar, och nu används den i stor utsträckning11. Immunofluorescenstekniken, även känd som fluorescensantikroppstekniken, är en av de tidigaste immunologiska märkningsteknikerna som utvecklats och baseras på den specifika bindningsreaktionen mellan antigenet och antikroppen11,12. Den kända antikroppen märks först med fluorescein, som används som en sond för att detektera motsvarande antigener i cellerna eller vävnaderna13,14. Efter att den fluoresceinmärkta antikroppen binder till motsvarande antigen i celler eller vävnader kommer sonden att avge ljus fluorescens när den bestrålas med excitationsvåglängder och ses med ett fluorescensmikroskop för att lokalisera antigenet15.
De flesta vektorinsekter av växtvirus är hemipteraner. En högre befolkningstäthet av vektorinsekter som har en hög överföringseffektivitet för växtviruset kan leda till virusepidemier5. Sydligt risstrimmigt dvärgvirus (SRBSDV, släktet Fijivirus, familjen Reoviridae), en av de allvarligaste patogenerna för ris, har snabbt spridit sig över risodlingsområden i Öst- och Sydostasien och orsakat allvarliga avkastningsförluster sedan 201016,17. Vuxna och nymfer av den vitryggade växthopparen (WBPH, Sogatella furcifera Horváth) överför SRBSDV till ris på ett ihållande förökningssätt med hög effektivitet. Fältstudier har visat att utbrott av SRBSDV-inducerad rissvartstrimmig dvärgsjukdom vanligtvis sammanfaller med massmigration av WBPH, en avgörande faktor i SRBSDV-epidemier 7,8,18. Vesikelassocierat membranprotein 7 (VAMP7) är en löslig N-etylmaleimidkänslig faktorbindningsproteinreceptor (SNARE), som kan förmedla transport av ämnen via vesikelfusion. VAMP7 interagerar med det yttre huvudkapsidproteinet i SRBSDV in vitro, vilket indikerar att VAMP7 kan vara nära associerat med virusöverföring16.
I protokollet som presenteras här skar vi ut tarmen från viruliferös WBPH som ett exempel för att märka SRBSDV-virioner och VAMP7 i midgutepitelceller16. Som den första invasionsplatsen för virus spelar midgutepitelet viktiga roller vid virusinfektion, replikering och överföring. Först detaljerade vi stegen för att skära tarmen från nymfer och vuxna av WBPH. För det andra använde vi specifika fluoresceinmärkta antikroppar för att märka SRBSDV-virioner och VAMP7 i tarmepitelceller. Sedan observerade vi epitelceller och den cellulära placeringen av virionerna och VAMP7 via ett laserskanningskonfokalmikroskop. Resultaten visade att SRBSDV-virioner och VAMP7 kunde samlokaliseras i cytoplasman i midgutepitelcellerna, vilket tyder på att VAMP7: s specifika funktion kan vara relaterad till spridning av virioner från midgutepitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Icke-viruliferös insektsuppfödning
- Samla WBPHs från risfält och bak med risplantor i 1 L glasbägare täckta med insektssäkert nät i en inkubator vid 28 °C med 16 h ljus och 8 h mörk. Eftersom SRBSDV inte överförs via ägg är nykläckta nymfer inte viruliferösa.
- Med en penselpenna borstar du försiktigt insekter från bägarens uppfödningsinsekter till en ny bägare med färska risplantor varje vecka tills WBPH-nymfer har kläckts. Fortsätt att föda upp dessa kläckta icke-viruliferösa nymfer till 2- eller 3-instar.
OBS: Borsta försiktigt för att undvika att WBPHs flyger från bägaren eller skadar dem.
2. Virusförvärv och insamling av viruliferösa insekter
- Överför icke-viruliferösa insekter från glasbägarna till färska SRBSDV-infekterade risplantor täckta med ett insektssäkert nät för en 2 d virusförvärvsåtkomstperiod (AAP) genom att mata på växter. Samla sedan insekterna i glasbägare som innehåller färska risplantor.
- Efter 2 d, samla insekterna från glasbägare med en manuell aspirator för dissektion och excision av tarmen.
OBS: Minsta AAP för SRBSDV är 5 minuter för både WBPH-nymfer och vuxna, men insekterna bör tillåtas att mata på färska SRBSDV-infekterade risplantor i 2 d för att uppnå förvärvseffektiviteten på upp till 80%.
3. Beredning av reagens
- Lös 8,5 g NaCl, 3,5 g Na2HPO4·12H2O och 0,25 gNaH2PO4i 1ml ddH2Oför att bereda 0,01 M lösning av fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 4 g paraformaldehyd till 100 ml PBS för att framställa 4% (m / v) paraformaldehyd i PBS.
- Tillsätt 2 ml Triton X-100 i 98 ml PBS för att förbereda 2% (v / v) Triton X-100.
4. Dissektion av vuxna och excision av tarmar
- Använd en pipettor för att placera 100 μL PBS på en glasskiva. Placera bilden på scenen i ett optiskt mikroskop.
- Samla SRBSDV-infekterade vuxna från glasbägare med en manuell sugare och placera dem i 1,5 ml rör. Placera rören på is för att förlamna insekter och överför sedan en förlamad vuxen till 100 μL PBS på glidbanan med buken uppåt.
OBS: Insekterna kommer att vara ordentligt förlamade efter 5 min på is. - Använd pincett i ena handen för att klämma fast kroppen och ta sedan bort huvudet med en annan uppsättning pincett i den andra handen.
- Kläm fast sidorna av buken med en uppsättning pincett och kläm fast ovipositoren eller svansens copulatoriska organ med den andra uppsättningen. Dra sedan bort det intersegmentella membranet i ett buksegment försiktigt och exponera långsamt tarmen i buken.
- Fortsätt riva bort membranet och dra gradvis ut hela tarmen från buken. Dra försiktigt av svansen, som är ansluten till änden av tarmen, för att ta bort hela tarmen.
OBS: Dra mycket försiktigt, annars kommer tarmen att skadas. - Placera utskurna tarmar i ett 200 μL centrifugrör, tillsätt 200 μL PBS till röret och sug försiktigt lösningen med en pipett för att tvätta tarmarna noggrant.
5. Dissektion av nymfer och excision av tarmar
OBS: Nymfkroppar är mer ömtåliga än vuxna kroppar, och tarmen skadas lätt när den dras från svansen. Därför är den mest pålitliga metoden att skära ut nymftarmen genom att dra från huvudet.
- Använd en pipettor för att placera 100 μL PBS på en glasskiva. Placera bilden på scenen i ett optiskt mikroskop.
- Samla SRBSDV-infekterade nymfer från glasbägare med en manuell sugare och placera dem i 1,5 ml rör. Placera rören på is för att förlamna insekter. Överför sedan en förlamad nymf till 100 μL buffert på objektglaset med buken uppåt.
- Använd pincett för att lossa nymfens svans. Kläm sedan fast insektskroppen för att fixa försiktigt och använd den andra uppsättningen för att klämma fast huvudet. Dra försiktigt bort huvudet från kroppen medan du fortfarande behåller dess fäste vid tarmen så att huvudet lossnar från kroppen, men tarmen är fortfarande fäst vid bröstkorgen och buken.
OBS: Efter att huvudet har lossnat kommer nymfens corpus adiposum att strömma ut, vilket gör PBS grumlig. Ta bort den grumliga PBS-lösningen och byt med 100 μl färsk PBS. - Med pincetten som fortfarande klämmer fast kroppen, använd den andra uppsättningen för att flytta huvudet försiktigt och dra gradvis ut tarmen.
- Lossa försiktigt tarmen från huvudet med pincett och få så småningom en intakt tarm utan att skada planthopparens kropp.
- Placera utskurna tarmar i ett 200 μL centrifugrör, tillsätt 200 μL PBS till röret och sug försiktigt lösningen med en pipett för att tvätta tarmarna noggrant.
OBS: De utskurna tarmarna ska rengöras väl med PBS för att avlägsna eventuella förorenande fettkroppar från bukhålan; De kan störa färgningsprotokollet.
6. Märkningsprotokoll för SRBSDV-virioner och ett insektsprotein
- Bered antikropparna och monteringsmediet som används i denna analys. Antikroppar är anti-SRBSDV-antikroppar märkta med Dylight 549 (röd) mot SRBSDV-virioner 18, anti-VAMP7-antikropp märkt med Dylight 488 (grön) mot insektsproteinet VAMP716,19, Dylight 633 falloidin (blå) och monteringsmedium innehållande 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, blå).
- Placera de nyligen utskurna och PBS-tvättade WBPH-tarmarna omedelbart i 100 μL 4% (m / v) paraformaldehyd i ett 200 μL centrifugrör och håll i 2 timmar vid rumstemperatur.
OBS: De nyligen utskurna WBPH-tarmarna ska inte blötläggas i PBS under en längre tid, annars kommer epitelcellerna att skadas. - Avlägsna 4 % (m/v) paraformaldehyd med en pipetor och tillsätt sedan 200 μL PBS i centrifugröret på 200 μl. Efter 10 minuter, ta bort PBS med en pipettor för att eliminera eventuell paraformaldehyd.
- Upprepa detta PBS-tvättsteg två gånger.
- Ta bort PBS och tillsätt 200 μL nonjoniskt rengöringsmedel Triton X-100 (2%, v/v). Permeabilisera proverna i det nonjoniska tvättmedlet i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Ta bort 2 % (v/v) Triton X-100 med en pipetor och tvätta sedan bort eventuellt kvarvarande rengöringsmedel med tre 10 minuters tvättar med 200 μL PBS (se steg 6.3 och 6.4).
- Utspädd anti-SRBSDV-antikropp märkt med Dylight 549 (röd) och anti-VAMP7-antikropp märkt med Dylight 488 (grön) 1:50 med 50 μL tjurserumalbumin (3%, m / v).
- Tillsätt de utspädda antikropparna till röret och inkubera proverna över natten vid 4 °C.
- Ta bort antikroppsspädningsvätskan med en pipetor och tvätta sedan bort den återstående antikroppsspädningsvätskan med tre 10 minuters tvättar med 200 μL PBS.
- Späd 1 μL Dylight 633 falloidin med 50 μL PBS.
- Tillsätt 50 μl utspädd falloidin till röret och inkubera proverna i 2 timmar vid rumstemperatur.
- Ta bort phalloidinspädningsmedlet med en pipettor och tvätta sedan bort det återstående falloidinet med tre 10 minuters tvättar med 200 μL PBS.
OBS: Noggranna tvättar är avgörande för att minska bakgrunden och ospecifik bindning. - Placera en droppe monteringsmedium innehållande DAPI på ett mikroskopglas och överför tarmarna till mediet.
OBS: Vik försiktigt ut varje tarm med pincett och undvik att skapa bubblor. Det finns cirka 15 tarmar per bild. - Placera försiktigt ett täckglas över proverna utan att skapa bubblor.
OBS: Glaset bör hållas vid 4 °C i mörker för att förhindra fluorescenssläckning före observation med ett laserskanningskonfokalmikroskop. - Visa alla prover med ett laserskanningskonfokalmikroskop. Ta bilderna med blått ljus och spara filerna på en dator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 illustrerar alla steg i detta protokoll: insektsuppfödning, virusförvärv, excision av tarmen, immunofluorescerande märkning och att göra bilden.
Utskurna WBPH-tarmar från vuxna fixerades i 4% (m/v) paraformaldehyd, permeabiliserades med 2% (v/v) Triton X-100 och inkuberades sedan med Dylight 633 phalloidin10,18. Den laserscannande konfokala mikrografin i figur 2 visar de tre delarna av den utskurna tarmen efter märkning med falloidin, och de är framtarmen, mellantarmen respektive baktarmen. Bland dessa tre delar är midgut det första infektionsstället för SRBSDV. Tarmens monolagerepitelcellstruktur underlättar studien av cellulär lokalisering av insektsproteiner och samlokalisering av virus- och insektsproteiner.
Vi skar också ut WBPH-tarmar och inkuberade dem med Dylight 488 (grön) märkt anti-VAMP7-antikropp och SRBSDV-virioner med Dylight 549 (röd) märkt anti-SRBSDV-antikropp, respektive17,18,19. Figur 3 visar VAMP7 i cytoplasman hos WBPH midgut-epitelceller. VAMP7- och SRBSDV-virioner har visat sig samlokaliseras i cytoplasman med ett laserscanningskonfokalmikroskop, vilket tyder på att VAMP7 kan spela en roll i virusöverföring in vivo.
Figur 1: Översikt över steg i uppfödning av insekter, excising av tarmar och märkning av protein. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Morfologi för WBPH-tarmen. Fluorescens från Dylight 633 phalloidin (blå, märkning aktin) betraktades med ett laserskanningskonfokalmikroskop. Skalstång, 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Fluorescensmärkning av SRBSDV-virioner och VAMP7 i WBPH-epitelceller sedda med ett laserscanningskonfokalmikroskop. Guts inkuberades med anti-SRBSDV-antikropp märkt med Dylight 549 (röd) och anti-VAMP7-antikropp märkt med Dylight 488 (grön). Skalstång, 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För bästa resultat bör några viktiga punkter beaktas. För det första är ett högt förhållande av viruliferösa insekter bland den totala befolkningen nödvändig. Även om den lägsta AAP för SRBSDV av WBPH-nymfer och vuxna är 5 min17, bör insekterna tillåtas att mata på färska SRBSDV-infekterade risplantor i 2 d för att uppnå en förvärvseffektivitet på upp till 80%. Eftersom SRBSDV-virionerna kan detekteras i 80% av midguts18, skar vi ut och märkte de viruliferösa insekterna vid 2 d efter en 2 d AAP i detta protokoll. För det andra är tarmarna hos vuxna och nymfer kopplade till spytkörtlarna i huvudet och till ovipositor eller copulatoriskt organ i svansen. Således kan tarmen skäras försiktigt ut genom att dra från huvudet eller svansen. Teknikern måste dock välja en lämplig metod för att dra baserat på insektens storlek. Den vuxna tarmen kan dras i ett intakt stycke från svansen efter att huvudet har tagits bort, medan tarmen hos den mer ömtåliga nymfen lätt bryts när den dras från svansen20. Mer tillförlitligt kan nymftarmen avlägsnas genom att försiktigt dra huvudet efter att ha lossat tarmen från svansen. Med hjälp av dessa dissektions- / excisionsmetoder kan vi snabbt få intakta tarmar och bevara den ursprungliga ultrastrukturen i tarmepitelcellerna. Dessutom förstörs inte andra organ och det yttre kroppsskalet hos växthoppare, vilket upprätthåller integriteten hos andra vävnader och organ som spottkörtlar och hemolymf för att utforska virusaktiviteter och interaktioner21.
Även om immunofluorescensmärkning används i stor utsträckning kan starka fluorescerande signaler vara svåra att få utan korrekta märkningsprotokoll, vilket resulterar i kostsamt slöseri med experimentella material och tid22,23. Före märkning ska de utskurna tarmarna rengöras väl med PBS för att utesluta förorenande fettkroppar från bukhålan. De förorenande fettkropparna kan hindra antikroppar från att komma in i cellen och göra synfältet oklart när det observeras med laserskanningskonfokalmikroskop. Efter denna rengöring bör tarmarna fixeras omedelbart för att bevara cellstrukturen. Se till att permeabiliseringsbehandlingstiden inte är för lång för att förhindra antigenöverflöde. Dessutom bör permeabiliserade tarmar rengöras noggrant efter inkubation med luciferinkonjugerade antikroppar för att minska bakgrunden och ospecifik bindning. Innan täckglaset pressas, vik försiktigt ut varje tarm med pincett och försök att undvika bubblor. När glaset är färdigt bör det förvaras vid 4 °C utan ljus för att förhindra fluorescenskylning före observation med ett konfokalmikroskop24,25 för laserskanning.
Virusöverföring av insektsvektorn är ett avgörande steg i epidemiologin för många växtvirussjukdomar. Att störa denna överföring är således en effektiv strategi mot virussjukdomar7,8, så att belysa överföringsmekanismen för dessa virus är av stor teoretisk och praktisk betydelse. Immunofluorescens är därför mycket användbart för att lokalisera ihållande överförda växtvirus och studera funktionen av deras proteiner in vivo mot att förstå de olika stegen i virusöverföring. Under de senaste åren har immunofluorescens och laserskanningskonfokalmikroskopi varit kritiska verktyg som är ansvariga för genombrott för att förstå virusinteraktioner i vektorceller och vävnader under överföring av växtvirus. Med hjälp av det nuvarande protokollet kunde vi lokalisera SRBSDV-virioner och VAMP7 i epitelcellerna i midguts hos vuxna och nymfer och bestämma eventuell samlokalisering. Phalloidin användes för att märka aktin för att visa konturen av midgut epitelcellmembranet, och DAPI användes för att märka kärnan. Strukturerna i WBPH-tarmen och midgut-epitelcellerna är distinkta när de ses med laserskanningskonfokalmikroskopi. Detta protokoll är en tillförlitlig metod för att se insekters matsmältningsanatomi, lokalisera virioner, andra patogener och insektsproteiner och studera patogenaktiviteter hos insekter, insektsproteinfunktioner och interaktioner mellan patogener och insektsproteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation of China (31630058 till X.W. och 31772134 till W.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3% Bull serum albumin (BSA) | Coolaber | SL1331 | Dilute antibodies |
| Cover glass | Solarbio | YA0771-18*18mm | For slide making |
| Dissecting microscope | Beitja | XTL-7045B1 | For insect dissection |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | Zeiss LSM880 | Observe fluorescence signal |
| Microscope slides | Solarbio | ZBP-7105 | For slide making |
| Mounting medium with 4'6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Abcam | AB104139 | Label cell necleus |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | For tissues fixation |
| Phalloidin | Invitrogen | A22284 | Label actin of midgut epithiels |
| Triton X-100 | Amresco | 0290C484 | For tissues permeation |
| Tweezers (5-SA) | AsOne | 6-7905-40 | For insect dissection |
References
- Nault, L. R. Arthropod transmission of plant viruses: a new synthesis. Annals of the Entomological Society of America. 90 (5), 521-541 (1997).
- Mitchell, P. L. Heteroptera as vectors of plant pathogens. Neotropical Entomology. 88 (3), 519-545 (2004).
- Gautam, S., et al. Virus-virus interactions in a plant host and in a hemipteran vector: Implications for vector fitness and virus epidemics. Virus Research. 286, 198069 (2020).
- Ghanim, M. A review of the mechanisms and components that determine the transmission efficiency of Tomato yellow leaf curl virus (Geminiviridae; Begomovirus) by its whitefly vector. Virus Research. 186, 47-54 (2014).
- Hogenhout, S. A., et al. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Whitfield, A. E., Falk, B. W., Rotenberg, D. Insect vector-mediated transmission of plant viruses. Virology. 479, 278-289 (2015).
- Wu, N., Zhang, L., Ren, Y., Wang, X. Rice black-streaked dwarf virus: from multiparty interactions among plant-virus-vector to intermittent epidemics. Molecular Plant Pathology. 21, 1007-1019 (2020).
- Zhang, L., Wu, N., Ren, Y., Wang, X. Insights into insect vector transmission and epidemiology of plant-infecting fijiviruses. Frontiers in Microbiology. 12, 628262 (2021).
- Liu, W., Hajano, J. U., Wang, X. New insights on the transmission mechanism of tenuiviruses by their vector insects. Current Opinion in Virology. 33, 13-17 (2018).
- Qin, F., et al. Invasion of midgut epithelial cells by a persistently transmitted virus is mediated by sugar transporter in its insect vector. PLOS Pathogens. 14, 1007201 (2018).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N., Berliner, E. The demonstration of pneumococcal antigen in tissues by the use of fluorescent antibody. Journal of Immunology. 45, 159-170 (1942).
- Barnard, G. The development of fluorescence immunoassays. Progress in Clinical and Biological Research. 285, 15-37 (1988).
- Wang, W., et al. The c-Jun N-terminal kinase pathway of a vector insect is activated by virus capsid protein and promotes viral replication. eLife. 6, 26591 (2017).
- Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-Based proximity labeling for in planta identification of protein-protein interaction networks. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60728 (2020).
- Than, W., Qin, F. L., Liu, W. W., Wang, X. Analysis of Sogatella furcifera proteome that interact with P10 protein of southern rice black-streaked dwarf virus. Scientific Reports. 6, 32445 (2016).
- Pu, L., et al. Transmission characteristics of Southern rice black-streaked dwarf virus by rice planthoppers. Crop Protection. 41, 71-76 (2012).
- Jia, D., Chen, H., Mao, Q., Liu, Q., Wei, T. Restriction of viral dissemination from the midgut determines incompetence of small brown planthopper as a vector of southern rice black-streaked dwarf virus. Virus Research. 167, 404-408 (2012).
- Zhang, X., Zhang, L., Liu, W., Li, L., Wang, X. Preparation and application of the antibodies of Sogatella furcifera VAMP7 and Vti1a proteins in expressed in Escherichia coli. Plant Protection. 47, 55-60 (2021).
- Ammar, E. D. Internal morphology and ultrastructure of leafhoppers and planthoppers. Nault, L. R., Rodriquez, J. G. , Wiley. New York. 1 (1985).
- Tsai, J., Perrier, J. L. Morphology of the digestive and reproductive systems of Dalbulus maidis and Graminella nigrifrons (Homoptera: Cicadellidae). Fla Entomology. 79, 563 (1996).
- Wei, T., Li, Y. Rice reoviruses in insect vectors. Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).
- Kruse, A., et al. Combining'omics and microscopy to visualize interactions between the Asian citrus psyllid vector and the Huanglongbing pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus in the insect gut. PLoS ONE. 12, 0179531 (2017).
- Koga, R., Tsuchida, T., Fukatsu, T. Quenching autofluorescence of insect tissues for in situ detection of endosymbionts. Applied Entomology and Zoology. 44, 281-291 (2009).
- King, R. S., Newmark, P. A. In situ hybridization protocol for enhanced detection of gene expression in the planarian Schmidtea mediterranea. BMC Developmental Biology. 13, 8 (2013).
