Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

Zhaokai Li; Liu Liu; Zhong Wang

doi:10.3791/62643

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Articolo metodologico

Valutazione in vitro della riprogrammazione cardiaca mediante misurazione del flusso di calcio specifico cardiaco con un GCaMP3 Reporter

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DOI:

10.3791/62643

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22 febbraio 2022

Zhaokai Li^*¹^,² , Liu Liu^*¹ , Zhong Wang¹

¹Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, ²Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Descriviamo qui, l'istituzione e l'applicazione di una linea di reporter del mouse Tg (Myh6-cre) 1Jmk / J / Gt (ROSA) ^{26Sortm38 (CAG-GCaMP3) Hze} / J (indicata come αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito) per la valutazione della riprogrammazione cardiaca. I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) isolati dal ceppo murino vengono convertiti in cardiomiociti indotti (iCM), consentendo una valutazione comoda ed efficiente dell'efficienza di riprogrammazione e della maturazione funzionale degli iCM tramite il flusso di calcio (^Ca2+).

Abstract

La riprogrammazione cardiaca è diventata una terapia potenzialmente promettente per riparare un cuore danneggiato. Introducendo più fattori di trascrizione, tra cui Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), i fibroblasti possono essere riprogrammati in cardiomiociti indotti (iCM). Questi iCM, quando generati in situ in un cuore infartuato, si integrano elettricamente e meccanicamente con il miocardio circostante, portando ad una riduzione delle dimensioni della cicatrice e ad un miglioramento della funzione cardiaca. A causa dell'efficienza, della purezza e della qualità relativamente basse della riprogrammazione degli iCM, la caratterizzazione degli iCM rimane una sfida. I metodi attualmente utilizzati in questo campo, tra cui la citometria a flusso, l'immunocitochimica e la qPCR, si concentrano principalmente sull'espressione di geni e proteine cardiaco-specifici, ma non sulla maturazione funzionale degli iCM. Innescata dai potenziali d'azione, l'apertura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti nei cardiomiociti porta ad un rapido afflusso di calcio nella cellula. Pertanto, quantificare il tasso di afflusso di calcio è un metodo promettente per valutare la funzione dei cardiomiociti. Qui, il protocollo introduce un metodo per valutare la funzione iCM in base al flusso di calcio (^Ca2+). Un ceppo di topo αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 è stato stabilito incrociando Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (indicato come Myh6-Cre di seguito) con topi Gt(ROSA)^{26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J (indicato come Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 di seguito). I fibroblasti cardiaci neonatali (NCF) di topi neonatali P0-P2 sono stati isolati e coltivati in vitro e una costruzione policistronica di MGT è stata introdotta negli NCF, che ha portato alla loro riprogrammazione in iCM. Poiché solo gli iCM riprogrammati con successo esprimeranno il reporter GCaMP3, la maturazione funzionale degli iCM può essere valutata visivamente dal flusso Di ^Ca2+ con microscopia a fluorescenza. Rispetto agli NCF non riprogrammati, gli NCF-iCM hanno mostrato un flusso transitorio di calcio significativo e una contrazione spontanea, simili ai CM. Questo protocollo descrive in dettaglio la creazione del ceppo murino, l'isolamento e la selezione dei cuori dei topi neonatali, l'isolamento NCF, la produzione di retrovirus per la riprogrammazione cardiaca, l'induzione iCM, la valutazione del flusso di iCM ^{Ca2 +} utilizzando la nostra linea reporter e la relativa analisi statistica e presentazione dei dati. Si prevede che i metodi qui descritti forniranno una preziosa piattaforma per valutare la maturazione funzionale degli iCM per gli studi di riprogrammazione cardiaca.

Introduzione

L'infarto miocardico (MI) è una malattia grave in tutto il mondo. Le malattie cardiovascolari (CVD) sono la principale causa di morte in tutto il mondo e rappresentano circa 18,6 milioni di decessi nel 20191,2. La mortalità totale delle CVD è diminuita nell'ultimo mezzo secolo. Tuttavia, questa tendenza è stata rallentata o addirittura invertita in alcuni paesi non ^sviluppati1, il che richiede trattamenti più efficaci delle CVD. Come una delle manifestazioni fatali di CVD, MI rappresenta circa la metà di tutti i decessi attribuiti a CVD negli Stati ^Uniti2. Durant....