Différenciation et polarisation des macrophages en un phénotype de type M2 à l’aide d’une lignée cellulaire de leucémie THP-1 semblable à un monocyte humain

Katharina M. Scheurlen; Dylan L. Snook; Sarah A. Gardner; Maurice R. Eichenberger; Susan Galandiuk

doi:10.3791/62652

Method Article

Différenciation et polarisation des macrophages en un phénotype de type M2 à l’aide d’une lignée cellulaire de leucémie THP-1 semblable à un monocyte humain

DOI:

10.3791/62652

⸱

August 2nd, 2021

Katharina M. Scheurlen¹ , Dylan L. Snook¹ , Sarah A. Gardner¹ , Maurice R. Eichenberger¹ , Susan Galandiuk¹

¹Price Institute of Surgical Research, Department of Surgery, University of Louisville

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les macrophages associés aux tumeurs de type M2 (TAM) sont associés à la progression tumorale et à un mauvais pronostic dans le cancer. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier et polariser de manière reproductible les cellules monocytaires THP-1 en macrophages de type M2 dans les 14 jours. Ce modèle est la base pour étudier les effets anti-inflammatoires du TAM dans le microenvironnement tumoral.

Abstract

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Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) peuvent changer leur expression et leur profil de cytokines en fonction de stimuli externes. Cette plasticité remarquable permet à TAM de s’adapter aux changements en cours dans le microenvironnement tumoral. Les macrophages peuvent avoir des attributs principalement pro-inflammatoires (de type M1) ou anti-inflammatoires (de type M2) et peuvent basculer continuellement entre ces deux états principaux. Les macrophages de type M2 dans l’environnement tumoral sont associés à la progression du cancer et à un mauvais pronostic dans plusieurs types de cancer. De nombreuses méthodes différentes pour induire la différenciation et la polarisation des cellules THP-1 sont utilisées pour étudier les mécanismes cellulaires et intercellulaires et les effets du TAM dans le microenvironnement des tumeurs. À l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle établi pour la polarisation des macrophages de type M2 utilisant la lignée cellulaire THP-1, et les résultats de l’expression et des profils de cytokines des macrophages dus à certains stimuli in vitro varient d’une étude à l’autre. Ce protocole sert de guide détaillé pour différencier les cellules de type monocyte THP-1 en macrophages M0 et pour polariser davantage les cellules en un phénotype de type M2 dans les 14 jours. Nous démontrons les changements morphologiques des cellules de type monocytaire THP-1, des macrophages différenciés et des macrophages polarisés de type M2 à l’aide de la microscopie optique. Ce modèle est à la base de modèles de lignées cellulaires étudiant les effets anti-inflammatoires du TAM et leurs interactions avec d’autres populations cellulaires du microenvironnement tumoral.

Introduction

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Les macrophages associés aux tumeurs (TAM) et leur rôle dans l’inflammation chronique, l’apparition du cancer et le développement de tumeurs sont des cibles importantes dans les recherches récentes¹^,². Les monocytes du sang périphérique qui sont recrutés dans le microenvironnement tissulaire de la tumeur en développement se différencient en macrophages et peuvent être polarisés en deux sous-types principaux de macrophages³. Le macrophage activé classiquement représente le phénotype de type M1 principalement pro-inflammatoire et le sous-type de type M2 activé alternativement présente pri....

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Protocol

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Remarque : Une vue d’ensemble des étapes décrites dans ce protocole est illustrée à la figure 1. La lignée cellulaire de leucémie monocytaire humaine THP-1 a été achetée. Une courte analyse de répétition en tandem a été effectuée pour authentifier la lignée cellulaire THP-1. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles. La lignée cellulaire monocytaire THP-1 se développe en suspension et ne se fixe pas aux surfaces de culture cellulaire. L’adhérence peut être induite en différenciant les monocytes en cellules de type macrophage par, par exemple, un stress mécanique ou un traitement spécifique avecPMA.

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Results

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Des macrophages de type M2 ont été caractérisés et la polarisation M2 a été validée à l’aide de la cytométrie en flux pour les marqueurs de type Cluster of Differentiation (CD) CD14, CD11b, CD80 (marqueur de type M1) et CD206 (marqueur de type M2). La coloration par cytométrie en flux a été effectuée conformément aux instructions du fabricant. Les macrophages ont été lavés avec du PBS/FBS à 5 % et incubés avec le bloc récepteur Fcγ pour éviter toute liaison non spécifique. Les cellules ont ensuite été colorées avec des a.......

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Discussion

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Ce protocole sur la différenciation et la polarisation des cellules monocytaires THP-1 dans les 14 jours fournit une méthode pour obtenir des macrophages avec un phénotype distinct de type M2 en raison d’une longue incubation de cellules avec des périodes de repos adéquates entre les étapes.

Certaines étapes sont essentielles à ce protocole. Le temps de doublement des monocytes THP-1 est d’environ 26 h. Les cellules peuvent être divisées à une densité cellulaire de 9 x 10⁵/mL et doi.......

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Disclosures

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts potentiel.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le Price Institute of Surgical Research de l’Université de Louisville est soutenu financièrement par le John W. Price and Barbara Thruston Atwood Price Trust. Les sources de financement n’ont joué aucun rôle dans la conception et la réalisation de l’étude ainsi que dans la collecte, la gestion, l’analyse et l’interprétation des données.

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Bleu trypan 0,4 %	VWR, Radnor, États-Unis	152-5061
Tube de microcentrifugation de 1,5 mL	USA Scientific, Ocala, États-Unis	1615-5510
Pipette sérologique de 10 mL	VWR, Radnor,	États-Unis. 89130-898
1000 &mu ; L TipOne pointes de pipette	USA Scientific, Ocala, États-Unis	1111-2821
15 mL ; Tube à centrifuger	VWR, Radnor, USA	89039-664
20 &mu ; L TipOne pointes de pipette	USA Scientific, Ocala, USA	1120-1810
200 &mu ; L TipPointes de pipette	One USA Scientific, Ocala, USA	1120-8810
Pipette sérologique 25 mL	VWR, Radnor, USA	; 89130-900
Pipette sérologique de 5 mL	VWR, Radnor, États-Unis	. 89130-896
50 mL Tube à centrifuger	VWR, Radnor, États-Unis	89039-662
Solution d’accutase 500 mL	Sigma, St. Louis, États-Unis	A6964
Solution antimycosique antibiotique (100x), stabilisée	Sigma, St. Louis, États-Unis	A5955-100 mL	avec 10 000 unités de pénicilline, 10 mg de streptomycine et 25 &mu ; g d’amphotéricine B par mL, stérile-filtré, BioReagent, adapté à la culture cellulaire
Liant Incubateur CO2	VWR, Radnor, USA	C170-ULE3
CytoOne T-75cm flacon avec bouchon filtrant	USA Scientific, Ocala, USA	CC7682-4875
Dulbecco' s Phosphate salin tamponné (PBS)	Sigma, St. Louis, USA	D8537-500 mL	PBS sans chlorure de calcium et chlorure de magnésium doit être utilisé, car les deux peuvent modifier la polarisation des macrophages
Eppendorf Centrifuge 5804 R (réfrigéré)		Eppendorf, Enfield, USA-Alcool
éthylique (70 %)	-	-
FACSCalibur cytomètre en flux	BD Biosciences, San Diego, USA-		Le cytomètre en flux fonctionne avec le logiciel CellQuest (BD Biosciences)
Falcon 24-well plate	VWR, Radnor, USA	353504
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC, Manassas, USA	30-2020
FITC Mouse Anti-Human CD14	BD Biosciences, San Diego, USA	555397	Cytométrie en flux, marqueur de cellules myéloïdes (100 tests)
FITC Mouse Anti-Human CD80	BD Pharmingen, San Diego, USA	557226	Cytométrie en flux, marqueur M1 (100 tests)
FITC Souris IgG1 &kappa ; Contrôle des isotypes	BD Pharmingen, San Diego, États-Unis	555748	Cytométrie en flux, contrôle des isotypes pour CD80 (100 tests)
FITC Souris IgG2a, &kappa ; Contrôle des isotypes	BD Biosciences, San Diego, États-Unis	553456	Cytométrie en flux, contrôle des isotypes pour CD14 (100 tests)
Bloc BD Fc humain	BD Biosciences, San Diego, États-Unis	564220	Cytométrie en flux, bloc Fc (0,25 mg)
Interleukine humaine 13 (IL-13)	R& D, Minneapolis, États-Unis	IL-771-10 &mu ; g
Interleukine humaine 4 (IL-4)	R& D, Minneapolis, États-Unis	SRP3093-20 &mu ; g
Armoire de biosécurité Labconco (Delta Series 36212/36213)	Labconco, Kansas City,	États-Unis-Solution
L-glutamine, 200 mM	ATCC, Manassas,	États-Unis 30-2214
Lipopolysaccharide (LPS) d’E. coli 0111 :B4	Sigma, St. Louis,	États-Unis L2630-100 mg
Mini Cell Scrapers	Biotium, Fremont, États-Unis	22003
Neubauer hémocytomètre	Fisher Scientific, Waltham, États-Unis	02-671-5
Microscope inversé Nikon Eclipse TS100	Nikon, Melville, États-Unis-Eau
sans nucléase	Invitrogen, Carlsbad, États-Unis	AM9937
Microscope optique Olympus RH-2	Microscope Central, Feasterville, États-Unis	40888
Pipette variable P10 - Gilson	VWR, Radnor, États-Unis	76180-014
Pipette variable P1000-Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-990
Pipette variable P200- Gilson	VWR, Radnor, USA	76177-988
PE Souris Anti-Humaine CD11b	BD Biosciences, San Diego, USA	555388	Cytométrie en flux, marqueur de cellules myéloïdes (100 tests)
PE Souris IgG1, &kappa ; Contrôle des isotypes	BD Biosciences, San Diego, États-Unis	555749	Cytométrie en flux, contrôle des isotypes pour CD11b (100 tests)
PE-Cy 5 Souris anti-humaine CD206	BD Pharmingen, San Diego, États-Unis	551136	Cytométrie en flux, marqueur M2 (100 tests)
PE-Cy 5 Souris IgG1 &kappa ; Isotype Control	BD Pharmingen, San Diego, USA	555750	Cytométrie en flux, contrôle des isotypes pour CD206 (100 tests)
Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)	Sigma, St. Louis, USA	P8139
Pipette Powerpette Plus	VWR, Radnor, USA	75856-448
Precision Water-bed (modèle 183)	Precision Scientific, Chicago, USA	66551
RPMI-1640 Moyenne	ATCC, Manassas, États-Unis	30-2001
Lignée cellulaire THP-1, American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC, Manassas,	États-Unis TIB-202

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zhang, R., et al. Cancer-associated fibroblasts enhance tumor-associated macrophages enrichment and suppress NK cells function in colorectal cancer. Cell Death and Disease. 10 (4), 273(2019).
Wang, J., Li, D., Cang, H., Guo, B.

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