Summary
כאן אנו מציגים את מבחנת שחרור המתווך, באמצעות קו תאי לוקמיה בוסופילי חולדה transfected עם קולטן IgE האנושי, כדי לדמות degranulation של תאים אפקטים שנצפו בדרך כלל בתגובות אלרגיות מסוג 1. שיטה זו חוקרת את הפעילות הביולוגית של אלרגנים באופן רגיש מאוד, ניתן לשחזור וניתן להתאמה אישית.
Abstract
מגשר שחרור assays לנתח במבחנה אימונוגלובולין E (IgE)-בתיווך והפרשת מתווכים על ידי תאים אפקט, כגון תאי פין ובזופילים, על גירוי עם דילול סדרתי של אלרגנים putative. לכן, בדיקות אלה מייצגות כלי חיוני המחקה את תהליך degranulation in vivo, אשר מתרחשת על חשיפה לאלרגנים בחולים רגישים או בבדיקות דקירה בעור. בנוסף, הבדיקות האלה משמשות בדרך כלל כדי לחקור את הפוטנציאל האלרגני של חלבונים ואת התגובה של התגובה של המטופלים. להלן, אנו מתארים פרוטוקול פשוט של יומיים באמצעות קו תאי לוקמיה בוזופילי מונצח שהודבק ואנושי עם קולטן קרום הפלזמה של IgE בעל הזיקה הגבוהה האנושית (FcεRI). גרסה זו של בדיקת שחרור המתווך היא מערכת חזקה, רגישה ו ניתנת לשחזור במערכת מבוססת תאי הפריה ללא צורך לשתק את האנטיגן למטרישות מוצקות. הפרוטוקול מורכב מהצעדים הבאים: (1) השלמת ההונאה של סרה אנושית, (2) קצירה, זריעה וחוש פסיבי של התאים, (3) גירוי עם אנטיגן כדי לגרום לשחרור מתווך, ו -(4) מדידה של פעילות β-hexosaminidase כפונדקאית עבור מתווכים דלקתיים ששוחררו, כגון היסטמין. הבדיקה מייצגת כלי שימושי להערכת היכולת של אלרגן-IgE cross-linking כדי לעורר degranulation התא והוא יכול להיות מיושם כדי לתקנן תמציות אלרגן, להשוות את התגובה של חולים אלרגנים קלים או גדולים ותמציות אלרגניות (אבקה, קשקשי חתול, וכו '), כדי לחקור את העוצמה של הומולוגים אלרגנים, isoforms, ווריאנטים מתקפלים (למשל, היפואלרגניות), כמו גם את ההשפעות של ליגנדים על הפעילות האלרגנית. יישום עדכני יותר כולל את השימוש בבדיקה כדי לפקח על יעילות הטיפול במהלך אימונותרפיה של אלרגנים.
Introduction
תגובות רגישות יתר מסוג I, המאופיינת בייצור אימונוגלובולין E (IgE) ספציפי לאנטיגן בהתאמה, משפיעות על כמעט שליש מאוכלוסיית העולם. תגובות אלה קשורות למספר ביטויים אלרגיים כגון אסטמה ודלקת קרנפים ויכולות אפילו להוביל לתגובות סכנת חיים מערכתית1. שלא כמו בבדיקות vivo, גישות אימונוכימיות, כגון בדיקת חיסונים הקשורה לאנזים (ELISA), מתאימות אך ורק לחקירת כריכת היעד של נוגדנים אך אינן מתייחסות להיבט התפקודי של חלבונים שיכולים לגרום לתגובות רגישות יתר מיידיות. חוסר ההשתתפות של האלרגנים על תמיכות מוצקות (למשל, צלחות ELISA) יכול לגרום לשינויים בשלמות המבנית שלהם ולהרס של אלרגיה רלוונטי epitopes2. אפילו בדיקות דקירת עור (SPT), הכלי הנפוץ ביותר לאישור רגישות נגד אלרגנים מסוימים, יש את הגבולות שלהם לגבי גילוי של אלרגיה למזון סימפטומטי בתיווך IgE או זמינות אלרגנים3,4. על מנת למצוא שיטה אתית, ספציפית מאוד, רגישה וחסכונית לבדיקת העוצמה הביולוגית של אלרגנים כדי לגרום לסוג שאני מגיבה לרגישות יתר, מה שנקרא בדיקות שחרור מתווך הוקמו.
העיקרון של בחינה זו מסתמך על אירועים בעקבות שלב הרגישות ואת היכולת הנלווית של IgE להיקשר לשרשרת α של קולטני הזיקה הגבוהה לידי ביטוי על פני השטח של תאים אפקטים, כגון תאי פין ובזופילים. IgE מיוצר בעיקר על ידי תאי פלזמה ברקמת הלימפה הקשורה לוע. למרות שזה אימונוגלובולין הכי פחות שופע (סביב 0.05% אצל אנשים שאינם אטופיים) בדם, יש לו פעילות ביולוגית גבוהה במיוחד להיות הגורם העיקרי לתסמינים אלרגיים. מחצית החיים של IgE יכול להגדיל מ 2-3 ימים למספר שבועות ואפילו חודשים כאשר מאוגדים הקולטנים שלה על תאים משפיעים. קשירה מאוחרת יותר של אנטיגן לאזור המשתנה של שתי מולקולות IgE הקשורות לקולטן מובילה לחיבור הצולב שלהן ואחריו אינדוקציה של מפל איתות במורד הזרם בתא האפקטיבי המוביל לפירוק ושחרור של מספר מתווכים פרו דלקתיים הגורמים להנדסת כלי וים, כגון היסטמין, פרוטאז סרין (למשל, טריפטאז) ופרוסטגלנדינים5,6,7. הפרשת ציטוקינים כגון אינטרלוקין 4 (IL-4) ו- IL-13 אחראים לתחזוקת תגובת T helper 2 (Th2) הדלקתית ולהחלפת תאי B לתאי פלזמה המייצרים IgE5,8,9. מצד שני, תרומבוקאן ששוחרר גורם לסימפונות, וליקוטרינים מעוררים התכווצות שרירים חלקה כמו גם דליפת כלי דם, וממלאים תפקיד מכריע בדלקת בדרכי הנשימה המובילה לאסתמה או נזלת אלרגית10,11.
הוקמו כלי מחקר לניתוח רוב המתווכים הנ"ל, אם כי עם כמה חסרונות משמעותיים. בדיקות טריפטאז הן גישות קליניות מתאימות למדידה של אנפילקסיס מערכתי באמצעות הפעלת תאי תורן, אך הרגישות והסיחודיות שלהם באבחנות אלרגיה אינן מדויקות מדי בהשוואה לשיטות תקן זהב כגון SPT. מצד שני, ציסטיניל לויקוטרין assays אינם מסוגלים לאבחן אלרגיות β לקטמים או תרופות נוגדות דלקת לא סטרואידליות12. פרוטוקולים למדידה של היסטמין כמתווך מרכזי שפורסם בתגובות אלרגיות כבר הוקמו בשנות השישים. לאחר ששוחרר בדם ההיקפי, היסטמין מושפל מיד על ידי היסטמין מתיל-טרנספראזס וכתוצאה מכך מחצית חיים פלזמה של רק כמה דקות, מה שהופך את הניתוח שלה מאתגר למדי13. מלבד חוסר היציבות שלה, ניטור של היסטמין הוכח יש ספציפיות נמוכה ורגישות לאלרגיות סמים, כמו גם חלבוני מזון מסחריים וארסי צפרה12.
מודלים במבחנה עם קווי תאים אפקט הוצגו כחלופה לנהלים עתירי עבודה של בידוד וטיפוח של בזופילים מחולים אלרגיים לבצע בדיקות שחרור. לכן, לוקמיה בסופילית חולדה- (RBL-) מבוסס אסאי באמצעות קו התא RBL-2H3 הוקם3. מאז קו תא זה אינו מסוגל מחייב IgE אנושי, זה היה הראשון transfected עם α, β, ושרשרת γ של קולטן פלזמה-קרום IgE האנושי (FcεRI). מספר שיבוטים נוצרו ונבדקו עבור רמות ביטוי והומוגניות של שרשרת α האנושית, אשר המשובט RBL-30/25 התגלה כמועמד המבטיח ביותר לבדיקת מבחנה. מפל האיתות שנגרם עם הפעלת הקולטן של השיבוט שהודבק נבדק באמצעות בדיקות גיוס סידן. כאינדיקטור לפירוק ולמחליף לשחרור היסטמין, נמדד האנזים ליסוסומולי β-הקסוסאמינידאז, שיש לו יתרון משמעותי של יציבות גבוהה יותר14. שחרור המגשר באמצעות תאי RBL-30/25 מגיע עד 100% ולכן, משמש לבדיקת סרה נגזר מחולים אלרגיים. בדיקת ה- Assay נבדקה לשחרור המתווך לאחר קריאת תיגר על תאים רגישים עם תמציות אלרגנים מסחריות. זה הוביל לממצא כי יש שונות עצומה בהרכב (של עד פי 60 לגבי תכולת החלבון הכוללת) של תמציות אלרגן נגזר יצרנים שונים ומשמשים לאבחון (למשל, SPT) או גישות טיפוליות3,15,16.
בזאת, אנו מספקים תיאור מפורט של פרוטוקול RBL כדי לבצע את בדיקת שחרור המגשר באמצעות סרום מתורמים אלרגיים. במהלך רגישות פסיבית, IgE בסרום נלכד על ידי קולטן FcεR1 זיקה גבוהה לידי ביטוי על פני השטח של התאים הבזופיליים. על אנטיגן גירוי, IgEs מאוגד ספציפי עבור אנטיגן הם מקושרים צולבים, מפעילים degranulation התא ואת שחרורו של המתווך β-hexosaminidase. הפעילות של β-hexosaminidase נמדדת לאחר מכן באמצעות מצע מתאים. עבור ההסתערות, נעשה שימוש בתאי huRBL-2H3, וכונו huRBL בפרוטוקול הבא. הפרוטוקול מתאר סדרת דילול אנטיגן סטנדרטית עם 8 שלבים מדוללים 1:10 החל 1 מיקרוגרם / מ"ל כדי 0.1 pg / mL של אלרגן.
Protocol
אישור אתי לשימוש ב-sera שמקורו בחולים אלרגיים לאבקת ליבנה התקבל מוועדת האתיקה ההולנדית (מספר אישור: NL65758.018.18).
1. נהלי בטיחות
- עבודה בתנאים סטריליים באמצעות שולחן עבודה מסוג בטיחות ביולוגית 2 במהלך היום הראשון של הניסוי (Biosafety Level 2). בצע את הנחיות הבטיחות של המוסד לשימוש בסרום אנושי.
2. להשלים את ההסתה של סרה אנושית
- לקצור תרבית צפופה של תאי P3X63Ag8.653 (המכונה תאי Ag8 מעתה ואילך), מבקבוק תרבית התא ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגה.
- השתמש במדיום התרבות הבא עבור תאים אלה: המדיום החיוני המינימלי של הנשרים מותאמים עם ריכוז סרום מופחת, 1% פניצילין-סטרפטומיצין (100 יחידות Pen., 0.1 מ"ג / מ"ל סטרפטוקובל.), 5% עגל עוברי מומת בחום / סרום בקר (FCSi).
- תאי צנטריפוגה Ag8 למשך 5 דקות ב 250 x גרם בטמפרטורת החדר.
- להשעות מחדש את כדור התא לריכוז סופי של כ 1 x 106 תאים / מ"ל ב- huRBL בינוני (נשר בינוני חיוני מינימלי עם שינוי אלפא, 4 mM L-גלוטמין, 5% FCSi, 1% G418 (100% מלאי: 10 גרם / 125 mL dH2O).
הערה: לשמור על תאי Ag8 על ידי עובר לשימוש עתידי גם כן. - לדלל סרה אנושית 1: 10 בהשעיית תא Ag8. דילול הנסיוב הסופי בבדיקה יהיה 1: 20.
הערה: עבור סרה עם IgE ספציפי נמוך ניתן להשתמש 1:5 (1:10 דילול סופי) ניתן להשתמש. - דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C (5%-7% CO2.
3. קצירה וזריעה של תאי huRBL
- שאפו את המדיום מבקבוק תרבית תאי T-75 בזהירות מבלי לגעת בתאי ה- huRBL (תאי huRBL הם דבקים). ודא כי התאים הם סביב 50%-90% מפגש.
הערה: בהתאם למפגש התא, תוכן התא של בקבוקון תרבית תא T-75 צפוף מספיק בדרך כלל עבור צלחות אחת עד שתיים של 96 באר. - לשטוף את התאים פעמיים על ידי הוספת 10 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS). הוסף DPBS לצד הנגדי של הבקבוקון ולא ישירות לתאים.
- שאף DPBS והוסף 5 מ"ל של טריפסין-EDTA 1x מחומם מראש (0.05%/0.02% EDTA מדולל ב- DPBS) עבור ניתוק תאים.
- לדגור על הבקבוק במשך 5 דקות ב 37 °C (5 °F).
- נתק את התאים על-ידי הקשה זהירה על הבקבוקון.
- העבר את ההשעיה התא לתוך צינור centrifugation 15 מ"ל ולמלא עם huRBL בינוני או DPBS כדי לדלל את טריפסין-EDTA.
- צנטריפוגות התאים ב 250 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו את supernatant ו resuspend הכדור ב 5 מ"ל של מדיום huRBL לספירת תאים.
- לספור את התאים לדלל אותם במדיום huRBL כדי להשיג ריכוז סופי של 2 x 106 תאים / מ"ל.
- השתמש צלחת סטרילית 96-well ולהוסיף 50 μL של השעיית תא huRBL לבאר, אשר שווה ערך 1 x 105 תאים / טוב.
4. רגישות פסיבית של תאי huRBL
- צנטריפוגה השעיית Ag8/סרום דגירה מראש למשך 5 דקות ב 250 x גרם.
- העבר 50 μL של השעיית Ag8/סרום צנטריפוגות לכל באר המכילה תאי huRBL מבלי להפריע לכדור התא Ag8.
- כלול את בקרת אנטיגן, אשר רגישים, אבל תאים unstimulated (לא להוסיף אנטיגן), משמש אינדיקציה לרמת האות התחתונה / רקע. רקע ובארות בקרת תמיס מקסימלית לא צריך להיות רגיש עם סרום. הוסף 50 μL של אמצעי huRBL כדי לשלוט בארות במקום.
- מכסים את הצלחת עם המכסה ודגרה לילה ב 37 °C (5%-7% CO2.
5. שחרור פירוק ומתווך מגורה אנטיגן
- הכן את דילול האנטיגן במאגר טיירוד 1x (9.5 גרם / L מלחי טיירודה, 0.1% אלבומין סרום בקר (BSA), 0.5 גרם / L נתרן מימן קרבונט (NaHCO3) ב- dH2O) מראש. יש צורך בכמות סופית של 100 μL לבאר.
הערה: לא כל אלרגן, מטוהר ממקורות טבעיים או מיוצר רקומביננטי, עשוי להיות יציב במאגר של טיירוד 1x. לכן, לבצע בדיקות יציבות במאגר של טיירוד 1x לפני הליך הבדיקה. לחלופין, לדלל את המאגר של טיירוד 1x תחמוצת דיטריום (D2O) כדי להגדיל את יחס האות לרעש של הבדיקה. - הפוך 8 דילול של אנטיגן של עניין של 1:10 סדרת דילול בצינורות תגובה החל 10 או 1 מיקרוגרם / מ"ל של חלבון.
הערה: בדוק תמיד את סדרת הדילול מראש. לחלופין, התאימו את סדרת הדילול של 1:10 (למשל, 1:5, 1:20 או 1:30) כדי לכסות את עקומת השחרור המלאה. בנוסף, הריכוז ההתחלתי יכול להשתנות בהתאם להתקנה הניסיונית. - כדי לשטוף תאי huRBL מצופים על צלחת 96-well, להסיר את המדיום תא המכיל סרה תחילה על ידי שאיפה קפדנית, היפוך והקשה על הצלחת על נייר סופג.
- לשטוף תאים עם 200 μL של 1x המאגר של טיירודים לבאר. התייחסו לכל בארות באופן דומה.
הערה: מוסיפים את תמיסת הכביסה לאט לתאים כדי לא להפריע להם. - השאירו אותו כ-30 וחזור על שלב הכביסה שלוש פעמים בסך הכל.
- לאחר הוספת פתרון הכביסה בפעם האחרונה, להשאיר את הפתרון בבארות עד מוכן להמשיך עם הוספת דילול אנטיגן.
הערה: הימנע מחשיפת תאים לאוויר במשך זמן רב מדי. - העבר 100 μL של פתרון אנטיגן לכל באר המכילה את תאי huRBL רגישים מראש.
הערה: אם מנתחים מספר פרמטרים שונים, מעבירים את הדגימות הבודדות של סדרת הדילול לצלחת נוספת שאינה מחייבת 96-באר (השתמש באותה פריסה כמו על צלחת ה- huRBL) והעבירו אותן לאחר מכן עם פיפטה רב-ערוצית ישירות על צלחת התא huRBL. בדרך זו, חשיפת התאים לאוויר במשך זמן רב מדי ניתן להימנע, אשר עלול לגרום ביצועים מבוחן גרוע (נמוך / לא אות). - בארות בקרת כיסוי (תמיסת מרבית ותאי רקע שאינם רגישים) עם 100 μL של המאגר של טיירוד 1x. אין לעורר בארות שליטה אלה עם האנטיגן.
- בנוסף, להוסיף 100 μL של המאגר של 1x טיירוד לבארות ללא אנטיגן הרגיש של סדרת דילול, אשר יש צורך לקחת שחרור ספונטני אנטיגן עצמאי של תאים רגישים בחשבון במהלך ניתוח נתונים.
- דגירה תאי huRBL עבור 1 שעות ב 37 °C ו 5%-7% CO2.
6. מדידת פלואורסצנטיות של פעילות β-הקסוסמידאז
- לטפל בארות של בקרת תמיסת המרבית עם 10 μL של 10% Triton X-100 לבאר לערבב כראוי על מנת lyse התאים לחלוטין ולקבל את שחרור 100% של β-hexosaminidase.
- הוסף 50 μL של פתרון מצע לתוך לוח חדש לא מחייב 96-באר. פתרון מצע עבור צלחת אחת 96-well: 5 מ"ל של 0.1 M חוצץ בדיקת לציטרי, pH 4.5; ו-80 מיקרו-לן של 10 מ"מ 4-מתילומליפריל N-אצטיל-β-D-גלוקוזאמיניד.
- העבר 50 μL של תא supernatant של כל בארות ללוח החדש המכיל את פתרון המצע.
הערה: Pipette supernatant בזהירות את צלחת huRBL על מנת לא לשבש את תאי huRBL. - לדגור את הצלחת עם פתרון מצע תא supernatant עבור 1 שעה ב 37 °C (50 °F) כדי לאפשר המרה של המצע פלואורוגני.
הערה: שמור את צלחת huRBL לבדיקת כדאיות התא. - הוסף 100 μL של פתרון עצירה (15 גרם / L גליצין, 11.7 גרם / L NaCl מומס ב dH2O, pH 10.7) לבאר.
- מדוד את הפלואורסצנטיות ב 360 ננומטר עירור ופליטה 465 ננומטר באמצעות קורא לוחות.
7. ניתוח נתונים
- לחישובים בסיסיים של שחרור אחוזים, השתמש בכל תוכנת גיליון אלקטרוני.
- עבור חיסור הרקע/הסרה בסיסית, הפחת את הממוצע של בארות הרקע מכל בארות אחרות.
- חשב את הממוצע של בארות תמיסת מרביות ונתונים מפורשים של סידרת הדילול באחוזים. בדרך זו ניתן לבטא נתונים כאחוז שחרור התא מנורמל לשחרור האנזים המרבי שנגרם על ידי תמהה של התא.
- עקומות שחרור מתווך מלאות של תגובת מינון מיוצגות בצורה הטובה ביותר כגרפים XY עם ריכוז האנטיגן ביומן ציר ה- X ואחוז שחרור המתווך בציר ה- Y.
- הוסף את הערכים של הפקד ללא אנטיגן כשורה מקווקות כדי לציין את הרקע או את הרמה התחתונה.
הערה: ניתן להשוות מספר סרה שטופלו באופן דומה באמצעות אסטרטגיית נורמליזציה זו. לשם השוואה ישירה, מומלץ גם לחשב את השחרור המקסימלי למחצה, שהוא ריכוז האנטיגן (ב- ng/mL) הדרוש לשחרור חצי מקסימלי המוגדר כממוצע הערכים המקסימליים והמינימליים לכל עקומה. ריכוז האנטיגן כדי לעורר שחרור מקסימלי למחצה מחושב על ידי אינטרפולציה של ערך השחרור המקסימלי למחצה לקו רגרסיה לוגריתמית.
Representative Results
מגשר שחרור אסי, המבוסס על תאי huRBL (איור 1A ו- B), התוצאה היא עקומת תגובת מינון בצורת פעמון ( איור1C). עבור ייצוג נתונים פשוט יותר, ניתן לחשב את ריכוז האנטיגן הדרוש לשחרור המתווך המקסימלי למחצה באמצעות רגרסיה ליניארית (איור 1D). בדיקת כדאיות לתא מבוצעת כדי לא לכלול אפקטים ציטוטוקסיים שמקורם בסרום החושני או מהאנטיגן המשמש לגירוי (איור 1E). הבדיקה יכולה לשמש כדי לבדוק את התגובה של סרה שונה אנטיגן מסוים. במקרה שלנו, 4 מתוך 5 סרה, נגזר חולים אלרגיים אבקה ליבנה, הגיב לגירוי בית v 1. סרום #1 הראה את שחרור המתווך הגבוה ביותר(איור 2). סרום #5 לא הגיב לגירוי Bet v 1, ולכן, עשוי להגיב אלרגנים אבקה ליבנה אחרים (למשל, בית v 2, פרופילין). נתונים אלה מצביעים על כך ש-Bet v 1 הוא אלרגן רב עוצמה האחראי לתסמינים אלרגיים בתיווך IgE. באמצעות ה-huRBL assay, ניתן להעריך את התגובה הצולבת של IgE לאלרגנים הומולוגיים(איור 3). כאן, שני חולים אלרגיים אבקה ליבנה הגיבו היטב לבית v 1, ואילו רק חולה #2 הגיב גם Cor a 1, בית v 1-הומולוגים מזון אלרגן נמצא אגוזי לוז. בהתבסס על נתונים אלה, חולה #2 סביר להניח שיש יותר Cor 1-cross-תגובתי IgE רמות מאשר חולה #1, וכתוצאה מכך תסמיני אלרגיה דרך הפה על צריכת אגוזי לוז. אפילו את הערכת האופי ההיפואלרגני של גרסאות מוטנטיות של אלרגנים (ירידה בעוצמה) ניתן לנתח ולהשוות למקבילם הפראי (איור 4). בדוגמה שסופקה, עקומת השחרור של וריאנט הקיפול עברה לריכוז אנטיגן גבוה יותר בהשוואה לאלרגן מסוג בר, וכתוצאה מכך ריכוז גבוה משמעותית של אנטיגן הדרוש כדי לעורר שחרור חצי מקסימלי (איור 4B). נתונים אלה מרמזים כי וריאנט מוטציה / קיפול שנוצר הוא פחות אלרגני בהשוואה לחלבון מסוג בר. עוצמה מופחתת זו כדי להפעיל degranulation בתיווך IgE מדגיש את האופי ההיפואלרגני של וריאנט הקיפול. בהתבסס על מבחנת זו, גרסת הקיפול היא מועמדת מעניינת לאימונותרפיה ספציפית לאלרגנים מכיוון שהיא עלולה לגרום לתופעות לוואי מופחתות הקשורות ל- IgE במהלך הטיפול.
איור 1: תאי RBL אנושיים ועקומה מייצגת בצורת פעמון של שחרור β-הקסומינידאז המושרה על-ידי IgE-allergen. תאי RBL דבקים בבקבוקי התרבות, המעניקים להם צורה דמוית מוט כשהם מנסים לצרף את עצמם (A). רמה אידיאלית של מפגש עבור תאים להיות קציר הוא לא יותר מ 90% (B). תאים מוצגים תחת הגדלה של 40x ו- 10x, בהתאמה. תאים שהיו רגישים עם סרום אנושי של אדם אלרגי אבקה ליבנה מגיבים על אתגר עם רקומביננט Bet v 1 (rBet v 1), אלרגן אבקה ליבנה ליבנה העיקרי (C). כפונדקאית לשחרור מתווך, פעילות β-הקסוסאמינידאז נמדדת בסופרנטים של תאים. העקומה בצורת פעמון נובעת מעיסוק מונווולנטי של אפיטופים אנטיגן ב- IgE בשל עודף של אלרגן, אשר מעכב באופן תחרותי את אלרגן-IgE cross-linking בריכוזים אנטיגן גבוהים. הסבר נוסף לשחרור הנמוך בריכוזים גבוהים של אלרגנים הוא עיכוב של מסלולים תאיים בנוכחות אנטיגן עודף. לקביעת ריכוז האלרגנים הדרוש לקבלת שחרור חצי מקסימלי, נעשה שימוש בקו רגרסיה לוגריתמית המבוסס על הערכים הניסיוניים המייצגים את החלק הליניארי של השיפוע של עקומת שחרור המתווך (D). הקו המקווקו האדום מייצג את קו הרגרסיה הלוגריתמית המשמש לחישוב. הנוסחה של קו הרגרסיה מוצגת באדום. המהדורה המקסימלית למחצה מוגדרת כ: שחרור חצי מקסימלי = (ערך שחרור מינימלי + ערך שחרור מרבי)/2. בדוגמה, המהדורה המקסימלית של החצי המחושב הייתה 20.6%. הנסיוב האנושי הייצוגי ששימש בניסוי זה היה מדולל 1:20 עבור דגירה עם תאי huRBL, וריכוז האנטיגן המשמש לגירוי נע בין 100 מיקרוגרם / מ"ל ל 0.004 pg / mL של Bet v 1. בדיקת כדאיות תאים, במקרה זה בדיקת MTT, בוצעה עם התאים הנותרים לאחר גירוי אנטיגן כדי להעריך את ההשפעה של סרום רגיש, כמו גם של דילול אנטיגן על הכדאיות התא וספירת התאים (E). תאי רקע לא מטופלים ותאי תמה (תמוז מרבי) מוצגים כקו מנוקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: עקומות מייצגות של שחרור אחוז β-הקסוסמידאז של חמש סרה אנושיות שונות. אותו טווח ריכוז אנטיגן של rBet v 1 היה דגירה עם תאי huRBL שהיו רגישים עם סרה של אנשים שונים ליבנה אבקה רגישה. יש הבדל ברור של שחרור אחוזים בין החולים השונים המתאימים לחומרת הסימפטומים שלהם. שים לב כי חולה #5 אינו מגיב לאלרגן אבקה ליבנה העיקרית Bet v 1. כל חמשת הסרה האנושית ששימשה להשגת עקומות שחרור המתווך האלה דווללו באותה מידה 1: 20 לדגירה עם תאי huRBL. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תגובתיות צולבת של IgE נגזרת מחולים רגישים אבקה ליבנה עם בית v 1 הומולוגי לאלרגן אגוזי לוז Cor a 1. שני סרה מייצגת של חולים רגישים אבקה ליבנה מגיבים בחום Bet v 1, כמו גם במידה פחותה אלרגן הומולוגי Cor a 1. חולה 2 מראה תגובה משמעותית Cor a 1, ולכן סביר להניח יציג תסמיני אלרגיה דרך הפה על צריכת אגוזי לוז, לעומת חולה 1 שבו שחרור המגשר הוא כמעט זניח. הקו המקווקו מייצג את בקרת ללא אנטיגן, שהם תאים רגישים עם סרה אנושית אך לא מגורה עם אלרגן, ולכן, משמש אינדיקציה לרמת האות התחתונה / רקע. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: השוואה של אחוז שחרור בין rBet v 1 סוג פראי לבין גרסה קיפול היפואלרגנית. אותו סרום של אדם רגיש אבקה ליבנה היה דגירה עם rBet v 1 סוג בר (wt) וגרסה קיפול היפואלרגנית של אלרגן אבקה ליבנה גדולה (A). למרות שחרור מתווך נראה בשני אנטיגנים, יש שינוי ברור לקראת ריכוזי אנטיגן גבוהים יותר בעת השוואת הגרסה הקיפול לסוג פראי rBet v 1 עבור אותו אחוז שחרור. דרך סטנדרטית להשוות את ההבדל בשחרור אחוזים של אנטיגנים שונים היא חישוב הריכוז של אנטיגן הדרוש כדי להשיג שחרור חצי מקסימלי (B). זה מבוצע בדרך כלל בשכפולים ביולוגיים (בדיקה של אותו טווח אנטיגן עבור כל אלרגן בסרה אנושית שונה). בדרך כלל, על מנת להסיק מסקנות משמעותיות, שחרור המגשר מתבצע עם סרה מ 8 עד 10 חולים שונים לפחות. כאן התוצאות של ארבע סרה שונות מתוותות כדוגמה. מבחן tמזווג שימש לניתוח סטטיסטי. *עמ' ≤ 0.05; **p ≤ 0.01; עמ' ≤ 0.001; p ≤ 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| שאלות פוטנציאליות ופתרון בעיות | תמיסה |
| שונות של בדיקת תיס עקב היענות תא שונה | ודא שמספר מחזור המעבר של התא אינו עולה על 20 עד 30 מעברים. הפוך מלאי קפוא במעברים מוקדמים לניסויים עתידיים. |
| במקום להסתמך על שכפולים ביולוגיים (שימוש בסרה שונה) מאשר טכניים. | |
| סרה מכיל רמות נמוכות של IgE ספציפי | ניתן להשתמש בדילול סרום סופי נמוך יותר (כלומר 1:10) במקום 1:20. לעומת זאת, סרה המכילה רמות גבוהות של IgE ספציפי ניתן מדולל עוד יותר (1:30 או 1:40). |
| אין מספיק תאים כדי לבצע את ההסתה | ודא שהמפגש בבקבוק T-75 הוא בסביבות 50-90%. מעבר עוד צלוחיות. |
| השפעות ציטוטוקסיות של סרה, כלומר עקב אי-הפעלה משלימה לא שלמה | בצע בדיקות כדאיות תא בנוסף לתחיצת המגשר. הגדל את ריכוז Ag8 כדי למנוע אי-שלם-אי-הפעלה. |
| אות נמוך | שפר את יחס האות לרעש של הבדיקה על ידי דילול המאגר של טיירוד 1x תחמוצת דיטריום (D2O) במקום dH2O, או באמצעות סרה עם רמות גבוהות יותר של IgE ספציפי לאלרגן של עניין. |
| אלרגן אינו יציב במאגר של טיירוד (למשל משקעים) | בצע בדיקות יציבות במאגר של טיירוד 1x לפני הליך הבדיקה. החלפת המאגר של טיירוד אינה מומלצת. |
| בעיות במציאת הריכוז ההתחלתי הנכון עבור האלרגן בהתאמה | הסתגלות לסדרת דילול כדי לכסות את עקומת השחרור המלאה (יותר שלבי דילול, דילול 1:20 במקום 1:10). |
| ביצועי ביצועים גרועים של ביצועים מסומנים על ידי אות נמוך/ללא אות | הימנע השפעות ציטוטוקסיות מגירוי סרה או אנטיגן (למשל אלרגנים אנזימטיים). לשטוף ולהשרות את התאים בזהירות. יש להימנע מחשיפה לאוויר זמן רב מדי ולמנוע מהתאים להתייבש. |
| כיצד אוכל לדעת אם רמת האות התחתונה הגיעה? | הוסף פקדי "אין אנטיגן" לצלחת שלך. אלה הם תא רגיש, אשר היו מגורה רק עם חיץ טיירוד 1x אבל ללא אלרגן. |
| האם אני צריך שליטה חיובית בנוסף לבארות תמיס מקסימליות? | כמו שליטה חיובית נוספת סרום ושילוב אנטיגן ידוע לגרום degranulation ניתן להשתמש או נוגדן אנטי FcεR1. |
| כמה בארות אני צריך? | זה תלוי בסדרת האטיטריון שלך, במספר האנטיגנים והסרה שאתה רוצה לנתח. תכנן את הפריסה עבור לוחות 96-באר על פי כמה סרה / אנטיגנים אתה הולך לבדוק. אל תשכח להוסיף את "אין פקדי אנטיגן", את תאי הרקע (לא רגישים, לא מגורה) כמו גם את בארות תמוגה מקסימלית. |
| כמה סרה אני צריך לבדוק? ואני צריך שכפולים? | למרות שההתחמרות די חזקה, יש שונות מסוימת של בדיקה-לא-בדיקה עקב היענות תא שונה. לכן, מומלץ להסתמך למדי על שכפולים ביולוגיים (באמצעות סרה שונה) מאשר על שכפולים טכניים. מינימום של שמונה סרה שונים מספיק כדי לנתח אלרגנים. עם זאת, כפי שמוצג ב איור 4B, תוצאות משמעותיות כבר ניתן להשיג באמצעות פחות סרה. |
טבלה 1: פתרון בעיות.
Discussion
ההפצה של המתווך מבוסס התא huRBL המתוארת להלן היא שיטה חזקה שניתן לבצע וליישם בקלות בכל מעבדה. הדרישה היחידה היא כי תאים צריכים להיות מעובדים בתנאים סטריליים. ה- assay משמש להערכת הסבירות של אלרגן או מקור אלרגני לעורר IgE-crosslinking של חולים degranulation בזופיל17. ניתן להתאים את בדיקת ההסתה בקלות לכל מקור אלרגן או אלרגני כל עוד הסרום של המטופל עם רמה גבוהה של IgE ספציפי, הכרה באלרגן של עניין, זמין. מומלץ לבצע בדיקות קיימא תא בנוסף לבדיקת שחרור המגשר על מנת להסביר את כל ההשפעות הציטוטוקסיות הפוטנציאליות שעלולות לגרום לביצועי בדיקות גרועים. ייתכן שהסיבה לכך היא אי-פעולה משלימה חלקית של הסרה או השפעות ציטוטוקסיות אחרות שמקורן בסרום. אפילו האנטיגן עצמו, למשל, בגלל פעילות פרוטאוליטית/אנזימטית, יכול לפגוע בתאי ה-huRBL. אנחנו בדרך כלל משתמשים בבדיקת כדאיות תאים עם MTT (3-(4,5-דימתילתיאזול-2-yl)-2,5-דיפנילטטרזוליום ברומיד) כדי להעריך השפעות ציטוטוקסיות פוטנציאליות. ניתן לבצע את ה- assay בקלות עם תאי ה- huRBL שנותרו לאחר איסוף והעברת סופרנט התא (ראה שלב 6.3 של הפרוטוקול). בהשוואה לשיטות אימונוכימיות אחרות, כגון ELISAs ו- western blotting, לקביעת הפוטנציאל האלרגני של אלרגנים בודדים או תמציות מורכבות המבוססות על כריכת אלרגן-IgE, בדיקה זו יכולה לזהות לא רק את הכריכה של IgE לאלרגן, אלא גם יכולה למדוד את הפונקציונליות של שניהם, IgE אנושי ואלרגן, כדי לעורר degranulation בזופיל בתיווך IgE18. לכן, זה יכול לסייע בחקר חומרת הסימפטומים האלרגיים ex vivo באמצעות סרה של חולים. הבדיקה מדווחת להיות עקבי ויעיל יותר מאשר בדיקות אנפילקסיס עורי פסיבי קלאסי מאז הבדיקה משתמשת בתאי RBL-2H3, אשר קל יחסית לטפל ולייצר פחות שונות בתוצאות לעומת תאים ראשוניים, כגון תאי פין או בזופילים אנושיים19,20. בנוסף לכך, הבחינה מספקת ייצוג טוב של הפעילות הביולוגית של אלרגנים ויכולה להעריך במדויק את סך תכולת האלרגנים במדגם מורכב נתון3. לפתרון בעיות בשלבים מסוימים בפרוטוקול, עיין בטבלה 1.
לגבי הישימות של גרסה זו של מגשר שחרור assay, זה שימש בעיקר למטרות מחקר, אלא גם עבור סטנדרטיזציה של תמציות אלרגניות המבוססות על הפעילות הביולוגית שלהם. זה כולל ניתוח של קבוצות שונות של פתרונות SPT, פתרון בדיקת פרובוקציה, כמו גם תמציות המשמשות אימונותרפיה ספציפית לאלרגנים; כפי שמוצג עבור אבקה, קשקשי חתול, קרדית אבק הבית, ותמציות בוטנים, כמו גם ארס דבורים3,17,21. הטכניקה יכולה להיות מיושמת במיוחד באבחון אלרגיות למזון, כפי שהוא יכול לזהות אפילו כמויות מינימליות של מרכיבים אלרגניים במוצרי מזון מורכבים כגון בוטנים, חלב, חיטה, וביצים22. בהקשר זה, הוא גם דווח ככלי בעל ערך להערכת אלרגניות של אלרגנים מזון מן החי, כגון tropomyosins, והוא יכול לסייע בהבחנה בין אלרגנים חזקים ללא אלרגנים23. ככלי מחקר, הבחינה משמשת כדי לחקור את ההשפעה של עיבוד מזון, כמו גם כדי להעריך את ההשפעה של מחייב ליגנד לאלרגנים והשפעתה על אלרגניות24,25. לדוגמה, הכריכה של Bet v 1 לליגנדים הוצגה כמי שלא משפיעה על קישור אלרגן-IgE, אם כי היא גרמה לעלייה ביציבות התרמית והפרוטולטית שלה25. ניתן להשתמש בבחינת ההסתייגות כדי להשוות את התגובה של המטופל לאלרגנים מינוריים וגדולים, כמו גם לחקור את התגובה הצולבת של הומולוגים ואיזופורמים של אלרגנים, כפי שמוצג בדוגמה שלנו באמצעות Bet v 1 ואלרגן המזון ההומולוגי Cor a 1 (איור 3). לגבי איזופורמים אלרגנים, מגשר שחרור assay שימש כדי לזהות את האלרגן העיקרי Amb 1.01 כמו isoform IgE-תגובתי החזק ביותר אבקה אצות(אמברוזיה artemisiifolia). לשם השוואה, שני איזופורמים האחרים שזוהו בתמציות אבקה אצות, אמב 1.02 ואמב 1.03, הראו תגובתיות מופחתת ל- IgE26של חולים .
בשנים האחרונות, הבחינה הוחלה לחקור תרכובות אנטי אלרגיות פוטנציאליות ווריאנטים היפואלרגניים חדשניים של אלרגנים, בסיוע בזיהוי מועמדים מתאימים לאימונותרפיה ספציפית לאלרגנים27,28. גישה חדשנית נוספת היא להשתמש בבדיקה כדי לפקח על יעילות הטיפול במהלך אימונותרפיה ספציפית לאלרגנים. בהקשר זה, קבוצת המחקר שלנו פיתחה מערכת עיכוב בדיקת huRBL, אשר בקורלציה היטב עם הפחתת ציון הסימפטומים של המטופל במהלך אימונותרפיה ספציפית לאלרגנים29. הבחינה הוצעה גם כדי ללמוד את ההשפעות החיסוניות של TGFβ1 על degranulation בתיווך IgE המושרה על ידי אלרגנים30.
המגבלות של בדיקת הם כי למרות תאי huRBL יש כמה תכונות של תאי פין או בזופילים, הם לא לגמרי לחקות את הפונקציה הטבעית של תאים אפקט אלה. לדוגמה, תאי פיסט מבטאים באופן נרחב את קולטן זיהוי התבנית קולטן אגרה 4 (TLR4), הנחוץ לזיהוי פתוגן, ואילו הוא חסר לחלוטין בתאי RBL-2H331. בשל הבדל זה בפונקציונליות, ההסתה אינה מחקה באופן מלא את המצב בחיים האמיתיים, אשר צריך לזכור בעת פרשנות הנתונים. בנוסף, מאז תאי huRBL הם תאים בזופיליים סרטניים, שינויים בתנאי תרבית פולחן ממושך יכול להוביל הבדלים פנוטיפיים המובילים לתוצאות משתנות בין מעבדות שונות20. היבט נוסף הוא הבחירה בריכוז אלרגנים שיש לקחת בחשבון בעת התאמת שיטה זו שכן ריכוזי אלרגנים גבוהים עלולים לגרום degranulation מיושר שאינו IgE בשל נוכחות של כמויות גבוהות של פרוטאזים או אנדוטוקסינים18. מגבלות אחרות הן התלות בסרה אנושית עם רמות IgE ספציפיות גבוהות יחסית (RAST class 5-6), והצורך במערכות תרבית תאים, שנותר מכשול שיש להתגבר עליו על מנת ליישם את הטכניקה בשגרה הקלינית היומיומית.
מלבד מגבלות אלה, ה- huRBL assay מייצג כלי מחקרי רב ערך לאבחון וטיפול במחלות אלרגיות וניתן להשתמש בו במגוון רחב של יישומים.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לפרופ' ד"ר סטפן ויטס מהמחלקה לאלרגולוגיה מולקולרית, מכון פול-ארליך-סיסטט, לנגן, גרמניה, על אספקת תאי RBL אנושיים/FcεRI ועל שנתן את הסכמתו לכתוב מאמר מתודולוגיה מחקרי זה. אנו רוצים להודות לפרופ' ד"ר פטימה פריירה על שסיפקה משוב מצוין. בנוסף, ברצוננו להודות לפרופ' ד"ר רונלד ואן רי ולד"ר יאפ אכרדאס מהמחלקה לאימונולוגיה ניסיונית, המרכזים הרפואיים של אוניברסיטת אמסטרדם, מיקום AMC, אמסטרדם, הולנד, על שנתנו את הסכמתם לפרסם נתונים מייצגים המופיעים במאמר שיטות זה, אשר נוצרו במהלך הפרויקט BM4SIT - חידושים לאלרגיה (www.BM4SIT.eu). עבודת המחברים נתמכה על ידי קרן המדע האוסטרית (פרויקט P32189), על ידי אוניברסיטת זלצבורג עדיפות תוכנית מחקר אלרגיה-סרטן-BioNano, על ידי תוכנית הדוקטורט חסינות בסרטן ואלרגיה-ICA במימון קרן המדע האוסטרית (FWF W01213), ועל ידי פרויקט BM4SIT (מענק מספר 601763) מתוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי FP7.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-Methylumbelliferyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | M2133 | |
| 96-well plate for huRBL cells (Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-treated, flat-bottom microplate) | ThermoFisher Scientific | 167008 | |
| 96-well plate for substrate solution and cell supernatant (Greiner Bio-One non-treated 96-well microplates) | Fisher Scientific | 655101 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | 10735078001 | |
| Citric acid | Applichem | 131018 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS without calcium and magnesium) | Sigma | D8537 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| Glycine | Applichem | A3707 | |
| Heat-inactivated fetal calf/bovine serum (FCSi) | Sigma | F0804 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Sigma | G7513 | |
| Minimum Essential Medium Eagle with Alpha Modification, with ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | M8042 | |
| Opti-MEM reduced serum medium, GlutaMAX supplement | Gibco/ThermoFisher Scientific | 51985034 | |
| Penicillin-Streptomycin (10K units Pen. 10 mg/mL Strep.) | Sigma | P4333 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Applichem | A2942 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Applichem | 131638 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Trypsin-EDTA | Sigma | 59418C | |
| Tyrode’s salt | Sigma | T2145 |
References
- Curin, M., et al. Next-generation of allergen-specific immunotherapies: molecular approaches. Current Allergy and Asthma Reports. 18 (7), 39 (2018).
- Okamoto-Uchida, Y., et al. Different results of IgE binding- and crosslinking-Based allergy tests caused by allergen immobilization. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 39 (10), 1662-1666 (2016).
- Vogel, L., Lüttkopf, D., Hatahet, L., Haustein, D., Vieths, S. Development of a functional in vitro assay as a novel tool for the standardization of allergen extracts in the human system. Allergy. 60 (8), 1021-1028 (2005).
- Ocmant, A., et al. Basophil activation tests for the diagnosis of food allergy in children. Clinical and Experimental Allergy. 39 (8), 1234-1245 (2009).
- Platts-Mills, T. A. The role of immunoglobulin E in allergy and asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (8), Pt 2 1-5 (2001).
- Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693-704 (2012).
- Lawrence, M. G., et al. Half-life of IgE in serum and skin: Consequences for anti-IgE therapy in patients with allergic disease. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (2), 422-428 (2017).
- Draber, P., Halova, I., Polakovicova, I., Kawakami, T. Signal transduction and chemotaxis in mast cells. European Journal of Pharmacology. 778, 11-23 (2016).
- Peebles, R. S. Prostaglandins in asthma and allergic diseases. Pharmacology & Therapeutics. 193, 1-19 (2019).
- Cyphert, J. M., et al. Allergic inflammation induces a persistent mechanistic switch in thromboxane-mediated airway constriction in the mouse. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 302 (1), 140-151 (2012).
- Méndez-Enríquez, E., Hallgren, J. Mast cells and their progenitors in allergic asthma. Frontiers Immunology. 10, 821 (2019).
- Demoly, P., Lebel, B., Arnoux, B.
- Yamaga, S., et al. Decreased intracellular histamine concentration and basophil activation in anaphylaxis. Allergology International. 69 (1), 78-83 (2020).
- Huang, L., et al. A rapid and sensitive assay based on particle analysis for cell degranulation detection in basophils and mast cells. Pharmacological Research. 111, 374-383 (2016).
- González-Pérez, R., Poza-Guedes, P., Barrios Del Pino, Y., Matheu, V., Sánchez-Machín, I. Evaluation of major mite allergens from European standardized commercial extracts for in vivo diagnosis: addressing the need for precision medicine. Clinical and Translational Allergy. 9, 14 (2019).
- Focke, M., Marth, K., Valenta, R. Molecular composition and biological activity of commercial birch pollen allergen extracts. European Journal of Clinical Investigation. 39 (5), 429-436 (2009).
- Hoffmann, A., Vieths, S., Haustein, D. Biologic allergen assay for in vivo test allergens with an in vitro model of the murine type I reaction. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 99 (2), 227-232 (1997).
- Sun, N., Zhou, C., Zhou, X., Sun, L., Che, H. Use of a rat basophil leukemia (RBL) cell-based immunological assay for allergen identification, clinical diagnosis of allergy, and identification of anti-allergy agents for use in immunotherapy. Journal of Immunotoxicology. 12 (2), 199-205 (2015).
- Kaul, S., Hoffmann, A. Mediator release assay of rat basophil leukemia cells as alternative for passive cutaneous anaphylaxis testing (PCA) in laboratory animals. Altex. 18 (1), 55-58 (2001).
- Passante, E., Frankish, N. The RBL-2H3 cell line: its provenance and suitability as a model for the mast cell. Inflammation Research. 58 (11), 737-745 (2009).
- Kaul, S., et al. Mediator release assays based on human or murine immunoglobulin E in allergen standardization. Clinical and Experimental Allergy. 37 (1), 141-150 (2007).
- Huang, J., et al. Application of in vitro and in vivo models in the study of food allergy. Food Science and Human Wellness. 7 (4), 235-243 (2018).
- Klueber, J., et al. Homologous tropomyosins from vertebrate and invertebrate: Recombinant calibrator proteins in functional biological assays for tropomyosin allergenicity assessment of novel animal foods. Clinical and Experimental Allergy. 50 (1), 105-116 (2020).
- Zhang, T., et al. Different thermal processing effects on peanut allergenicity. Journal of the Science of Food and Agriculture. 99 (5), 2321-2328 (2019).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Wolf, M., et al. Amb a 1 isoforms: Unequal siblings with distinct immunological features. Allergy. 72 (12), 1874-1882 (2017).
- Eichhorn, S., et al. Rational design, structure-activity relationship, and immunogenicity of hypoallergenic Pru p 3 variants. Molecular Nutrition & Food Research. 63 (18), 1900336 (2019).
- Abd Rani, N. Z., et al. Mechanistic studies of the antiallergic activity of phyllanthus amarus Schum. and Thonn. and its compounds. Molecules. 26 (3), (2021).
- Huber, S., et al. Does clinical outcome of birch pollen immunotherapy relate to induction of blocking antibodies preventing IgE from allergen binding? A pilot study monitoring responses during first year of AIT. Clinical and Translational Allergy. 8 (1), 39 (2018).
- Araujo, G. R., et al. TGFβ1 mimetic peptide modulates immune response to grass pollen allergens in mice. Allergy. 75 (4), 882-891 (2020).
- Passante, E., Frankish, N. Deficiencies in elements involved in TLR4-receptor signalling in RBL-2H3 cells. Inflammation Research. 59, Suppl 2 185-186 (2010).
