Summary
פרוטוקול זה מציג את הבנייה והשימוש של מנגנון פלתיסמוגרפיה פשוטה לכל הגוף כדי לעקוב אחר התקדמות מחלות נשימה חיידקיות באופן לא פולשני.
Abstract
מודלים של מחלות של בעלי חיים פונדקאיים כפופים ל-3Rs של מחקר אחראי. ישנה בחינה מחודשת תכופה של עידונים למודלים של בעלי חיים כדי להבטיח שגם רווחת בעלי החיים וגם תובנות מדעיות יתקדמו עם הזמינות של טכנולוגיות חדשות. מאמר זה מדגים את השימוש בפלתיסמוגרפיה פשוטה של כל הגוף (sWBP) כדי לחקור באופן לא פולשני כשל נשימתי במודל של מליואידוזיס נשימתי קטלני. ל-sWBP יש את הרגישות לזהות נשימה בעכברים לאורך כל מהלך המחלה, מה שמאפשר למדוד את הסימפטומים הקשורים למורבינד (ברדיפנאה והיפופניה) ולהשתמש בהם באופן פוטנציאלי לפיתוח קריטריונים הומניים לנקודות קצה.
חלק מהיתרונות של sWBP בהקשר של מחלות נשימה הם שניטור נשימה מארח מגיע הכי קרוב מכל מדידה פיזיולוגית בהערכת תפקוד לקוי של הרקמה הנגועה העיקרית, כלומר הריאה. בנוסף למשמעות הביולוגית, השימוש ב-sWBP הוא מהיר ולא פולשני, וממזער את הלחץ בחיות מחקר. עבודה זו מדגימה את השימוש במנגנון sWBP פנימי לניטור מחלות לאורך כל מהלך הכישלון הנשימתי במודל המורין של מליואידוזיס נשימתי.
Introduction
פתוגנים חיידקיים נשימתיים קשורים לעיתים קרובות לתגובה דלקתית בריאה המובילה לפתולוגיה של הריאה 1,2. במסגרת הקלינית, אבחון של דלקת ריאות כולל בדרך כלל טכניקות תרבית של כיח, ניתוח ריווי חמצן בדם וצילום חזה. ניתן לתרגם טכניקות אלה למודלים של זיהום בבעלי חיים קטנים, אך רק ניתוח ריווי חמצן מייצג ניתוח מהיר בזמן אמת בעכברים לחומרת המחלה. ריווי החמצן בדם (SpO2) נחקר בעבר כשיטה למעקב אחר התקדמות המחלה במחקרי מחלות נשימה; עם זאת, לעכברי מוריבונד יש קריאות SpO2 גבוהות באופן בלתי צפוי הן במודל Pseudomonas aeruginosa 3, שאינן המחלה המנבאת או המוריבונדית, ככל הנראה משום שעכברים יכולים לווסת את הפעילות הפיזיולוגית שלהם. לשם כך, עד כה לא נמצאו רמות אבחון של SpO2 למחלות נשימתיות חיידקיות בעכברים.
לכן, עבודה זו חקרה את השימוש בשיטות רלוונטיות קליניות אחרות לאיתור ההשפעות של מחלות ריאה על תפקוד הריאות כמדידה פיזיולוגית מהירה. פלתיסמוגרפיה פשוטה של כל הגוף (sWBP) מציעה את ההזדמנות לחקור את קצב ועומק הנשימה כניתוח ביומטרי מהיר ולא פולשני. מחקרים קודמים הדגימו כיצד להרכיב מנגנון WBP במעבדה4; עם זאת, כמה מהרכיבים המוצגים במחקרים כאלה אינם זמינים כעת באופן מסחרי. יתר על כן, WBP מסורתי דורש איסוף נתונים מורכב ועיבוד נתונים בהתבסס על לחות וטמפרטורה 5,6. לפיכך, הוחלט לפתח מנגנון WBP פשוט המכויל מדי יום לטמפרטורת החדר/לחות ולהעריך אם לתרומת הטמפרטורה/לחות של הנושא עצמו יש השפעה כלשהי על נפח הנשימה הנמדד. לפיכך, מנגנון sWBP שונה נוצר אשר מקורות החומרים הזמינים כיום. יתר על כן, נבדק אם מנגנון זה שמקורו במעבדה יכול לזהות שינויים בנשימה הקשורים להתקדמות המחלה במהלך המודל של מליואידוזיס נשימתי קטלני בעכברים.
מנגנון ה-sWBP שנבנה עבור עבודה זו השתמש בציוד ובתוכנה הזמינים מסחרית כדי לעבד נתוני חיישן לחץ אנלוגיים לקריאה דיגיטלית. חיישן הלחץ הותקן בצנצנת זכוכית אטומה עם מחברים בתפזורת. היתרון של צנצנת זכוכית הוא הקשיחות המבנית של החומר, אשר יתנגד לשינויים בלחץ הפנימי של הצנצנת, המשפיעים על מדידות של שינויים בנפח במהלך ניטור הנשימה. תא הדגימה תוכנן כך שיהיו לו שתי יציאות על שני המשטחים השטוחים של הצנצנת המרובעת, האחת כדי לגשת לתא על ידי מחבר Luer לכיול והשנייה כדי לאכלס את חיישן הלחץ. חיישן הלחץ שנבחר הוא בעל מתמר לחץ רגיש ביותר עם טווח לשינויים קטנים בלחץ (טווח של 25 mbar).
פרוטוקול זה מודגם באמצעות מודל מורין של מליואידוזיס נשימתי. Burkholderia pseudomallei (Bp) הוא סוכן חיידקי של melioidosis - מחלה הקשורה לאזורים טרופיים של העולם7. Bp נמצא בסביבה, במיוחד בסביבות רטובות של מים עומדים ואדמה לחה, שממנה הוא בדרך כלל גורם לזיהומים תת עוריים של חתכים / שריטות של פונדקאים רגישים. עם זאת, Bp הוא גם מדבק כאשר שואפים והוא איום פוטנציאלי לשימוש בטרור ביולוגי על ידי פיזור אירוסול. בעוד ש-Bp ארסית לחלוטין דורשת טיפול במעבדת BSL-3, זן מוטנטי אקפסולרי תוכנן בעבר, שניתן לטפל בו בבטחה ב-BSL-2 ולא לכלול אותו בקריטריוני הסוכן הנבחרים8. יתר על כן, פותח מודל זיהום תוך-רחמי בתיווך אינטובציה (IMIT) של מליואידוזיס נשימתי כדי לחקור את התקדמות המחלה הנשימתית של Bp 5,9. השתמשנו במודל זיהום זה כדי לאפיין את השינוי בנשימה המתרחש במהלך התקדמות המחלה דרך נקודת הקצה של המורבונד.
Protocol
ההליכים המתוארים כאן נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של אוניברסיטת לואיוויל (פרוטוקול # 14-038) והוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (פרוטוקול # 19567).
1. הרכבת תא הדגימה
- צור שני חורים באמצעות מקדח יהלום בגודל 3/4 אינץ' על מכבש מקדחה על המשטחים השטוחים של צנצנת שימורים רחבת פה מייסון עם פה מרובע בגודל 600 מ"ל עם אטם 95 מ"מ ומכסים אטומים, עם ערבות ומכסי מהדק הדק (איור 1).
הערה: תא דגימה אינו זמין מסחרית ויש לבנות אותו. - הרכיבו ראש תפזורת מפליז (חוט פנימי NPT בגודל 1/4 אינץ', חוט חיצוני 3/4-16 UNF) דרך שני החורים בצנצנת מייסון באמצעות מכונות כביסה מגומי (קוטר פנימי של 3/4 אינץ', קוטר חיצוני של 1 אינץ') על שני פני המגע בין ראש הצובר לזכוכית כדי להבטיח אטימה אטומה.
- השתמש במכלול אחד של ראש תפזורת עבור חיישן לחץ בעת חיבור ראש הצובר השני על ידי מזרק המחובר ל- Luer למטרות כיול.
- עבור חיישן הלחץ, עטוף את חוטי ה- NPT בגודל 1/4 אינץ' של מתמר לחץ בעל ביצועים גבוהים עם סרט טפלון והשחיל אותם לראש הצובר. השתמש במגהץ הלחמה כדי לחבר את חיווט חיישן הלחץ למחבר DIN זכרי בעל 8 פינים, תוך שימוש בהוראות החיווט של היצרן לממשק עם התקן איסוף נתונים באיכות גבוהה הזמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
הערה: הדבר דורש שימוש בנגד סרט מתכת של 150 K אוהם 1/8 וואט 1% בתוך חיווט מחבר DIN. - עבור יציאת הכיול, השתמש במתאם NPT זכר בגודל 1/4 אינץ' למתאם NPT נקבה בגודל 1/8 אינץ' כדי לחבר NPT זכרי בגודל 1/8 אינץ' למחבר נקבה מצופה ניקל של Luer לראשי פליז העוטפים חיבורים מושחלים עם סרט טפלון. השתמש במכסה Luer זכר עם הברגה מפוליפרופילן כדי לאטום את מחבר Luer כאשר אינו בשימוש.
הערה: אין להדק יתר על המידה את מחברי ראש הצובר על צנצנת הזכוכית, מכיוון שהדבר יפתח סדקים. אם רוצים, ניתן להוסיף סיליקון לאטמי הגומי כדי להבטיח אטימה אטומה של ראשי התפזורת לצנצנת הזכוכית.
- עבור חיישן הלחץ, עטוף את חוטי ה- NPT בגודל 1/4 אינץ' של מתמר לחץ בעל ביצועים גבוהים עם סרט טפלון והשחיל אותם לראש הצובר. השתמש במגהץ הלחמה כדי לחבר את חיווט חיישן הלחץ למחבר DIN זכרי בעל 8 פינים, תוך שימוש בהוראות החיווט של היצרן לממשק עם התקן איסוף נתונים באיכות גבוהה הזמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).
2. הגדרת המערכת
- חבר את תא הדגימה למגבר גשר באמצעות מחבר DIN בן 8 פינים ואת מגבר הגשר להתקן איסוף הנתונים, בהתאם להוראות היצרן.
- חבר את התקן איסוף הנתונים לספק כוח ולמחשב שבו פועלת תוכנת ניתוח נתונים פיזיולוגיים באמצעות כבלי היצרן.
הערה: ודא שהתקן איסוף הנתונים מופעל ומחומם למשך 5 דקות לפחות לפני השימוש כדי להבטיח שהחיישן מייצב את המדידות שלו. - הפעל את התוכנה כדי להתממשק עם מערכת איסוף הנתונים.
- הורד את מודול הספירומטריה האופציונלי בתוך התוכנה, ושנה את הגדרות היחידה המוגדרות כברירת מחדל מ- L/s ל- μL/s בחלון הגדרות > ספירומטריה .
3. כיול מערכת
- בתוך התוכנה, צור חלון 4-ערוצים עם חלונות הנתונים הבאים: ערוץ 1: נתוני מקור בקצב דגימה של 4 k/s וטווח mV אחד ; ערוץ 2: מסנן דיגיטלי של ערוץ 1 באמצעות מעבר גבוה 1 הרץ אוטומטי להתאים מסנן; ערוץ 3: החלקת נתוני ערוץ 2 בממוצע של 100 דגימות; ערוץ 4: זרימת ספירומטריה של נתוני ערוץ 3 (ראש זרימה מותאם אישית, מכויל לנוסחה (μL/s) = 120,000 x מתח).
הערה: 120,000 הוא מקדם מתאם מציין מיקום שישונה במהלך הכיול. - הגדר ניתוח DataPad של ערוץ 4 עם העמודות הבאות: עמודה 1: נתוני ערוץ 4, הערות > טקסט תגובה מלא; טור 2: נתוני ערוץ 4, מדידות מחזוריות > תדר מחזורי ממוצע; טור 3: נתוני ערוץ 4, מדידות מחזוריות > גובה מחזורי ממוצע.
- הגדר את קצב המסגרות ל- 100:1 בפינה השמאלית התחתונה של תצוגת התרשים. שמור תצורת חלון זו כתבנית לכל המחקרים העתידיים.
- סגור את מכסה תא הדגימה וחבר מזרק אטום לגז 25 μL למחבר Luer bulkhead. התאם את המזרק למתאם Chaney המיועד לספק שוב ושוב נפח של 20 μL.
הערה: ניתן להשתמש בחתיכה קצרה אופציונלית של צינורות בגודל 1/16 אינץ' ומחברי Luer/barb כדי לחבר את המזרק לתא הדגימה. עם זאת, יש להימנע מצינורות ארוכים כדי למנוע שינויים משמעותיים בנפח האוויר הכולל של תא הדגימה. - שאבו 20 μL של אוויר לתוך המזרק באמצעות עצירת העומק של מתאם צ'ייני.
- אפס את pleth בתוכנה (הגדרת > אפס כל כניסות (Alt-Z)) ולהתחיל הקלטה.
- בזמן ההקלטה, ועם נקודת התחלה יציבה, מדכאים/מושכים במהירות את בוכנה של המזרק למשך כ-10 חזרות כדי לשכפל את נשימת הנושא עם נשימה מדודה של 20 μL. עצור את ההקלטה.
הערה: התדר של הנשימות המלאכותיות צריך לעלות על 2 הרץ כדי למקסם את יכולת השחזור של הכיול. - תייג את זהות המדגם שנמדד על ידי לחיצה ימנית על תחילת הקלטת pleth ממוספרת ולחץ על הוסף תגובה.
- אפס את המזרק, אפס את הקלט וחזור על מדידות הקלטה של 20 μL פעמיים נוספות (שלוש הפעלות הקלטה בסך הכל).
- לאחר השלמת כל המדידות, השתמש בעכבר המחשב כדי לבחור חלק של pleth נשימה המייצג במדויק את 20 μL הנשימות המלאכותיות.
הערה: בתוך מודול ה- DataPad, הנתונים יופיעו בכותרת התצוגה המקדימה המספקת קריאה זמנית של קצב הנשימה (תדירות מחזורית ממוצעת, הרץ) ועומק הנשימה (גובה מחזורי ממוצע, μL). ניתן להקליט את התצוגה המקדימה של הנתונים ב- DataPad באמצעות הסמל הוסף ל- DataPad . - סקור את נתוני עמודה 3 (גובה מחזורי ממוצע), וחשב את נפח הנשימה הממוצע שנמדד משלוש ההקלטות. בצע את החישוב הבא של נפח הנשימה הממוצע הנמדד: מקדם כיול = נפח נמסר / נפח נמדד x 120,000.
הערה: 120,000 היה מקדם כיול ראש הזרימה מציין המיקום שבו נעשה שימוש בשלב 3.1 ששונה כעת מנתונים שנמדדו. המערכת מכוילת כעת לנשימת עכבר טיפוסית באמצעות טמפרטורת הסביבה והלחות הנוכחיות. המערכת יכולה כעת לנטר את נשימת הנושא, וניתן לבצע כיול מחדש מדי יום כדי לקחת בחשבון כל תנודה בטמפרטורה/לחות.
4. ניטור נושא
- פתח תבנית ראשית כמתואר בשלב 3.4, או השלם את שלבים 4.2 עד 4.3.
- בתוך התוכנה, צור חלון 4-ערוצים עם עיבוד הנתונים הבא: ערוץ 1: נתוני מקור בקצב דגימה של 4 k/s וטווח mV 1 ; ערוץ 2: מסנן דיגיטלי של ערוץ 1 באמצעות מסנן התאמה אוטומטית של High Pass 1 Hz ; ערוץ 3: החלקת נתוני ערוץ 2 על ידי ממוצע של 100 דגימות; ערוץ 4: זרימת ספירומטריה של נתוני ערוץ 3 (ראש זרימה מותאם אישית, מכויל לנוסחה (μL/s) = 120,000 x מתח).
הערה: 120,000 הוא מקדם המתאם המחושב עבור חיישן הלחץ הנוכחי; עם זאת, על המשתמש לבצע את כיול המערכת המתואר בשלב 3 ולהשתמש במקום זאת במקדם מתאם זה המוגדר על-ידי המשתמש. - הגדר ניתוח DataPad של ערוץ 4 עם העמודות הבאות: עמודה 1: נתוני ערוץ 4, הערות > טקסט תגובה מלא; טור 2: נתוני ערוץ 4, מדידות מחזוריות > תדר מחזורי ממוצע; טור 3: נתוני ערוץ 4, מדידות מחזוריות > גובה מחזורי ממוצע.
- יש להניח את הנושא בתא הדגימה ולסגור את המכסה. לצורך ניסוי זה נעשה שימוש בעכבר לבקן C57BL/6J נקבה מודעת ל-4-12 שבועות (B6(Cg)-Tyrc-2J/J).
- השוו את הלחץ האטמוספרי בתא (מאיטום המכסה) על ידי שחרור קצר של מכסה ראש התפזורת של Luer והדקו אותו מחדש.
- שים לב שהנושא אינו נע באופן פעיל בתוך תא הדגימה לפני אפס כל הכניסות (קיצור Alt-Z) והתחלת הקלטה.
הערה: אם הנושא מתחיל לזוז בתא הדגימה, קו הבסיס עשוי לזוז מחוץ לסולם, וניתן לטפל בו על-ידי איפוס מחדש של כל הקלטים באמצע הקלטה, מה שייצור הקלטה חדשה בסולם. נניח שהנושא עוסק בחקירה או בטיפוח במהלך ההקלטה; שים לב איזה חלק של הקלטת plethysmography משקף בצורה המדויקת ביותר נשימה תקינה. - תייג את זהות הנושא על ידי לחיצה ימנית על תחילת הקלטת pleth ממוספרת ולחץ על הוסף תגובה.
- להחזיר את הנושא לכלוב שלו. הגבילו את זמן השהייה בתא הדגימה האטום ל-5 דקות כדי למנוע חנק ומתח.
הערה: הסיכון לחנק נמוך בהתחשב בכך שנפח האוויר של 600 מ"ל של תא הדגימה לא יושקע במהירות על ידי עכבר בריא הנושם במהירות של <15 מ"ל לדקה. - השתמש בעכבר המחשב כדי לבחור חלק של pleth נשימה המייצג במדויק את נושא הנשימה.
הערה: בתוך מודול ה- DataPad, הנתונים יופיעו בכותרת התצוגה המקדימה המספקת קריאה זמנית של קצב הנשימה (תדירות מחזורית ממוצעת, הרץ) ונפח הנשימה (גובה מחזורי ממוצע, μL). ניתן להקליט את התצוגה המקדימה של הנתונים ב- DataPad באמצעות הסמל הוסף ל- DataPad . - המשך למדוד עכברי נושא בזה אחר זה ולרשום קטעים מייצגים של נשימת פלת ל- DataPad.
- לאחר הקלטת נתונים, ייצא נתוני DataPad ל- Excel. חשב את נפח הדקה באופן הבא: נפח דקה (מ"ל/דקה) = קצב נשימה (הרץ) x נפח נשימה (μl) x 0.06.
Representative Results
כיול מערכת
תוכנת ניתוח הנתונים מאפשרת כיול ישיר של ראש זרימה מותאם אישית, כמו זה המתואר כאן. פעולה זו מבוצעת בעת הגדרת זרימת ספירומטריה. כמתואר בשלב 3.1, קיימת אפשרות להזין את נפח אוויר הכיול הידוע, המחשב את מקדם המתאם בין מתח לנפח בתוך המערכת. עם זאת, זה יוצר מקדם מתאם המבוסס על קריאה בודדת, ונצפה כי לווריאציה האינהרנטית של כיול מסטנדרט n = 1 יש תועלת ירודה. הגישה הנוכחית יכולה לתת מענה לחסרון זה ומאפשרת למשתמש לבצע כיול יומי באמצעות קריאות מרובות בממוצע כדי לחשב מקדם כיול. כאן הודגם כיול עם 20 μL של אוויר מוזרק, המייצג נפח נשימה גבוה טיפוסי בעכבר טיפוסי. התוכנה מניחה יירוט מקור (0,0) ולכן מכוילת מ-0-20 μL בגישה זו.
המתודולוגיה המוצעת כאן עבור sWBP מכיילת מדי יום, ובכך לוקחת בחשבון כל תנודות בלחות / טמפרטורה סביבתית. השיטות המקוריות ששימשו ל-WBP ספציפי, מתוארכות למתודולוגיה של Drorbaugh ו-Fenn משנת 1955, שפיתחו WBP למדידת הנשמה בתינוקות אנושיים5. חישובי Drorbaugh ו- Fenn מסבירים את השינויים בטמפרטורה ובלחות של הסביבה והנושא. הגישה הנוכחית מתקנת תנודות סביבתיות על ידי כיול כל סשן sWBP. ובכל זאת, הוחלט להתייחס לשאלה האם החימום והלחות של הנשימה על פני חלל האף/ריאה של עכבר משפיעים על מדידת נפח ידוע של אוויר. לפיכך, נוצר מנגנון מלאכותי כדי לחקות את השפעת הנבדק על חימום ולחות מדידות אוויר מכויל. מחברי Luer חוברו לצינור חרוטי של 15 מ"ל והניחו את החרוט האטום הזה בשורה בין תא הדגימה לבין מזרק הכיול האטום לגז. כיול של 20 μL בוצע באמצעות צינור חרוטי ריק המוחזק בטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס). לאחר מכן, הצינור החרוטי היה מלא חלקית במים מזוקקים עד ממש מתחת למחברי Luer, מה שאפשר לזמן לאזן את מרחב הראש של החרוטי; לאחר מכן נמדד מחדש נפח הכיול כדי לחקור את השפעת הלחות. הצינור החרוטי הונח בבלוק חימום ושיווי משקל ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה לחה, ולבסוף שיווי משקל ל -37 מעלות צלזיוס ללא מים כדי להעריך את ההשפעה של חימום הנושא וללא תרומה נוספת של לחות. איור 2 מראה שכל התנאים שנבדקו לא השפיעו באופן משמעותי על המדידה המכוילת של 20 μL שסופקה על-ידי המזרק אטום לגז. מממצא זה ניתן היה להסיק כי sWBP מציע גישה נגישה לניטור נשימה בחיות מחקר ללא צורך בחישובים מורכבים המבוססים על הטמפרטורה והלחות של הנבדקים בעלי החיים, שכן אלה אינם משפיעים באופן משמעותי על נפח הנשימה הנמדד.
ניטור נושאים
sWBP שימש לניטור הנשימה במהלך המחלה של זיהומים קטלניים בדרכי הנשימה עם הפתוגן החיידקי B. pseudomallei. אחד האתגרים של ניטור נשימה אצל בעלי חיים מודעים הוא הסקרנות של בעלי חיים בריאים רגילים הנעים בתוך תא הדגימה. תנועת העכבר יוצרת קו בסיס הנע ללא הרף, אשר ניתן למתן אותו בין השאר על ידי התניה מוקדמת של נושאים לתא במשך תקופה של מספר ימים לפני המדידה. בעיה זו משפיעה בעיקר על המדידה הבסיסית בעכברים בריאים, שכן הנבדקים הופכים רדומים במהלך ההדבקה, מה שהופך את sWBP להרבה יותר קל לניהול עם פעילות מופחתת של הנושא. זה עשוי להיות מפתה לנסות להשתמש בצורה כלשהי של איפוק, בין אם פיזית או הרדמה. השימוש באיפוק פיזי עשוי להשפיע על הנשימה הטבעית על ידי גרימת מתח. יתר על כן, השימוש בחומרי הרדמה ידוע כבעל השפעות בולטות על קצב הנשימה ועומק10; לפיכך, הוחלט לחקור את ההשפעה של הרדמה עם מנגנון sWBP בתוך הבית. Isoflurane משמש בדרך כלל לביצוע הדמיה אבחנתית in vivo במהלך מודלים של זיהום, ולכן, עכבר C57BL/6 הרדים וניטרו את ההתקדמות עד להתאוששות מההרדמה באמצעות sWBP. ניסוי זה נערך עם עכבר לבקן C57BL/6J צעיר בן 4 שבועות כדי להאריך את חלון ההחלמה מההרדמה. איור 3 מראה שחומר ההרדמה המועדף גורם לעכברים להפגין קצב נשימה איטי עם נפח אוויר גדול. כאשר עכברים מתחילים להתאושש מהרגעה, קצב הנשימה שלהם עולה ונפח הנשימה יורד, כאשר האפקט נטו הוא סך כל האוויר בהשראה עולה לאט. בניסוי זה נמצא כי נפח הנשימה משוחזר לרמות שלפני ההרדמה בתוך 30 השניות הראשונות של ההחלמה. קצב הנשימה עולה בהתמדה עד להחזרת הנשימה הבסיסית ל-2-2.5 דקות לאחר ההסרה מההרדמה. נפח הדקות עקב מקרוב אחר ההשפעות של קצב הנשימה, והגיע לנפח הדקה הבסיסית ב-2.5 דקות לאחר ההסרה מההרדמה. ממצא זה תומך בכך שאין להשתמש בהרדמה בגישת sWBP. זה משפיע באופן דרמטי על הנשימה הבסיסית, באופן לא מפתיע, שכן הרדמה תאט את חילוף החומרים של המארח, ותיצור ביקוש מופחת לחמצן בהשראה. יש לשקול גם תברואה של תא הדגימה בין נבדקים כדי לטפל בבקרת זיהומים ספציפית למחקר, כמו גם בהשפעת פרומונים משתן או צואה שעלולים להשפיע על הלחץ בין הנבדקים.
WBP היא אסטרטגיה אטרקטיבית לניטור תפקוד הריאות במודלים של מחלות נשימה באופן לא פולשני. sWBP שימש כדי לחקור כיצד נשימה משתנה במהלך זיהומים קטלניים במליואידוזיס בדרכי הנשימה (איור 4), כאשר נקודות זמן משקפות ניטור ביולומינסנציה בריאה. נצפה כי מודל זה קשור עם התפרצות מוקדמת של עייפות, אשר נמשך באופן פרוגרסיבי לאט עד להתפתחות של מחלת moribund בערך 3 ימים לאחר ההדבקה. כמו כן, נצפה כי קצב הנשימה וסך כל האוויר (נפח דקה) של העכברים יורדים במהירות במהלך היום הראשון להדבקה ונשארים נמוכים למשך שארית ההדבקה (איור 4A,C). דפוס זה עולה בקנה אחד עם העייפות המוקדמת, שנמשכת במשך היומיים הבאים של ההדבקה. לעומת זאת, נפח הנשימה אינו יורד בתלילות במהלך 24 השעות הראשונות ובמקום זאת יש ירידה קלה וקבועה, המתקרבת לירידה ליניארית במהלך 3 הימים של המחלה (איור 4B).
איור 1: מנגנון sWBP. תא דוגמאות מותאם אישית נבנה מצנצנת זכוכית מרובעת אטומה עם מחברים בתפזורת על שני פנים שטוחים. ראש תפזורת אחד שימש להרכבת חיישן לחץ מד המחובר למגבר גשר ולמכשיר דיגיטציה של התקן איסוף נתונים באמצעות חיבור DIN בן 8 פינים. ראש הצובר השני היה מצויד במחבר Luer לכיול על ידי מזרק אטום לגז. ההתקן היה מחובר למחשב שבו פועלת התוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: השפעת טמפרטורת הנושא והלחות על נפח הנשימה. צינור חרוטי של 15 מ"ל עם מחברי Luer הותקן בקו בין מזרק הכיול של 20 μL לבין תא הדגימה. המערכת כוילה ל-20 μL ללא תרומה נוספת של טמפרטורה/לחות מהצינור החרוטי. מדידות אחרות נאספו לאחר שיווי משקל עם לחות רוויה ממים מזוקקים ו/או התחממות הצינור החרוטי מטמפרטורת החדר (23 מעלות צלזיוס) לטמפרטורת הגוף (37 מעלות צלזיוס). לא זוהה הבדל משמעותי בין n = 5 מדידות של כל מצב על ידי ANOVA בכיוון אחד עם ההשוואה המרובה של Tukey לאחר הבדיקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: השפעת הרדמת גזים על נשימה בעכברים. נתונים מייצגים מעכבר לבקן C57BL/6J נקבה בת 4 שבועות (8.6 גרם) הוכתמו במשך 5 דקות עם 3% איזופלוראן בחמצן והועברו לתא דגימה של sWBP. נתוני Pleth נאספו במשך 150 שניות לאחר הסרת ההרדמה. הנבדק החל אמביציה ראשונית של 100 שניות לאחר הסרת ההרדמה. (A) נשימה בסיסית לפני הרדמה, מדידת קצב נשימה של 4.97 הרץ, נפח נשימה של 9.74 μL ונפח דקה של 2.91 מ"ל. (B) 60 השניות הראשונות של שינויים בנשימה במהלך ההתאוששות מההרדמה. (א-ב) ציר אנכי המודד μL לנשימה וציר אופקי בשניות. (ג-ה) נתוני האוורור נאספו במהלך 150 שניות ההתאוששות מההרדמה, בממוצע מ-≥3 מחזורי נשימה לנקודת זמן עבור (C) קצב נשימה, (D) נפח נשימה, ונפח הדקה המחושב (E). ערכי הבסיס שלפני ההרדמה מסומנים בקו מקווקו אופקי בכל גרף בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: ההשפעה של מליואידוזיס נשימתי על נשימת המארח. חמש נקבות C57BL/6 נקבות בנות 8 שבועות נדבקו ב-4.9 לוג CFU של זן B. pseudomallei JW270. sWBP נערך לאורך 3 ימים של זיהום, מדידת קצב נשימה (A) ונפח נשימה (B). סך כל האוויר בהשראת חושב כנפח הדקה (C). הנתונים עבור כל אחד מחמשת הנושאים משורטטים באופן עצמאי עם רגרסיה פולינומית מסדר שלישי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Discussion
sWBP היא גישה אטרקטיבית לשיפור ההבנה של זיהום בדרכי הנשימה במודלים של בעלי חיים קטנים. חשוב לציין שמדובר בגישה לא פולשנית, וככזו, היא אינה מהווה סיכון משמעותי לגרימת לחץ מופרז על חיות מחקר במהלך אתגר זיהום. ואכן, הליך ניטור נשימת הנושא הוא בדיקה מהירה הדורשת מספר דקות וטיפול מינימלי בנושא. היתרון המדעי הוא ההבנה ברזולוציה גבוהה של האופן שבו פתוגנים מיקרוביאליים משפיעים על תפקוד הריאות במהלך מחלה. גישה זו תספק תועלת למחקר בסיסי, ותקל על ההבנה כיצד פתוגן גורם למחלה, וכן תספק כלי עזר תרגומי להבנת האופן שבו טיפול חדשני משחזר מחקר הכפוף למצב של בריאות נשימתית.
בכתב יד זה, תוצאות מייצגות מסופקות עבור הפתוגן B. pseudomallei, אשר גורם לתגובה רדומה מוקדמת. לא כל דלקות הריאות החיידקיות קיימות באותו אופן במודלים של זיהום עכברים. ניסיון קודם עם מודלים אחרים של זיהום הראה כי הפתוגן החיידקי Klebsiella דלקת ריאות מציג כזיהום אסימפטומטי עד לנקודה שבה עכברים נכנעים לזיהום, גם בערך ביום 3 לאחר ההדבקה11. ההשערה היא שהדרישה של המארח לאוויר בהשראה (כלומר, נפח דקה) עשויה להיות קשורה קשר הדוק למידת העייפות שבה מופיעה מחלה נתונה. מחקרים עתידיים יידרשו כדי לבחון כיצד פתוגנים חיידקיים שונים משפיעים על תפקוד הריאות במהלך מחלות בדרכי הנשימה. מובן כי לפתוגנים שונים יש גישות ייחודיות להתחמקות מהגנת המארח, כולל הבדלים, (1) נטייה להיות פתוגנים תוך-תאיים או חוץ-תאיים, (2) היכולת לגרום לתגובה היפותרמית מוקדמת/מאוחרת, ו-(3) שימוש ברפרטוארים שונים של דטרמיננטות אלימות 3,12,13. לכן, סביר להניח שאסטרטגיות מחלה שונות יביאו להשפעות ייחודיות על תפקוד הריאות והנשימה במהלך ההדבקה.
ניתן לשנות את ההגדרות המומלצות המתוארות בפרוטוקול זה כך שיתאימו לאתגרים ייחודיים הקיימים במהלך sWBP. אחת הבעיות הנפוצות שחווים במהלך סשן הקלטה של sWBP היא התנועה של הנבדק בתוך תא הדגימות. כאמור, תנועה זו משנה את קו הבסיס ויכולה להשפיע על דיוק מדידות הנשימה. מסנן דיגיטלי שימש לנרמול קו הבסיס המשתנה, המאפשר מדידות נשימה בנות קיימא למרות תנועות קטנות. תנועה מוגזמת עלולה לדחוף מדידה בסיסית אל מחוץ לטווח של קלט מאופס. ההקלטות מומלצות בטווח של 1 mV (הגדרת ערוץ 1), מה שמספק פשרה של עדיין התבוננות בפסגות הפלתיסמוגרפיה תוך הימנעות מאובדן נתונים מחוץ לטווח. עבור נושאים פעילים במיוחד, ייתכן שיהיה צורך להאריך את טווח ההקלטה >1 mV כדי למנוע אותות מתמשכים מחוץ לטווח.
ההליך המומלץ דורש כיול יומי (או בכל הפעלה) כדי להתאים לתנודות הלחות/הטמפרטורה בסביבה. WBP מסורתי משתמש בחישובים מורכבים המביאים בחשבון את הטמפרטורה/לחות הן של הסביבה והן של הנושא 5,6. הוכח כי במנגנון sWBP הנוכחי, ההשפעות של הטמפרטורה/לחות של המארח אינן משנות באופן משמעותי את נפח הנשימה הנמדד של מקור כיול. לכן, גישה זו ב- sWBP שונה במהותה מהגישה בת >50 השנים של Drorbaugh ו- Fenn. כאן, sWBP מתייחס ישירות לשינויי לחץ לנפח נשימה מדוד ללא תיקון נוסף מהמארח.
חיוני להשוות בין WBP של בעלי חיים מחקריים לזה של WBP קליני. סוגי הנתונים הביומטריים שניסו לאסוף על ידי sWBP הם נפח נשימה ותדירות. מדידות כאלה נאספות קלינית באמצעות ציוד ספירומטריה פשוט שבו מטופל מחזיק מוניטור נשימה לפיו ונושם כרגיל לתוך מכשיר המנטר את זרימת האוויר. ספירומטריה דומה בחיות מחקר דורשת איפוק, ובכך תורמת ללחץ ולהפרעה מובנית בנשימה. לכן, ספירומטריה פשוטה היא פונקציונלית מבחינה קלינית אך לא עבור חיות מחקר. WBP משרת מטרה חיונית במרפאה כדי לאסוף נתונים מתקדמים, כולל מדידות כגון נפח ריאות שיורי. נתונים כאלה יכולים להיכלל רק בהקשר של נבדק להיות מסוגל לעקוב אחר הוראות על איך הם נושמים, כולל תפוגה כפויה (ריקון הריאה שלהם על ידי נשיפה עמוקה). לא ניתן לסמוך על חיות מחקר שימלאו אחר הוראות הנשימה של החוקר. רבות מהמדידות המתקדמות שנאספו קלינית במהלך WBP אינן ניתנות לשחזור בחיות מחקר. WBP בחיות מחקר שונה במהותו מ- WBP קליני. Animal WBP מבקשת לאסוף נתוני אוורור פשוטים (קצב נשימה ונפח) באופן לא מאופק כדי למנוע לחץ על בעלי חיים והפרעות נשימה. עד כה, נראה כי השימוש ב-WBP בחיות מחקר משכפל את הטכניקות המשמשות ב-WBP קליני, כולל חישובים מורכבים המבוססים על טמפרטורה ולחות סביבתית ונושאת, אך ללא יכולת לאסוף את הנתונים המתקדמים מנבדק שיכול לעקוב אחר הוראות כיצד לבצע תפוגה כפויה. מתוך מחשבה על כך, הוא ביקש להדגים אם גרסה פשוטה יותר של WBP תספיק כדי לאסוף את תדירות הנשימה הרלוונטית ואת נפח רלוונטי למחקרי מחלות נשימה. נעשה שימוש בסשן כיול, אשר פיצה על כל שינוי בטמפרטורת הסביבה ובלחות. יתר על כן, הודגם בעכבר מלאכותי כי לטמפרטורת הנושא, וללחות לנפח נשימה שנמדד אין השפעה משמעותית על מדידה מדויקת של נפח הנשימה. הגיע למסקנה כי ל- sWBP יש יישום מצוין למחקרים בבעלי חיים, ללא דרישת המשתמש להשתמש בטיפול מתמטי מסורבל בנתונים.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים.
Acknowledgments
מחקרים אלה נתמכו על ידי מענק COBRE של המכונים הלאומיים לבריאות P20GM125504-01 תת-פרויקט 8246.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/8" NPT Luer adaptor | Amazon | B07DH9MY8W | Calibration port |
| 1/8" NPT to 1/4" NPT adaptor | Amazon | B07T6CR6FS | Bulkhead to luer adaptor |
| 150 kohm resistor | Amazon | B07GPRYL81 | Pressure transducer excitation voltage selection |
| 3/4" diamond drill bit | Drilax | DRILAX100425 | To drill bulkhead mounts in glass jar |
| Bridge Amp | AD Instruments | FE221 | One channel option |
| Bulkhead fitting | Legines | 3000L-B | 1/4" NPT, 3/4-16 UNF brass bulkhead coupling |
| Chaney adaptor | Hamilton | 14725 | Gas tight syringe adaptor for set volume |
| DIN connector | AD Instruments | SP0104 | To connect pressure sensor to Bridge Amp |
| Gastight syringe, 25 uL | Hamilton | 80201 | Calibration syringe |
| LabChart | AD Instruments | Life Science Data Acquisition Software | |
| Luer plug | Cole Parmer | 45513-56 | Calibration port closure |
| PowerLab 4/26 | AD Instruments | PL2604 | Digital interface to computer |
| Pressure transducer | Omega Engineering | PX409-10WGV | High accuracy oil filed gage pressure sensor |
| Rubber gasket | Amazon | B07LH4C8LS | To mount bulkheads (4 required per chamber) |
| Square glass jar | Amazon | B07VNSPR8P | 600 ml with 95 mm silicone gasket |
References
- Warawa, J. M., Long, D., Rosenke, R., Gardner, D., Gherardini, F. C. Role for the Burkholderia pseudomallei capsular polysaccharide encoded by the wcb operon in acute disseminated melioidosis. Infection and Immunity. 77 (12), 5252-5261 (2009).
- West, T. E., Myers, N. D., Liggitt, H. D., Skerrett, S. J. Murine pulmonary infection and inflammation induced by inhalation of Burkholderia pseudomallei. International Journal of Experimental Pathology. 93 (6), 421-428 (2012).
- Lawrenz, M. B., et al. Development and evaluation of murine lung-specific disease models for Pseudomonas aeruginosa applicable to therapeutic testing. Pathogens and Disease. 73 (5), (2015).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (90), e51755 (2014).
- Drorbaugh, J. E., Fenn, W. O. A barometric method for measuring ventilation in newborn infants. Pediatrics. 16 (1), 81-87 (1955).
- Simon, G., Pride, N. B., Jones, N. L., Raimondi, A. C. Relation between abnormalities in the chest radiograph and changes in pulmonary function in chronic bronchitis and emphysema. Thorax. 28 (1), 15-23 (1973).
- Gassiep, I., Armstrong, M., Norton, R. Human melioidosis. Clinical Microbiology Reviews. 33 (2), 06-19 (2020).
- Gutierrez, M. G., Warawa, J. M. Attenuation of a select agent-excluded Burkholderia pseudomallei capsule mutant in hamsters. Acta Tropica. 157, 68-72 (2016).
- Gutierrez, M. G., Pfeffer, T. L., Warawa, J. M. Type 3 secretion system cluster 3 is a critical virulence determinant for lung-specific melioidosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (1), 3441 (2015).
- Rocco, P. R. M., Zin, W. A. Anaesthesia, Pain, Intensive Care and Emergency Medicine. Gullo, A. , Springer. (2002).
- Fodah, R. A., et al. Correlation of Klebsiella pneumoniae comparative genetic analyses with virulence profiles in a murine respiratory disease model. PLoS One. 9 (9), 107394 (2014).
- Gotts, J. E., et al. Clinically relevant model of pneumococcal pneumonia, ARDS, and nonpulmonary organ dysfunction in mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 317 (5), 717-736 (2019).
- Galan, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host & Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
