Summary
We beschrijven geoptimaliseerde hulpmiddelen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen met fluorescentiemicroscopie van lichtplaten. In het bijzonder stellen we heldere cardiale transgene lijnen voor en presenteren we nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelings- en hartafwijkingen voorkomen. Een mogelijke data-acquisitie- en analysepijplijn aangepast aan cardiale beeldvorming wordt ook verstrekt.
Abstract
Embryonaal cardiaal onderzoek heeft veel baat gehad bij de vooruitgang in snelle in vivo light sheet fluorescentiemicroscopie (LSFM). In combinatie met de snelle externe ontwikkeling, handelbare genetica en doorschijnendheid van de zebravis, Danio rerio, heeft LSFM inzichten opgeleverd in cardiale vorm en functie bij hoge ruimtelijke en temporele resolutie zonder significante fototoxiciteit of fotobleaching. Beeldvorming van kloppende harten daagt bestaande monstervoorbereidings- en microscopietechnieken uit. Men moet een gezond monster in een vernauwd gezichtsveld houden en ultrasnelle beelden verkrijgen om de hartslag op te lossen. Hier beschrijven we geoptimaliseerde tools en oplossingen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen. We demonstreren de toepassingen van heldere transgene lijnen voor het labelen van de cardiale bestanddelen en presenteren nieuwe zachte inbeddings- en immobilisatietechnieken die ontwikkelingsstoornissen en veranderingen in de hartslag voorkomen. We stellen ook een pijplijn voor gegevensverzameling en -analyse voor die is aangepast aan cardiale beeldvorming. De hele workflow die hier wordt gepresenteerd, richt zich op embryonale hartbeeldvorming van zebravissen, maar kan ook worden toegepast op verschillende andere monsters en experimenten.
Introduction
Om de complexe gebeurtenissen en interacties in het vroege kloppende hart bloot te leggen, is in vivo beeldvorming van het hele orgaan vereist. Met zijn minimale fototoxiciteit1,2,3, lage fotobleaching4 en hoge snelheid is lichtplaatmicroscopie geëvolueerd als het primaire beeldvormingsinstrument voor embryonale en cardiale ontwikkeling5,6. Het heeft inzichten opgeleverd in cardiale vorm en functie bij een hoge ruimtelijke en temporele resolutie7,8,9 en heeft onderzoekers in staat gesteld om fluorescerend gelabelde delen van het hart met hoge snelheid in beeld te brengen en te volgen, hemodynamische krachten te bestuderen en de hartontwikkeling direct in het lichaam van zich ontwikkelende embryo's te volgen6,10,11,12.
Om zebravissen in het gezichtsveld nauwkeurig en reproduceerbaar te beperken, bestaan er verschillende inbeddingsprotocollen voor lichtplaat, voor de korte en lange termijn, evenals enkele of meervoudige monsters13,14,15,16,17,18,19. Het meest voorkomende protocol omvat tricaïne immobilisatie en agarose montage in een glazen of plastic buis. Omdat de hartslag echter kan veranderen als gevolg van de gebruikte temperatuur, anesthetica en inbeddingsmateriaal20,21,22, vereist beeldvorming van zebravissen specifieke, zachte protocollen om de gezondheid van het monster te waarborgen6,8,11,12,20,21,22,23 . Voor kortetermijnbeeldvorming (tot een uur) kan men de vis verdoven in 130 mg / L tricaïne en inbedden in gefluoreerde ethyleenpropyleen (FEP) buizen met 0,1% agarose-oplossing en een plug, zoals beschreven in Weber et al. 201416. Omdat tricaïne echter kan leiden tot ontwikkelingsstoornissen20,22, moeten verschillende protocollen worden gebruikt voor beeldvorming op lange termijn.
Hier beschrijven we een nieuwe strategie voor cardiale beeldvorming op lange termijn. Hoewel er veel lichtplaatimplementaties bestaan24, raden we aan een hangend monster in een T-SPIM-microscoop te gebruiken (één detectie- en twee verlichtingslenzen in een horizontaal vlak met het monster verticaal hangend in de gemeenschappelijke focus). Dit geeft de nodige bewegingsvrijheid en rotatie voor de precieze monsterpositionering. De vissen worden geïmmobiliseerd door 30 pg α-bungarotoxine mRNA te injecteren in het een- of tweecellige stadium. α-bungarotoxine is een slangengif dat spieren verlamt zonder de cardiovasculaire ontwikkeling of fysiologie te beïnvloeden22. Voor nauwkeurige, vervormingsvrije beeldvorming raden we aan vissen te monteren in buizen gemaakt van FEP, een polymeer met een brekingsindex die bijna identiek is aan water. We bespreken hoe we de FEP-buizen het beste kunnen voorbereiden door ze recht te trekken en te reinigen voorafgaand aan de beeldvorming. De vissen worden vervolgens in deze buizen gemonteerd, met het hoofd naar beneden, in media, en de bodem van de buis wordt afgesloten met een 2% agarose-plug, waarop viskoppen rusten. Het snijden van gaten in de FEP-buis vergemakkelijkt de gasuitwisseling en zorgt voor visgroei. De ingebedde vis kan in media worden bewaard totdat deze direct voor de beeldvorming op een monsterhouder wordt gemonteerd. We stellen ook een pijplijn voor gegevensverzameling en -analyse voor reproduceerbare high-speed imaging voor. Verder bespreken we het gebruik van cytoplasmatische versus membraanmarkertransgene lijnen voor robuuste hartceletikettering, evenals verschillende opties om het hart te stoppen. Deze montagetechnieken zorgen voor de gezondheid van het monster en maken het mogelijk om het hart nauwkeurig en reproduceerbaar in het gezichtsveld te beperken.
Protocol
Alle zebravissen (Danio rerio) volwassenen en embryo's werden behandeld in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door de UW-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Bereiding van zebravissen
- Behandel zebravissen volgens vastgestelde protocollen25,26 en institutionele richtlijnen. Fok volwassen vissen van de gewenste transgene lijn (zie Discussie). Verzamel de embryo's en bewaar ze op 28 °C in een petrischaal gevuld met vismedium, bijvoorbeeld E327.
- Kies een methode van immobilisatie (zie Discussie).
- Als u α-bungarotoxine mRNA gebruikt om de vis te immobiliseren, injecteer dan 30 pg mRNA22 in de dooier van embryo's met een of tweecellige stadium met behulp van een glazen naald met boring die op een micromanipulator is gemonteerd en verbonden met een picoinjector28.
- Maak bij gebruik van tricaïne 0,4% stockoplossing gebufferd tot pH 7,0-7,4 met 1 M Tris-basis en bewaar bij -20 °C tot de beeldvorming.
- Bewaar de eieren in een met E3 gevulde petrischaal bij 28 °C en breng de eieren elke 24 uur over in een nieuw gerecht met verse E3 totdat ze worden afgebeeld.
- Om pigmentvorming te voorkomen, als de zebravisachtergrond geen albino is, breng je de vis 24 uur na de bevruchting (hpf) over naar een nieuwe E3-schaal met 0,2 mM tyrosinaseremmer 1- fenyl 2-thioureum (zie Discussie).
2. Voorbereiding van FEP-buizen
Figuur 1: Reiniging en rechttrekken van FEP-buizen. (a) FEP-buizen op een kabeltrommel. b) FEP-buizen vóór het rechttrekken. c) FEP-buizen in glazen en stalen autoclaafveilige buizen. d) Spoelen van de FEP-buizen na het rechttrekken en afkoelen. e) FEP-buis ter grootte van een centrifugebuis gesneden voor ultrasoonapparaat. f) Spoelen van FEP-buizen na ultrasoonapparaat. g) Opslag van de gereinigde en rechtgetrokken FEP-buizen in een centrifugebuis. (h) Het doorsnijden van de FEP-buis voorafgaand aan de beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Maak de FEP-buizen recht (figuur 1a,b) door ze in een glazen of stalen autoclaafveilige buis (figuur 1c) met de juiste binnendiameter te plaatsen voor FEP-buizen, meestal 1,6 of 2,4 mm, en autoclaaf tot 180 °C gedurende 2 uur. Laat de buizen minstens 5 uur afkoelen bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens uit de rechtrichtbuizen.
OPMERKING: Gebruik handschoenen bij het manipuleren van de buizen en werk met 50 cm buizen per keer. - Reinig de FEP-buizen.
OPMERKING: Spuiten met stompe naaldpunt van de binnenste FEP-buisgrootte worden aanbevolen voor de veiligheid, maar een gewone naald zal werken.- Spoel de buisjes tweemaal met 1 M NaOH met een spuit van 50 ml (figuur 1d).
- Snijd de FEP-buizen tot de grootte van een centrifugebuis van 50 ml met een scheermesje (figuur 1e), plaats gesneden buizen in 0,5 M NaOH gevulde centrifugebuizen en ultrasoon gedurende 10 minuten.
- Spoel de FEP-buizen met dubbel gedestilleerd H2O en herhaal het spoelen met 70% ethanol (figuur 1f).
- Breng buizen over naar 70% ethanol en ultrasoon gedurende 10 minuten.
- Spoel de buizen met dubbel gedestilleerd H2O en bewaar ze in centrifugebuizen in dubbel gedestilleerd H2O (figuur 1g).
3. Bereiding van 2% agarose gerecht
- Los in een glazen kolf agarosepoeder met een laag smeltpunt op in E3. Verwarm de oplossing in een magnetron en roer het om de 20 s, totdat al het poeder is opgelost.
- Giet agarose in een glazen of plastic petrischaal om een laag van 1-2 mm te maken. Wacht tot agarose is gestold.
- Om te bewaren, giet E3 voorzichtig op de bovenkant van de agar om uitdroging te voorkomen. Wikkel in folie van paraffine en houd het bij 4 °C.
4. Voorbereiding van inbeddingsmedia
- Bereid voldoende E3 voor om de monsterkamer te vullen.
OPMERKING: Vermijd het gebruik van methylblauw als de media in contact komen met objectieve lenzen. - Als u tricaïne gebruikt, ontdooi dan de bouillonoplossing en voeg 0,02% tricaïne toe aan E3.
5. Monstermontage
Figuur 2: Embryomontage in FEP-buis. (a) Verdoofde pigmentvrije vis in montagemedia. b) Een spuit met stompe eindnaald en FEP-buis bevestigd. c) Zodra media en vissen in de FEP-buis zijn opgenomen, snijdt u de buis aan de rand van de naald. d) Dompel de gesneden buis in een schaal bedekt met 2% agarose om het uiteinde te sluiten. e) Een zebravis in een verstopte FEP-buis. f) Snijd de FEP-buis voorzichtig op 30° om gaswisselgaten te creëren. g) FEP-buis met vier gaten boven een ingebedde zebravis. h) Schema van een zebravis ingebed in een FEP-buis. Gaten en agarplug zijn aangegeven. (i) Meerdere ingebedde zebravissen klaar voor beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Breng met een glazen wegwerppipet de vis over op inbeddingsmedia (figuur 2a). Als u tricaïne gebruikt, breng de vis dan over naar een petrischaal gevuld met tricaïnebevattende E3, 10 minuten vóór de beeldvorming. In beide gevallen, bekijk onder een stereomicroscoop om te controleren of de vis is gestopt met bewegen en dat het hart met dezelfde snelheid klopt in vergelijking met de controle.
- Snijd de FEP-buis op de ideale lengte met een scheermesje (figuur 1h).
OPMERKING: De lengte moet worden aangepast aan de monsterhouder van de microscoop; de typische lengte is ongeveer 3 cm. - Bereid een spuit voor met een stompe canule. Vul de spuit met lucht, monteer vervolgens de FEP-buis op de naald en spoel het resterende water voorzichtig weg door de spuit te legen (figuur 2b).
OPMERKING: Vermijd het maken van bubbels door de lucht langzaam weg te spoelen. - Neem met de op de spuit gemonteerde FEP-buis eerst media op om de FEP-buis te vullen en neem vervolgens een embryokop naar beneden. Houd de viskop zo dicht mogelijk bij het uiteinde van de buis. Vermijd het maken van bubbels; als er een bubbel aanwezig is, gooit u het monster weg.
- Snijd met een scheermesje voorzichtig de FEP-buis aan de rand van de stompe canule of naald (figuur 2c).
- Gooi alle vloeistof op de bovenkant van de met agar bedekte schaal weg. Dompel de FEP-buis recht in de agar (figuur 2d). Draai de buis en haal hem eruit om de plug uit het agarosebed te halen.
- Controleer onder een stereoscoop de aanwezigheid van de agarplug aan het einde van de buis (figuur 2e).
- Voor langetermijnbeeldvorming snijdt u 3-5 gaten in de FEP-buis in elke windrichting, ten minste 5 mm boven het uiteinde van de vis.
- Gebruik onder een stereoscoop een scheermesje loodrecht op de as van de buis om een incisie van 30° in de FEP-buis te maken totdat u de montagemedia bereikt (figuur 2f).
- Maak een tweede snede op 180° om een gat te maken (figuur 2g,h).
- Breng de gemonteerde embryokop terug in een microcentrifugebuis van 1,5 ml met inbeddingsmedia totdat deze klaar is voor beeld (figuur 2i).
6. Monster positionering
Figuur 3: Monsterkamer. a) FEP-buis gemonteerd op een monsterhouder. b) De monsterkamer met fasen en doelstellingen. c) Bovenaanzicht van de met media gevulde monsterkamer, met verlichtings- en detectieobjectief in een T-SPIM-configuratie. d) Monsterhouder gemonteerd op de microscoop, met het monster in de kamer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Embryopositionering voor hartbeeldvorming. (a) 24 hpf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry) zebravis met verkeerd uitgelijnde ogen. a') Dezelfde vis, met uitgelijnde ogen. (b) Dezelfde vis draaide -100 ° en (b') -50 ° voor een optimale beeldvorming van het hart. c) zebravis van 48 pkf met verkeerd uitgelijnde ogen. c') Dezelfde vis, met uitgelijnde ogen. d) Dezelfde vis 30° gedraaid voor een optimale beeldvorming van het hart. Zwarte pijlen wijzen naar het hart. Schaalbalk 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Monteer de FEP-buis bij de microscoop in de monsterhouder (figuur 3a) en vul de beeldvormingskamer met inbeddingsmedia (figuur 3b,c). Plaats vervolgens de monsterhouder op het podium met het monster in de kamer (figuur 3d).
- Controleer de status van het monster. Beoordeel de hartslag visueel om het algehele welzijn van vissen te evalueren, omdat de specifieke hartslag afhankelijk is van het stadium en de temperatuur, door te vergelijken met niet-gemonteerde controlevissen. Als de hartslag te langzaam is, gooi de vis dan weg.
OPMERKING: Zorg voor een voorzichtige behandeling van embryo's, zorgvuldige overdracht naar inbeddingsmedia, beeldvorming onmiddellijk na inbedding, vermijd snelle temperatuurveranderingen, vermijd tricaïne en verlaag de blootstellingstijd aan tricaïne. - Gebruik voor reproduceerbare beeldvorming altijd dezelfde monsterpositie. Het wordt aanbevolen om de ogen en beeldvorming onder een hoek uit te lijnen.
- Draai de vis zo dat beide ogen (figuur 4a,c) zich in het brandpuntsvlak bevinden (figuur 4a',c')
- Draai de vis vanuit die positie verder ongeveer 50 °-100 ° met de klok mee voor 24 hpf-beeldvorming (figuur 4b, b'), en ongeveer 20 °-30 ° tegen de klok in voor 48 hpf-beeldvorming (figuur 4d).
OPMERKING: Het vroege hart, vóór 30 pkf, kan moeilijk in beeld te brengen zijn vanwege de verborgen positie (figuur 4b).
7. Beeldverwerving
- Kies de verlichtingskant die de beste beeldkwaliteit geeft en pas het laservermogen aan elke vis aan.
OPMERKING: Noteer het laservermogen dat wordt gebruikt voor de daaropvolgende beeldanalyse. - Neem op elk z-vlak 4-5 hartslagen op met 300 frames per seconde (fps) of meer.
OPMERKING: Het gezichtsveld kan worden bijgesneden om de acquisitiesnelheid te verhogen. Bij 48 pk klopt het hart van de zebravis bijvoorbeeld twee tot drie keer per seconde, daarom zijn bij 300 fps tussen de 300 en 600 frames nodig om vier tot zes hartslagen te verkrijgen. - Om het kloppende hart vast te leggen, beweegt u het monster stapsgewijs door het lichtblad. Gebruik een z-afstand van 1-2 μm, die de gehele diepte van het hart bestrijkt.
8. Beeldverwerking
- Synchroniseer opgenomen film om een 4D (x,y,z, tijd) hart te reconstrueren met behulp van een Fiji (Afbeelding J229,30) plugin zoals eerder beschreven6.
- Om gegevens te verkennen en films van het gerenderde zebravishart te genereren, laadt u het 4D-bestand (x, y, z, tijd) in een 3D-renderingsoftware.
Representative Results
Figuur 5: Het 48 pk sterke zebravishart. (a) Still van één z-frame, anterieur-ventraal beeld van 48 hpf Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) zebravis, afgebeeld met LSFM, (b) 3D reconstructie van filmstapels, cut view door het atrium. (c) Montage van vier frames over een volledige hartslag op één z-vlak. Cirkeldiagrammen geven de tijd tijdens de hartslag aan. Schaalbalk 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
We hebben het 48 pk kloppende hart van Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:lck-EGFP) zebravis geregistreerd volgens het hierboven beschreven protocol (figuur 5). Een laserlichtplaat van 488 nm en een laserlichtplaat van 561 nm verlichtten het monster tegelijkertijd. De uitgezonden fluorescentie werd loodrecht gedetecteerd met behulp van een objectieflens van 16x/0,8 W en een wetenschappelijke metaaloxide halfgeleidercamera (sCMOS).
Met 48 pkf heeft het hart net looping ondergaan en heeft het twee kamers, de ventrikel en het atrium, maar moet nog kleppen ontwikkelen. In onze films zijn de verschillende hartstructuren zoals instroomkanaal, ventrikel, atrioventriculaire kanaal (AVC), atrium en uitstroombaan gemakkelijk te onderscheiden (figuur 5a,b). Deze gegevens tonen het precieze kloppen en onthullen complexe interacties tussen de twee cellagen van het hart: het myocardium, een eencellige spierlaag die samentrekt en genereert (figuur 5c, rood), en het endocardium, een enkele cellaag die het hart verbindt met de vasculatuur (figuur 5c, cyaan).
De hartslagreconstructie in x,y,z (3D) + tijd (4D) + kleur (5D) werd uitgevoerd volgens Mickoleit et al.6. De reconstructie is gebaseerd op twee hypothesen: de beweging van het hart is repetitief en gegevens moeten worden verkregen met een kleine z-stap. De output is een gereconstrueerde enkele hartslag in 5D, met een afmeting van 30 GB tot 80 GB per hartslag. Om de gegevens weer te geven, gebruikten we de gratis, open-source tool FluoRender voor diepgaande rendering31 , omdat deze is ontworpen om multidimensionale datasets te verwerken en gemakkelijk 5D-films van zowel cellagen als afzonderlijke lagen weergeeft (figuur 5b).
Discussion
Transgene lijnen om het hart in beeld te brengen
Figuur 6: Vergelijking van cytoplasmatische en membraanmarker zebravis transgene lijnen. Anterieur-ventraal beeld van 48 hpf zebravisharten afgebeeld met LSFM. Witte pijlen geven structuren aan die alleen zichtbaar zijn met een transgene lijn met membraanmarkers. a) Tg(kdrl:EGFP)32 signaal in cyaan in het hart en (a') in de ventrikel. b) Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed)33 signaal in rood in het hart en (b') in de ventrikel. ( c,c') samenvoeging van zowel Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry; myl7:dsRed) als Tg(kdrl:EGFP) signaal. Schaalbalk 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Het in beeld brengen van het zebravishart vereist nauwkeurige labeling van hartcellen. Hoewel de myocardiale dikte relatief constant is in de cellen, zijn endocardiale cellen dik rond de kern, maar hebben dunne membraanuitsteeksels, in sommige regio's dunner dan 2 μm. Cytoplasmatische transgene lijnen zoals Tg(kdrl:EGFP)32 labelen effectief de gebieden rond endocardiale kernen, maar verder weg zendt het dunne cytoplasma mogelijk niet genoeg fotonen uit om te worden gedetecteerd met zulke korte belichtingstijden, wat leidt tot kunstmatige gaten in de gegevens (figuur 6a). Daarentegen kunnen transgene lijnen van membraanmarkers zoals Tg(kdrl:Hsa.HRAS-mCherry)33 het endocard effectief labelen en meer details onthullen (figuur 6b,c). Kies voor elk experiment zorgvuldig de meest geschikte transgene lijn.
Immobilisatie van zebravissen
De keuze van de immobilisatietechniek hangt af van de lengte van het experiment en de leeftijd van de vis om in beeld te brengen. Tricaine is vaak gebruikt voor zebravis immobilisatie, vooral vanwege het gebruiksgemak. Inderdaad, het simpelweg toevoegen van 130 mg / L tricaïne aan de vismedia resulteert in hun verdoving in 10 minuten. Omdat het kan leiden tot ontwikkelingsstoornissen en de hartfysiologie kan beïnvloeden20,22, raden we aan om tricaïne alleen te gebruiken voor korte experimenten (minder dan 30 minuten). Voor langere beeldvorming verlamt α-bungarotoxine mRNA-injecties in het een- of tweecellige stadium vissen tot 3 dagen na de bevruchting (dpf) zonder de cardiovasculaire ontwikkeling of fysiologie te beïnvloeden22.
De juiste FEP-buizen kiezen
FEP buizen zijn verkrijgbaar in verschillende diameters en diktes. Om 0-5 dpf-vis af te beelden, is 0, 8 mm een goede binnendiameter; kies voor dikwandige buizen van 0,8 x 1,6 mm of dunwandige buizen van 0,8 x 1,2 mm. We raden dunwandige buizen aan; dikkere wanden bieden echter meer stabiliteit en stijfheid, wat belangrijk kan zijn als de monsterkamer stromende media heeft die een dunne buis kunnen verstoren en verplaatsen. Voor grotere monsters kan 1,6 x 2,4 mm en 2 x 3 mm worden gebruikt.
Temperatuur- en gasuitwisseling
Een essentieel aspect van het welzijn van het zebravisembryo is temperatuur. Houd de vis idealiter op 28,5 °C tijdens het fotograferen, omdat de temperatuur van de omgeving de ontwikkeling en hartslag beïnvloedt34.
In onze ervaring handhaaft zuurstofuitwisseling via de 2% agarose-plug alleen een stabiele hartslag tot 3-4 dpf. Daarom zorgt het snijden van gaten in de buis voor zuurstofdiffusie. Het kan ook nodig zijn voor medicijnafgifte aan het monster indien gewenst.
Opschorting van hartslag.
De hoge acquisitiesnelheden van goed uitgeruste lichtplaatmicroscopen maken het mogelijk om het kloppende hart in vivo te registreren. Om echter een ongestoorde z-stack te verkrijgen, kan men het hart vertragen of stoppen. Het stoppen van het hart leidt echter tot ontspanning van de hartspier en kan leiden tot de ineenstorting van het hart6. Hartslagsuspensie kan worden gedaan met behulp van morfos, lage temperaturen, een remmer van spiercontractie of optogenetica. Deze methoden hebben elk hun nadelen en moeten voor elk experiment zorgvuldig worden geëvalueerd.
De injectie van 4 ng stil hart (sih) morfolino in het eencellige stadium kan de hartslag stoppen door zich te richten op het gen tnnt2a dat cruciaal is voor de vorming van sarcomeer35. sih zebravissen hebben geen hartslag en overleven alleen tot 7 dpf, wanneer de embryo's beginnen te vertrouwen op circulerend bloed voor oxygenatie. Omdat de morfogenese van het hart wordt aangedreven door zowel genetische als biomechanische krachten36, vertonen deze vissen hartmisvormingen rond 3 dpf.
Omdat de stroming van Ca2+ temperatuurgevoelig is, beïnvloedt de temperatuur de hartslag bij embryonale zebravissen21. Bijgevolg vertraagt het verlagen van de temperatuur in de beeldvormingskamer de hartslag. Het stoppen van de hartslag vereist temperaturen onder de 15 °C. Omdat zebravissen meestal op 28,5 °C worden gehouden, kunnen dergelijke lage temperaturen slechts gedurende korte perioden (minder dan 10 minuten) worden gehandhaafd.
Geneesmiddelen zoals chemische remmers van spiercontracties, 2,3-Bu-tanedione 2-monoxime (BDM), kunnen worden toegevoegd aan de zebravismedia (50 nM37,38) om de hartslag tijdelijk op te schorten. BDM is handig in gebruik omdat het hartcontractie in minder dan 15 minuten stopt en kan worden weggespoeld om de hartfunctie te herstellen. Omdat BDM echter het hartactiepotentiaal verandert, moet het met een waarschuwing worden gebruikt37.
Ten slotte kan het hart van transgene zebravissen die licht-gated ionkanalen of pompen zoals channelrhodopsine of halorhodopsine in hun myocard tot expressie brengen, worden gemanipuleerd en gestopt door de pacemaker bij het instroomkanaal te verlichten met licht39,7,40,41,9.
Vooruitzicht
De gepresenteerde geoptimaliseerde tools en oplossingen om het hart van de zebravis in vivo te bestuderen, maken langdurige, zachte beeldvorming van ultrasnelle hartdynamica mogelijk. De inbedding van het monster kan worden aangepast aan verschillende beeldvormingsmodaliteiten, zoals confocale microscopie, tweefotonenmicroscopie of optische projectietomografie (OPT). Lichtplaatmicroscopie is echter waarschijnlijk de voorkeurstechniek die optische sectie biedt met een snelheid die voldoende is om de dynamiek van het hart vast te leggen. Hoewel dit protocol zich richt op embryonale hartbeeldvorming van zebravissen, geloven we dat het ook kan worden toegepast op verschillende andere monsters en experimenten. Het zal interessant zijn om in de toekomst te zien of soortgelijke inbeddings- en beeldvormingstechnieken ook in latere stadia van de ontwikkeling kunnen worden gebruikt wanneer het hart meer verborgen is en de larve minder doorschijnend.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We bedanken Madelyn Neufeld voor de illustratie in figuur 2h. Dit werk werd ondersteund door de Max Planck Society, Morgridge Institute for Research, het Chan Zuckerberg Initiative en het Human Frontier Science Program (HFSP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5mL Eppendorf | Eppendorf | 22364111 | To carry embedded samples |
| 15mL Falcon tubes | Falcon | 352095 | To carry embedded samples |
| 50mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | 50ml tubes for sonication step, and storing cleaned, straightened FEP tubes |
| 50mL syringe | BD | 309654 | 50ml syringe for FEP cleaning |
| Agarose, low gelling temperature | Sigma Aldrich | 39346-81-1 | To make plug |
| Blunt Tip Needles, 21 gauge | VWR | 89500-304 | Blunt end needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
| Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K33 | Tubing for FEP tube straightening 9.5mm outer diameter, 5.6 inner diameter, 30cm long, other sizes available |
| Borosilicate glass tube | McMaster-Carr | 8729K31 | Tubing for FEP tube straightening 6.35mm outer diameter, 4mm inner diameter, 30cm long, other sizes available |
| Conventional needles, 21 Gauge | BD | 305165 | Conventional needle for 0.8 inner diameter FEP tube |
| Disposable glass pipette | Grainger | 52NK56 | To transfer fish, use with pipette pump |
| E3 medium for zebrafish embryos | |||
| Ethanol | Sigma Aldrich | 64-17-5 | Ethanol for FEP cleaning |
| FEP tube, 0.8 / 1.2 mm | ProLiquid | 2001048 | FEP tube with thin wall, other sizes available |
| FEP tube, 0.8 / 1.6 mm | Bola | S1815-04 | FEP tube with thick wall, other sizes available |
| FEP tube, 2/3mm | BGB | 211581 | Large FEP tube with thick wall, other sizes available |
| Hot Hand Rubber Mitt | Cole-Parmer | 691000 | To carry hot equipment after autoclaving |
| Omnifix 1mL Syringes | B Braun | 9161406V | 1ml syringe for embedding |
| Petri dish, small | Dot Scientific | PD-94050 | To make agarose plug |
| Pipette pumps | Argos Technologies | 04395-05 | To transfer fish, use with disposable glass pipette |
| PTU | Sigma Aldrich | 103-85-5 | Also known as: N-Phenylthiourea, 1-Phenyl-2-thiourea, Phenylthiocarbamide |
| Razor blades | Azpack | 11904325 | To cut FEP tubes |
| Sodium Hydroxide | Dot Scientific | DSS24000 | NaOH for FEP cleaning |
| Tricaine | Sigma Aldrich | E10521 | Also known as: MS-222, Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine |
References
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nature Biotechnology. 25 (2), 249-253 (2007).
- Jenielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. Journal of Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).
- Reynaud, E. G., Kržič, U., Greger, K., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage. Human Frontier Science Program Journal. 2 (5), 266-275 (2008).
- Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Current Opinion in Genetics & Development. 21 (5), 566-572 (2011).
- Mickoleit, M., et al. High-resolution reconstruction of the beating zebrafish heart. Nat Methods. 11 (9), 919-922 (2014).
- Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
- Trivedi, V., et al. Dynamic structure and protein expression of the live embryonic heart captured by 2-photon light sheet microscopy and retrospective registration. Biomed Optics Express. 6 (6), 2056-2066 (2015).
- Weber, M., et al. Cell-accurate optical mapping across the entire developing heart. eLife. Yelon, D. 6, 28307 (2017).
- Weber, M., Huisken, J. In vivo imaging of cardiac development and function in zebrafish using light sheet microscopy. Swiss Medical Weekly. 145, 14227 (2015).
- Fei, P., et al. Cardiac light-sheet fluorescent microscopy for multi-scale and rapid imaging of architecture and function. Science Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
- Felker, A., et al. Continuous addition of progenitors forms the cardiac ventricle in zebrafish. Nature Communication. 9 (1), 1-14 (2018).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), New York, NY. 1007-1009 (2004).
- Keller, P. J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Life sciences require the third dimension. Current Opinion in Cell Biology. 18 (1), 117-124 (2006).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer mounting for long-term light sheet microscopy of zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (84), e51119 (2014).
- Berndt, F., Shah, G., Power, R. M., Brugués, J., Huisken, J. Dynamic and non-contact 3D sample rotation for microscopy. Nature Communications. 9 (1), 1-7 (2018).
- Daetwyler, S., Günther, U., Modes, C. D., Harrington, K., Huisken, J. Multi-sample SPIM image acquisition, processing. and analysis of vascular growth in zebrafish. Development. , 173757 (2019).
- Keomanee-Dizon, K., Fraser, S. E., Truong, T. V. A versatile, multi-laser twin-microscope system for light-sheet imaging. Review of Scientific Instruments. 91 (5), 053703 (2020).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), Cambridge, England. 3242-3247 (2012).
- Gierten, J., et al. Automated high-throughput heartbeat quantification in medaka and zebrafish embryos under physiological conditions. Science Reports. 10 (1), 1-12 (2020).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved long-term imaging of embryos with genetically encoded α-bungarotoxin. PLOS ONE. 10 (8), 0134005-0134015 (2015).
- Taylor, J. M., et al. Adaptive prospective optical gating enables day-long 3D time-lapse imaging of the beating embryonic zebrafish heart. Nature Communication. 10 (1), 1-15 (2019).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Cold Spring Harbor. E3 medium (for zebrafish embryos). Cold Spring Harbor Protocols. 2011, 66449 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments. (27), e1113 (2009).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).
- FluoRender. , Available from: www.fluorender.com (2020).
- Jin, S. -W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. -N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132 (23), 5199-5209 (2005).
- Chi, N. C., et al. Foxn4 directly regulates tbx2b expression and atrioventricular canal formation. Genes and Development. 22 (6), 734-739 (2008).
- Scott, G. R., Johnston, I. A. Temperature during embryonic development has persistent effects on thermal acclimation capacity in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 14247-14252 (2012).
- Sehnert, A. J., et al. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nature Genetics. 31 (1), 106-110 (2002).
- Sidhwani, P., Yelon, D. Fluid forces shape the embryonic heart: Insights from zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. Wellik, D. M. 132, Academic Press. Chapter 11 395-416 (2019).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Chow, R. W. -Y., Lamperti, P., Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. following endocardial tissue movements via cell photoconversion in the zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments. (132), e57290 (2018).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proccedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Knollmann, B. C. Pacing lightly: optogenetics gets to the heart. Nature Methods. 7 (11), 889-891 (2010).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
