Lorsque les protéines précurseurs de la famille ß du facteur de croissance transformant sont exprimées ectopiquement dans les embryons de Xenopus laevis, elles se dimérisent, se clivent et sont sécrétées dans le blastocoele, qui commence à la fin de la blastula au stade précoce de gastrula. Nous décrivons une méthode d’aspiration des produits de clivage de la cavité blastocoèle pour l’analyse immunoblot.
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Article de méthode
Analyse du facteur de croissance transformant ß Produits de clivage de la famille sécrétés en blastocoèles d’embryons xenopus laevis
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les deux bras de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß), représentés respectivement par les ligands Tgfß/Nodal ou de la protéine morphogénétique osseuse (Bmp), jouent un rôle essentiel dans le développement embryonnaire et l’homéostasie adulte. Les membres de la famille Tgfß sont fabriqués comme des précurseurs inactifs qui dimérisent et se replient dans le réticulum endoplasmique. Le précurseur est ensuite clivé en fragments de ligand et de prodomaine. Bien que seul le ligand dimérique puisse engager les récepteurs Tgfß et activer la signalisation en aval, il est de plus en plus reconnu que la fraction prodomaine contribue à l’activité du ligand. Cet article décrit un protocole qui peut être utilisé pour identifier les produits de clivage générés lors de l’activation des protéines précurseurs de Tgfß. Les précurseurs de Tgfß codant pour l’ARN sont d’abord microinjectés dans les embryons de X. laevis. Le lendemain, les produits de clivage sont collectés à partir de la blastocoele d’embryons au stade gastrula et analysés sur des transferts Occidentaux. Ce protocole peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques.
Introduction
Les membres de la superfamille du facteur de croissance transformant ß (Tgfß) sont synthétisés sous forme de protéines précurseurs dimérisées inactives. Les précurseurs sont ensuite clivés par les membres de la famille des proprotéines convertases (PC), soit dans la voie sécrétoire, soit à l’extérieur des cellules. Cela crée un dimère de ligand actif lié au disulfure et deux fragments de prodomaine1. Bien que l’on sache depuis plus de 30 ans que le prodomaine des précurseurs de la famille Tgfß est nécessaire pour générer un ligand2actif, la compréhension de la façon dont les prodomaines contribuent à la fonction du ligan....
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Protocole
Toutes les procédures décrites sont approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de l’Utah. Les grenouilles sont hébergées dans une installation approuvée par l’IACUC. Les grenouilles mâles sont euthanasiées par immersion dans la tricaïne suivie d’une coupe du ventricule du cœur. Les grenouilles femelles sont hébergées dans le laboratoire pendant un maximum de 24 heures après l’induction hormonale du frai pour permettre la collecte des œufs, puis retournées à l’établissement de soins.
1. Collection de testicules X. laevis
- Anesthésier un mâle sexuellement mature dans 0,2% de Tricaine....
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Résultats
L’objectif de l’expérience décrit ci-dessous était de déterminer si Bmp4 et Bmp7 forment des hétérodimères (dimères composés d’un ligand Bmp4 et d’un ligand Bmp7), des homodimères (composés de deux ligands Bmp4 ou deux ligands Bmp7), ou un mélange de chacun lorsqu’ils sont co-exprimés dans X. laevis. Les données présentées à la figure 2 sont extraites d’une étude publiée précédemment10. La figure 2A est un schéma montrant les pro.......
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Discussion
Les principaux avantages du protocole décrit ici sont qu’il peut être complété relativement rapidement, ne nécessite pas de réactifs coûteux et fournit une source de produits de clivage Tgfß concentrés dans des conditions physiologiques. Un autre avantage est qu’il permet d’analyser les protéines marquées par épitope et de contourner ainsi la pénurie d’anticorps disponibles dans le commerce qui reconnaissent la plupart des prodomaines de la famille Tgfß. Bien qu’il soit également possible d’analyser le clivage des protéi.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Mary Sanchez pour les excellents soins aux animaux. La recherche des auteurs est soutenue par le National Institute of Child Health and Human Development des National Institutes of Health (NIH / NICHD) subventions R01HD067473-08 et R21 HD102668-01 et par le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK / NIH) subvention R01DK128068-01.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| ß ;-mercaptoéthanol | Fisher | AC125470100 | |
| Bleu de bromophénol | Fisher | B392-5 | |
| Chlorure de calcium | Fisher | C79-500 | |
| Nitrate de calcium | Fisher | C109-500 | |
| Pilon à granulés jetables/broyeur de mouchoirs | Fisher | 12-141-364 | |
| Dumont #5 pince | Fine Science tools | 11251-10 | |
| Sérum fœtal bovin | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| Ficoll 400 | Sigma Aldrich | F9378-500G | |
| Capillaire en verre, 1 X 90 mm | Narshige | G-1 | |
| Glycérol | Fisher | G33-4 | |
| HEPES | Fisher | BP310-500 | |
| Chorionique humaine gonadotrophine | Sigma Aldrich | CG10-10VL | |
| Seringue d’injection, 1 mL | Fisher 8881501368 | ||
| L-cystéine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Aiguille | Fisher | M63-500 | |
| , 26 g | 305111 | ||
| Pénicilline/Streptomycine | Gibco | 15140148 | |
| Picoliter Micro-injecteur | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Extracteur de pipette | Narashige | PC-100 | |
| Chlorure de potassium | Fisher | P217-500 | |
| Membrane PVDF | Sigma Aldrich | IPVH00010 | |
| Bicarbonate de sodium | Fisher | S233-500 | |
| Chlorure de sodium | Fisher | S271-10 | |
| Dodécylsulfate de sodium | Fisher | BP166-500 | |
| Hydroxyde de sodium | Fisher | S318-500 | |
| Tricaïne-S | Pentair | TRS5 | |
| Tris | Fisher | BP152-5 |
Références
- Harrison, C. A., Al-Musawi, S. L., Walton, K. L. Prodomains regulate the synthesis, extracellular localisation and activity of TGF-beta superfamily ligands. Growth Factors. 29 (5), 174-186 (2011).
- Gray, A. M., Mason, A. J.
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Réimpressions et autorisations
