Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

اثنين من الطبقات طريقة ساندويتش الغشاء لمجموعة اللعاب Laodelphax striatellus

Published: August 27, 2021 doi: 10.3791/62831
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2
1State Key Laboratory of Plant Genomics, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 2National Plant Gene Research Center, 3University of the Chinese Academy of Sciences

Summary

يصف البروتوكول الحالي طريقة لجمع ما يكفي من اللعاب من الحشرات المصة للثقب باستخدام وسيلة اصطناعية. هذه طريقة مريحة لجمع لعاب الحشرات ودراسة وظيفة اللعاب على سلوك تغذية الحشرات وانتقال الفيروس المنقول بالنواقل.

Abstract

ويعتمد فيروس الأرز الشريطي، الذي يسبب خسارة اقتصادية كبيرة للزراعة في شرق آسيا، اعتمادا كليا على ناقلات الحشرات لانتقاله الفعال بين الأرز المضيف. Laodelphax striatellus (زارع البني الصغير ، SBPH) هو ناقل الحشرات الرئيسي الذي ينقل أفقيا RSV أثناء امتصاص النسغ من phloem. يلعب اللعاب دورا مهما في سلوك تغذية الحشرات. يتم وصف طريقة مريحة من شأنها أن تكون مفيدة للبحث في لعاب الحشرات مع سلوك التغذية الثاقبة المص هنا. في هذه الطريقة ، سمح للحشرات بالتغذية على نظام غذائي اصطناعي يقع بين طبقتين من طبقات أفلام البارافين الممتدة. تم جمع النظام الغذائي الذي يحتوي على اللعاب كل يوم ، وتصفيته ، وتركيزه لمزيد من التحليل. وأخيرا، تم فحص نوعية اللعاب التي تم جمعها عن طريق تلطيخ البروتين والمناعة. وقد تجسدت هذه الطريقة من خلال الكشف عن وجود RSV وبروتين يشبه الموسين في لعاب SBPH. وستضع طريقة التغذية الاصطناعية وجمع اللعاب هذه أساسا لإجراء مزيد من البحوث حول العوامل في لعاب الحشرات المتعلقة بسلوك التغذية وانتقال الفيروس.

Introduction

فيروس شريط الأرز (RSV), فيروس الحمض النووي الريبي السلبية الذين تقطعت بهم السبل في جنس تينويvirus, يسبب أمراضا خطيرة في إنتاج الأرز في شرق آسيا1,2,3. ويعتمد انتقال فيروس RSV من نباتات الأرز المصابة إلى النباتات السليمة على ناقلات الحشرات، ولا سيما لاودلفاكس سترياتيلوس، التي تنقل RSV بطريقة مستمرة الانتشار. SBPH يكتسب الفيروس بعد التغذية على النباتات المصابة RSV. بمجرد دخول الحشرة ، تصيب RSV الخلية الظهارية الوسطى بعد يوم واحد من التغذية ثم تمر عبر حاجز منتصف الطريق لاختراق الهيموليم. في وقت لاحق، ينتشر RSV إلى أنسجة مختلفة عن طريق الهيموليم ثم ينتشر. بعد فترة كامنة من حوالي 10-14 يوما بعد الاستحواذ ، يمكن أن ينتقل الفيروس داخل الغدة اللعابية إلى النباتات المضيفة الصحية عن طريق اللعاب المفرز بينما تمتص SBPH النسغ من phloem4و5و6و7و8و9و10 . عملية التغذية الفعالة والعوامل المختلفة في اللعاب ضرورية لانتشار RSV من الحشرة إلى النبات المضيف.

ويعتقد أن لعاب الحشرات التي تفرزها الغدد اللعابية يتوسط الحشرات والفيروسات والنباتات المضيفة. عادة ما تنتج الحشرات الهميبتران نوعين من اللعاب: اللعاب الهلامي واللعاب المائي11،12،13. يفرز اللعاب Gelling أساسا في أبولازم للحفاظ على حركة الأناقة بين الخلايا المضيفة ويرتبط أيضا بالتغلب على مقاومة النبات والاستجابات المناعية14و15و16و17. في مرحلة التحقيق في التغذية ، تفرز الحشرات بشكل متقطع اللعاب الهلامي الذي يتأكسد على الفور لتشكيل شفة سطحية. ثم، أغماد واحدة أو متفرعة تغلف stylet لحجز قناة أنبوبي18،19،20. ويفترض أن شفة السطح على البشرة لتسهيل اختراق stylet من خلال العمل كنقطة مرساة، في حين أن الأغماد حول stylet قد توفر الاستقرار الميكانيكي والتشحيم16،21،22،23. تم تحديد Nlshp كبروتين أساسي لتشكيل غمد اللعاب والتغذية الناجحة للزارع البني(Nilaparvata lugens، BPH). تثبيط التعبير عن بروتين الغمد الهيكلي (SHP) الذي يفرزه pisum Acyrthosiphon المن قلل من تكاثره عن طريق تعطيل التغذية من أنابيب الغربالالمضيفة 24. وعلاوة على ذلك ، في بعض أنواع الحشرات ، من المفترض أن تؤدي عوامل اللعاب الهلامية إلى استجابات مناعية نباتية من خلال تشكيل ما يسمى بالأنماط الجزيئية المرتبطة بالحيوانات العاشبة (HAMPs). في N. lugens, NlMLP, بروتين يشبه الموسين المتعلقة بتشكيل غمد, يحفز الدفاعات النباتية ضد التغذية, بما في ذلك موت الخلية, التعبير عن الجينات المتعلقة بالدفاع, وترسب الشنق 25,26. أيضا ، وقد ثبت أن بعض عوامل اللعاب هلام في المن لتحريك استجابات الدفاع النباتية عن طريق التفاعلات بين الجينات إلى الجينات مماثلة للأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض12،15،27.

لدراسة عوامل اللعاب الأساسية لتغذية الحشرات و / أو انتقال مسببات الأمراض ، من الضروري تحليل اللعاب المفرز. هنا، يتم وصف طرق التغذية الاصطناعية وجمع للحصول على كميات كافية من اللعاب لمزيد من التحليل. باستخدام وسيط يحتوي على عنصر غذائي واحد فقط ، تم جمع العديد من بروتينات اللعاب وتحليلها عن طريق تلطيخ الفضة والنشاف الغربي. هذه الطريقة سوف تكون مفيدة في إجراء مزيد من البحوث على العوامل في اللعاب التي تعتبر ضرورية لانتقال RSV بواسطة SBPH.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. صيانة SBPH

  1. الخلفية viruliferous وRSV خالية من الأفراد SBPH في حاضنة الزجاج (65 × 200 ملم) مع الأرز 5-6(Oryza sativa cv. Nipponbare) الشتلات لكل غرفة زجاجية في المختبر. زراعة نباتات الأرز في 25 درجة مئوية تحت ضوء 16 ساعة / 8 ساعة photoperiod الظلام.
    ملاحظة: تم القبض في البداية على أفراد SBPH viruliferous وخالية من RSV في مقاطعة جيانغسو، الصين.
  2. الكشف عن RSV في SBPH عن طريق اختبار مناعة مرتبطة بالانزيم نقطة (نقطة ELISA) مع أرنب RSV محددة الأجسام المضادة متعددة النسيلة (انظر جدول المواد)التي أثيرت ضد ريبونوكليوبروتين RSV (RNPs).
    ملاحظة: لضمان كفاءة عالية للعدوى النسل، تم الحفاظ على الإناث viruliferous بشكل منفصل، و 15٪ من ذريتهم تم اختبارها عشوائيا لعدوى RSV. يتم وصف تفاصيل نقطة ELISA في الخطوات 1.3-1.7.
  3. تجانس SBPH واحد في 20 ميكرولتر من العازلة طلاء (0.05 M نا2CO3-NaHCO3، درجة الحموضة 9.5). بقعة 3 ميكرولتر من كل على غشاء النايلون (انظر جدول المواد)،ومن ثم تجفيف الغشاء في درجة حرارة الغرفة (RT).
  4. احتضان الغشاء مع 15 مل من العازلة حجب (PBS + 3٪ الحليب الخالي من الدسم) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة للأرنب الأولية المخففة ضد RSV (1:10000) في 15 مل من PBS لمدة 1 ساعة في RT وغسل الغشاء ثلاث مرات مع PBS لمدة 5 دقائق حضانة في كل مرة.
  6. احتضان الغشاء مع 1.5 ميكرولتر من الفجل peroxidase-المقترنة الأجسام المضادة للأرنب الماعز (انظر جدول المواد) في 15 مل من برنامج تلفزيوني وغسل ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق حضانة في كل مرة.
  7. تطوير اللوت المناعي مع تعزيز HRP-DAB Chromogenic كيت (انظر جدول المواد)وفقا للبروتوكولات التي تقدمها الشركة المصنعة.

2. إعداد غرفة التغذية والنظام الغذائي الاصطناعي

  1. تزن 2 غرام من مسحوق السكروز وحله في 40 مل من ddH2O لإعداد محلول مائي السكروز 5٪ كحمية اصطناعية.
  2. تصفية الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر (انظر جدول المواد) لإزالةالتلوث البكتيري والشوائب.
  3. تجويع 200 3rd-5 يرقات SBPH لمدة 3-5 ساعة قبل إدخالها إلى الغرفة.
    ملاحظة: 200 SBPH معدة لغرفة واحدة; وينبغي إعداد المزيد من SBPH لعدة غرف.
  4. إعداد اسطوانات الزجاج وغرف التغذية (الشكل 1A). قم بتغطية طرف مفتوح واحد من الغرفة بغشاء البارافين (انظر جدول المواد)قبل إدخال الحشرات التجريبية.
    ملاحظة: طول كل أسطوانة 15.0 سم وقطرها 2.5 سم. هذه الاسطوانات الزجاجية مصنوعة خصيصا وفقا لمتطلبات التجريبية.
  5. نقل الحشرات إلى اسطوانة زجاجية.
  6. تغطية الطرف الآخر من الغرفة مع غشاء البارافين امتدت (على وجه التحديد، بارا فيلم M). ثم، إضافة 200 ميكرولتر من النظام الغذائي الاصطناعي لذلك. وأخيرا، قم بتغطية السائل بطبقة أخرى من غشاء البارافين الممتد.
    ملاحظة: يمتد غشاء البارافين إلى حوالي ضعف مساحته الأصلية.
  7. تغطية الغرفة مع رقائق الألومنيوم، ولكن ترك نهاية مع جهاز النظام الغذائي الاصطناعي يتعرض للضوء.

3. مجموعة من اللعاب SBPH

  1. جمع النظام الغذائي الاصطناعي من RSV خالية وsBPH viruliferous بشكل منفصل في نهاية فترة 24 ساعة.
  2. تبريد الاسطوانة في 4 درجة مئوية لشل حركة الحشرات.
  3. كشف الفيلم الخارجي وجمع السائل النظام الغذائي الاصطناعي باستخدام ماصة معقمة في أنابيب معقمة 1.5 مل. احتفظ باللعاب الذي تم جمعه عند -80 درجة مئوية حتى التحليل.
    ملاحظة: يمكن تخزين اللعاب المجمع عند -80 درجة مئوية لمدة عام واحد.
  4. شطف الغشاء الداخلي مع 50 ميكرولتر من النظام الغذائي الاصطناعي الطازج ثلاث مرات عن طريق pipetting بهدوء، وجمع النظام الغذائي الغسيل الاصطناعي على النحو المبين في الخطوة 3.3. وضع النظام الغذائي الاصطناعي الجديد على الغشاء الداخلي والحفاظ على غشاء البارافين امتدت حديثا على القمة.
  5. كرر الخطوتين 3.2 و3.3 لمدة 5 أيام إلى أسبوعين.
    ملاحظة: عد معدل البقاء على قيد الحياة من SBPH التغذية الاصطناعية وضمان تكملة كافية من SBPH الطازجة وفقا لمعدل البقاء على قيد الحياة.
  6. تصفية العينات التي تم جمعها من خلال وحدة تصفية 0.22 ميكرومتر لإزالة الميكروبات والملوثات الأخرى.

4. تركيز اللعاب التي تم جمعها

  1. نقل عينات اللعاب التي تم جمعها في مرشح الطرد المركزي 0.5 مل 10 كد (انظر جدول المواد) وتدور في 5500 × ز في 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. جمع supernatant وجعل حجم النهائي إلى 100 ميكرولتر.
  2. قياس تركيز اللعاب التي تم جمعها باستخدام الطيف المناسب للأشعة فوق البنفسجية فيس باتباع الخطوات 4.3-4.6.
  3. قم بتشغيل مقياس الطيف واغسل الطيات ثلاث مرات باستخدام ddH2O.
  4. حدد الخيارات التالية على الشاشة بالترتيب الصحيح: البروتينات | بروتين A280 | تحديد نوع | 1 عبس = 1 ملغم/ مل. ثم حدد خانة الاختيار تصحيح خط الأساس 340 نانومتر.
  5. تحميل 2 ميكرولتر من محلول مائي السكروز 5٪ كما فارغة، لمس فارغة في الجزء السفلي من الشاشة.
  6. بعد وضع المعايير، تحميل 2 ميكرولتر من اللعاب التي تم جمعها للقياس. قراءة وتسجيل تركيز البروتين.
    ملاحظة: تم جمع 1 ملغ من بروتينات اللعاب في النهاية في المجموع على الأقل.

5. تلطيخ الفضة من بروتينات اللعاب

  1. استخراج البروتين من عينات لعاب الحشرات باستخدام عينة تحميل العازلة (50 mM تريس-HCl الرقم الحموضة 6.8، 10٪ الجلسرين، 2٪ SDS، 0.1٪ بروموفينول الأزرق، و 1٪ β ميركابتوفانول). ثم، تجزئة بنسبة 10٪ SDS-PAGE (انظر جدول المواد). تحميل محلول sucroseaqueous 5٪ تعامل بنفس الطريقة التي تحكم سلبي.
  2. تحميل aliquot 20 μL من العينة على هلام SDS-PAGE جنبا إلى جنب مع علامة ملطخة مسبقا. تشغيل هلام لمدة 15 دقيقة في 90 فولت، ومن ثم 50 دقيقة في 140 فولت.
  3. إصلاح هلام في 30٪ (فول / فول) الإيثانول، 10٪ (فول / فول) حمض الخليك لمدة 30 دقيقة على الأقل بعد الكهربائي.
  4. شطف الجل مرتين مع 20٪ (فول / فول) الإيثانول والماء بشكل منفصل لمدة 10 دقيقة في كل مرة.
  5. توعية هلام في 0.8 مليون ثيوسلفات الصوديوم لمدة 1 دقيقة، ثم شطف مرتين في الماء لمدة 1 دقيقة في كل مرة.
  6. تزج الجل في نترات الفضة 12 mM لمدة ساعة واحدة على الأقل، ومن ثم تراجع في الماء deionized لمدة 10 ق قبل نقله إلى حل المطور.
  7. عندما الخلفية من هلام هو الحصول على الظلام، تزج هلام في حل وقف (5٪ حمض الخليك) لمدة 30 دقيقة على الأقل لوقف رد الفعل.
  8. يغسل الجل مرتين بالماء لمدة 30 دقيقة في كل مرة. تطوير الصورة باستخدام نظام الكشف (انظر جدول المواد).

6. الكشف عن البروتين عن طريق النشاف الغربية

  1. الكشف عن البروتين مثل اللعاب الموسين من SBPH (LssgMP) و RSV عن طريق البقع الغربية باستخدام أجسام مضادة محددة، على التوالي.
  2. علاج عينات لعاب الحشرات بعد الخطوة 5.1.
  3. تحميل 20 μL aliquot من العينة على هلام SDS-PAGE 10٪ جنبا إلى جنب مع علامة ملطخة مسبقا و20 ميكرولتر RSV عينة اللعاب غير المصابة كسيطرة سلبية. تشغيل هلام لمدة 15 دقيقة في 90 فولت، ومن ثم لمدة 50 دقيقة في 140 فولت.
  4. مزيج 100 مل من 10x نقل البروتين العازلة (الرطب) (انظر جدول المواد)مع 900 مل من DDH2O إلى حل العمل (1x)، ومن ثم نقل البروتينات إلى غشاء ثنائي فلوريد polyvinylidene باستخدام العازلة نقل البروتين (1x).
  5. كتلة الغشاء في الحليب الخالي من الدسم 5٪ مع 0.01 M تريس العازلة المالحة مع 0.05٪ توين 20 (TBST) في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، امزج 100 مل من TBST 10x (راجع جدول المواد)مع 900 مل من ddH2O في حل العمل.
  6. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة أرنب الأولية ضد RSV أو LssgMP (كلاهما 1:10000) المخفف في TBST في RT لمدة 2 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: ذكر أعلاه إنتاج الأجسام المضادة الأولية ضد RSV. أنتجت شركة التكنولوجيا الحيوية الأرانب المضادة للLssgMP الأجسام المضادة للنسيلة ضد الببتيد LssgMP GIQFDSYSASDLTRC.
  7. غسل الغشاء ثلاث مرات مع TBST لمدة 10 دقيقة من الحضانة في كل مرة.
  8. احتضان الغشاء مع الفجل peroxidase المقترنة الماعز المضادة للأرانب الأجسام المضادة المخففة في TBST 1:10000.
  9. تطوير اللوتات المناعية مع نظام الكشف عن البقع الغربية المحسنة.

7. الكشف عن نمط التعبير LssgMP في SBPH

  1. شل حركة الحشرات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  2. غسل الحشرات مع 75٪ الإيثانول وDDH2O واحدا تلو الآخر، ومن ثم تشريح الحشرات في TBS المبردة مسبقا (0.01 M تريس العازلة المالحة).
  3. تشريح الحشرات من البطن أثناء قطع الساقين من SBPH في المفصل كوكسا-trochanter بواسطة ملقط; غسل midgut والغدد اللعابية مرتين في TBS لإزالة أي تلوث من hemolymph.
  4. وضع خمسة أنسجة في أنبوب 1.5 مل RNase خالية لاستخراج الحمض النووي الريبي. النظر في كل أنبوب كعينة واحدة.
  5. تنفيذ استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة وعكس النسخ PCR (RT-PCR) (انظر جدول المواد).
  6. أداء الكم في الوقت الحقيقي PCR (qRT-PCR) للتحقيق في مستويات التعبير عن نسخة نسبية من LssgMP في مقتطفات من الجسم كله أو أنسجة مختلفة من L. striatellus.
    ملاحظة: كانت أزواج التمهيدي المستخدمة في تضخيم الجينات LssgMP-q-F/LssgMP-q-R،تم إجراء QPCR المستندة إلى SYBR Green وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم تحديد مستوى النص ل. striatellus الترجمة معامل استطالة 2 (ef2) مع زوج التمهيدي ef2-q-F/ef2-q-R لتطبيع قوالب cDNA. وترد أدناه تسلسل التمهيدي:LssgMP-q-F: TCCGACCTCACCAGAGTTTACAG; LssgMP-q-R: GCTTCGTCGGGTACTGATTCC; EF2-q-F: GTCTCCACGGGGGCTTT; EF2-q-R: ATCTTGAATTTCTCGGCATACATTT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تخطيطات تركيب التغذية الاصطناعية وجمع اللعاب
يصور الشكل 1A الأسطوانة الزجاجية (15 سم × 2.5 سم) المستخدمة كغرفة تغذية لجمع اللعاب. أولا ، تم تجويع يرقات SBPH لعدة ساعات لتحسين كفاءة جمع ثم شلت عن طريق تقشعر لها الأبدان لمدة 5 دقائق. بعد نقل الحشرات إلى الأسطوانة الزجاجية ، تم تغطية طرفي الغرفة المفتوحين بغشاء البارافين الممتد. في نهاية واحدة، 200 ميكرولتر من 5٪ السكروز تقع بين طبقتين من غشاء البارافين امتدت إلى حوالي ضعف مساحتها الأصلية(الشكل 1B). كانت الغرفة مغطاة بورق، ولكن النهاية مع النظام الغذائي الاصطناعي تعرضت للضوء. لأن SBPH يعرض السلوك الضوئي ، تعرضت الحشرات الجائعة التي تجمعت في النهاية للضوء وتغذيتها على محلول النظام الغذائي الاصطناعي من خلال غشاء البارافين الداخلي الممتد. وبناء على ذلك ، يمكن إطلاق اللعاب في النظام الغذائي الاصطناعي ، الذي يتم جمعه كل يوم. تم استبدال جهاز بارا فيلم حمية مع واحد جديد كل يوم. وبهذه الطريقة، تم جمع النظام الغذائي الاصطناعي لمدة 5 أيام إلى أسبوعين، ومن ثم تركزت العينة بأكملها إلى حجم نهائي قدره 100 ميكرولتر باستخدام فلتر طرد مركزي 10 KD (الشكل 1C). خلال جمع اللعاب ، تم احتساب معدل البقاء على قيد الحياة من SBPH تغذية السكروز 5 ٪. في أول 4 أيام، نجا أكثر من 80٪ SBPH. ومع ذلك ، من اليومالخامس فصاعدا ، زادت الوفيات بسرعة إلى 40 ٪ ، وأقل من نصف SBPH نجا في اليوم7 (الشكل 1D). لجمع ما يكفي من اللعاب، واقترح SBPH الطازجة لتوريد في اليوم4.

التحقق من بروتينات اللعاب التي تم جمعها
لتقييم فعالية طريقة التجميع هذه ، خضعت عينة اللعاب لتحليل البروتين. أولا، تم فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE، ثم تم اكتشافها عن طريق تلطيخ الفضة(الشكل 2A). بالمقارنة مع السيطرة السلبية (5٪ السكروز)، عينات اللعاب المركزة من اللعاب SBPH المصابة RSV تحتوي على العديد من البروتينات التي يمكن تحليلها أكثر، على سبيل المثال، عن طريق قياس الطيف الكتلي. باعتبارها ناقل الحشرات الرئيسي من RSV ، ينقل SBPH الفيروس إلى النباتات عبر عملية التغذية الثاقبة. يرتبط الإطلاق الناجح ل RSV بإفراز اللعاب ، ويعتبر RSV عاملا أساسيا في لعاب الحشرات الفيروسية. هنا ، تم اختبار اللعاب بعد جمع الحشرات غير المصابة والفيروليفيروس مع الأجسام المضادة ضد RSV واكتشفت بنجاح بروتين معطف RSV (CP) في العينة viruliferous(الشكل 2B). وجدت دراسة أخرى أن بروتينات الموسين هي بروتينات لعاب هلام أساسية في الحشرات الهميبتران للتأمل في تكوين غمد لإطعام23. لتأكيد أن SBPH تنتج أيضا بروتين الموسين، تم تضخيم إطار القراءة المفتوحة كله من الجين المفترض ترميز الموسين من الحمض النووي الريبي المستخرجة من الغدة اللعابية من SBPH. تم استخدام تسلسله واستعلام في تحليلات BLAST مقابل تسلسل الجينوم SBPH28. تم التعرف على جين يتكون من 2175 نقطة أساس، اسمه LssgMP. تم إعداد الأجسام المضادة ضد هذا البروتين سابقا واستخدمت للكشف عن البروتين في العينة التي تم جمعها عن طريق تحليل لطخة الغربية. تم الكشف عن بروتين 78 دينار كويت في عينات غير مصابة و viruliferous، مما يدل على أن LssgMP هو بروتين اللعاب(الشكل 2C). بعد ذلك ، تم تحديد مستويات نسخة LssgMP في أنسجة مختلفة (الغدة اللعابية والأمعاء والجسم المتبقي) بواسطة qRT-PCR. وأظهرت النتائج أن مستوى النص الجيني كان أعلى 20 مرة في الغدة اللعابية مما كانت عليه في الأمعاء وأجزاء الجسم الأخرى(الشكل 2D)،مما يؤكد التعبير المحدد عن LssgMP في الغدة اللعابية.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لغرفة التغذية مع ساندويتش غشاء البارافين للسماح بتغذية SBPH على النظام الغذائي الاصطناعي. (A) التوضيح لغرفة التغذية الاصطناعية. يبلغ طول الأسطوانة 15.0 سم وقطرها 2.5 سم. في نهاية واحدة من الغرفة هو ساندويتش غشاء البارافين. الطرف الآخر وجدار الاسطوانة مغطاة بورق رقائق القصدير (خطوط مائلة) تمثل الجهاز المغطى بورق رقائق القصدير. تم تعيين مصدر الضوء لجذب SBPH لتغذية على النظام الغذائي الاصطناعي. (ب) رسم بياني من ساندويتش البارافين التي تحتوي على نظام غذائي اصطناعي. 200 ميكرولتر من محلول مائي السكروز 5٪ كان يقع بين طبقتين من أغشية البارافين امتدت إلى حوالي ضعف مساحتها الأصلية. (ج)تركيز اللعاب المجمع باستخدام فلتر طرد مركزي 10 KD. (د) معدل بقاء SBPH تغذية على السكروز 5٪. تم حساب المتوسط و SEM من أربع نسخ بيولوجية متماثلة مع ثلاث نسخ متماثلة تقنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحقق من بروتينات اللعاب التي تم جمعها. أ)كشف بروتينات اللعاب عن طريق تلطيخ الفضة. السكروز 5٪ هو السيطرة السلبية. (ب) الكشف عن بروتين معطف فيروس شريط الأرز (CP) في اللعاب الذي تم جمعه عن طريق تحليل البقع الغربية. (ج) النشاف الغربي لتأكيد وجود LssgMP في اللعاب التي تم جمعها. (د) تعبير محدد من LssgMP في الغدة اللعابية من L. striatellus. ef2: الترجمة معامل استطالة 2 من SBPH. تم حساب المتوسط و SEM من أربع نسخ بيولوجية متماثلة مع ثلاث نسخ متماثلة تقنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم الإبلاغ عن نجاح تربية الحشرات على الوجبات الغذائية الاصطناعية لأول مرة في عام 1962 عندما وصف ميتلر وداد تقنية غشاء البارافين لعقد نظام غذائي اصطناعي29،30. وقد تم استكشاف هذه الطريقة في العديد من جوانب بيولوجيا الحشرات وسلوكها ، على سبيل المثال ، الملحق الغذائي ، تغذية dsRNA ، واكتساب الفيروس. بناء على متطلبات تحليل اللعاب ، يستخدم 5٪ سكروز كغذاء اصطناعي عام لجمع لعاب SBPH في هذه الدراسة. لجمع اللعاب الناجح ، تجدر الإشارة إلى العديد من الخطوات الهامة هنا. أولا ، تجويع الحشرات التجريبية قبل إدخالها إلى الغرفة ضروري لضمان كفاءة جمع اللعاب. ثانيا، لتقليد البيئة stylet، يتم إجراء شطيرة البارافين طبقتين. عندما يتغذى SBPH على النظام الغذائي الاصطناعي ، يتشكل الغمد اللعابي في الطرف الداخلي الذي يواجه النظام الغذائي ، ويتم إفراز اللعاب المائي لاحقا. ثالثا، ينبغي جمع وسيلة اصطناعية وتبادلها في الوقت المناسب للحد من التلوث الميكروبي في العينة التي تم جمعها. وأخيرا ، فإن تخدير الحشرات عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق أمر ضروري لتجنب فقدان الحشرات مع تغيير النظام الغذائي الاصطناعي.

وعلى النقيض من معظم الوجبات الغذائية الاصطناعية التي تحتوي على الأحماض الأمينية والفيتامينات والكربوهيدرات، ومزايا 5٪ السكروز المتوسطة جديرة بالملاحظة. أولا، من السهل التحضير. ثانيا، التركيب البسيط للنظام الغذائي يعني القليل من المواد للتدخل في مزيد من التحليل لمختلف العوامل في اللعاب. ومع ذلك، انخفضت نسبة البقاء على قيد الحياة من SBPH في الأيام الأخيرة من فترة التغذية باستخدام السكروز 5٪ كغذاء اصطناعي عام(الشكل 1D). للتغلب على هذا الخلل، وينبغي توفير SBPH جديدة في الوقت المناسب لسيل اللعاب بما فيه الكفاية. ولمزيد من البحث في وظيفة اللعاب على سلوك التغذية أو انتقال الفيروس ، يجب أن تقتصر مدة جمع اللعاب على الوقت الدقيق قبل زيادة وفيات الحشرات بسبب نقص التغذية. ويبدو أن القيد المشترك للوسط الاصطناعي. ووجدت بعض الدراسات الأخرى أن بقاء ن. لوغنز التي تربى على النظام الغذائي المحدد كيميائيا D-97 كان أدنى من تلك التي أثيرت على مجموعة متنوعة من الأرز المعرضة TN1، مما يعني أن المضيف الأصلي يوفر أكثر من مجرد حشرات ناقلة للأغذية. وركزت العديد من الدراسات على تحسين الوجبات الغذائية المحددة كيميائيا للتغذية المستمرة للحشرات لتحسين كفاءة التربية.

تحليل النسخ من الغدة اللعابية هو طريقة تقليدية لتحديد البروتين اللعاب. وتم اكتشاف بروتينات لعاب مختلفة في نفس النوع من أ. pisum و M. persicae14،31، ووفرة بروتينات اللعاب تحدد تواتر اكتشافها32. ومع ذلك ، كانت هناك طريقة صالحة للتحقيق في البروتين المشتبه به في اللعاب. توفر طريقة ساندويتش غشاء البارافين هذه طريقة مبتكرة لتأكيد بروتين اللعاب المشتبه به الذي تم تحديده من خلال تحليل النسخ ، والذي ثبت أيضا من خلال الكشف عن LssgMP(الشكل 2C). وعلاوة على ذلك، أكد تحليل البروتين أن البروتينات الوفيرة موجودة في اللعاب المجمع(الشكل 2A)،وهي كمية كافية لإجراء مزيد من التحليل من خلال قياس الطيف الكتلي على سبيل المثال. تحليل البروتيوميكس من اللعاب التي تم جمعها سيكون وسيلة مباشرة وفعالة لتحديد العوامل المفرزة المشاركة في مرحلة التغذية من SBPH، والحد من خطر الكشف عن البروتينات الزائدة كاذبة إيجابية.

اللعاب يعمل الناقل للفيروس من الحشرات لاستضافة النباتات وهو عنصر أساسي للتفاعل بين ناقلات الفيروسات والنبات14،33،34. إن تأليه الفيروس المنبعث من ناقلات الحشرات هو عامل حاسم للعدوى إلى المضيف. بالمقارنة مع الطرق غير المباشرة التي تختبر التيتر الفيروسي في النباتات المصابة ، يمكن لهذا البروتوكول الكشف مباشرة عن RSV الصادرة عن SBPH viruliferous (الشكل 2B). بدعم من طريقة ساندويتش غشاء البارافين هذه ، قد تكشف التحليلات المقارنة الإضافية لبروتينات اللعاب التي تم جمعها من الحشرات الخالية من RSV والمصابة ب RSV أيضا عن مرشحين محتملين يشاركون في التفاعل بين الفيروس والنبات والنواقل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس بينهما تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وقد دعم هذا العمل البرنامج الوطني الصيني للبحوث والتطوير (رقم 2019YFC1200503)، والمؤسسة الوطنية الصينية للعلوم (رقم 32072385)، وجمعية تشجيع الابتكار الشبابي CAS (2021084).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10-KD centrifugal filter Merck Millipore R5PA83496 For concentration
10x Protein Transfer Buffer(wet) macGENE MP008 Transfer buffer for western blotting
10x TBST buffer Coolaber SL1328-500mL×10 Wash buffer for western blotting
Azure c600 biosystems Azure Biosystems Azure c600 Imaging system for western blotting and silver staining
Color Prestained protein ladder GenStar M221-01 Protein marker for western blotting
ECL western blotting detection reagents GE Healthcare RPN2209 Western blotting detection
Enchanced HRP-DAB Chromogenic Kit TIANGEN #PA110 Chromogenic reaction
Horseradish peroxidase-conjugated goat anti-rabbit antibodies Sigma 401393-2ML Polyclonal secondary antibody for western blotting
Immobilon(R)-P Polyvinylidene difluoride membrane Merck Millipore IPVH00010 Transfer membrane for western blotting
iTaq Universal SYBR Green Supermix Bio-Rad 1725125 For quantitative real-time PCR (qRT-PCR)
KIT,iSCRIPT cDNA SYNTHES Bio-Rad 1708891 For Reverse-transcriptional PCR (RT-PCR)
Millex-GP Filter, 0.22 µm Merck Millipore SLGP033RB For filtration
Mini-PROTEAB TGX Gels Bio-Rad 4561043 For SDS-PAGE
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONEC-W Detection of protein concentration
Nylon membrane PALL T42754 Membrane for dot-ELISA
Parafilm M Membrane Sigma P7793-1EA Making artifical diet sandwichs
Rabbit anti-LssgMP polyclonal antibody against LssgMP peptides Genstript Rabbit primary anti-LssgMP polyclonal antibody for western blotting
Rabbit anti-RSV polyclonal antibody Genstript Rabbit primary anti-RSV polyclonal antibody for western blotting and dot-ELISA
RNAprep pure Micro Kit TIANGEN DP420 For RNA Extraction

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheng, X., Zhu, L., He, G. Towards understanding of molecular interactions between rice and the brown planthopper. Molecular Plant. 6 (3), 621-634 (2013).
  2. Cho, W. K., Lian, S., Kim, S. M., Park, S. H., Kim, K. H. Current insights into research on Rice Stripe Virus. The Plant Pathology Journal. 29 (3), 223-233 (2013).
  3. He, M., Guan, S. Y., He, C. Q. Evolution of rice stripe virus. Molecular Phylogenetics and Evolution. 109, 343-350 (2017).
  4. Wu, W., et al. Nonstructural protein NS4 of Rice Stripe Virus plays a critical role in viral spread in the body of vector insects. PLoS One. 9 (2), 88636 (2014).
  5. Huo, Y., et al. Transovarial transmission of a plant virus is mediated by vitellogenin of its insect vector. PLoS Pathogens. 10 (3), 1003949 (2014).
  6. Taning, C. N., Andrade, E. C., Hunter, W. B., Christiaens, O., Smagghe, G. Asian citrus psyllid RNAi pathway-RNAi evidence. Scientific Reports. 6, 38082 (2016).
  7. Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).
  8. Huo, Y., et al. Artificial feeding Rice Stripe Virus enables efficient virus infection of Laodelphax striatellus. Journal of Virological Methods. 235, 139-143 (2016).
  9. Huo, Y., et al. Insect tissue-specific vitellogenin facilitates transmission of plant virus. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006909 (2018).
  10. Huo, Y., et al. Rice Stripe Virus hitchhikes the vector insect vitellogenin ligand-receptor pathway for ovary entry. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374, 20180312 (2019).
  11. Bao, Y. Y., et al. De novo intestine-specific transcriptome of the brown planthopper Nilaparvata lugens revealed potential functions in digestion, detoxification and immune response. Genomics. 99 (4), 256-264 (2012).
  12. Elzinga, D. A., Jander, G. The role of protein effectors in plant-aphid interactions. Current Opinion In Plant Biology. 16 (4), 451-456 (2013).
  13. Chung, S. H., et al. Herbivore exploits orally secreted bacteria to suppress plant defenses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 15728-15733 (2013).
  14. Bos, J. I., et al. A functional genomics approach identifies candidate effectors from the aphid species Myzus persicae (green peach aphid). PLoS Genetics. 6 (11), 1001216 (2010).
  15. Liu, X., Zhou, H., Zhao, J., Hua, H., He, Y. Identification of the secreted watery saliva proteins of the rice brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål) by transcriptome and Shotgun LC-MS/MS approach. Journal of Insect Physiology. 89, 60-69 (2016).
  16. Cao, T. T., Lü, J., Lou, Y. G., Cheng, J. A. Feeding-induced interactions between two rice planthoppers, Nilaparvata lugens and Sogatella furcifera (Hemiptera: Delphacidae): effects on feeding and honeydew excretion. Environmental Entomology. 42 (6), 1281-1291 (2013).
  17. De Vos, M., Jander, G. Myzus persicae (green peach aphid) salivary components induce defence responses in Arabidopsis thaliana. Plant, Cell & Environment. 32 (11), 1548-1560 (2009).
  18. Wang, L., et al. Understanding the immune system architecture and transcriptome responses to southern rice black-streaked dwarf virus in Sogatella furcifera. Scientific Reports. 6, 36254 (2016).
  19. Wang, Y., et al. Penetration into rice tissues by brown planthopper and fine structure of the salivary sheaths. Entomologia Experimentalis et Applicata. 129 (3), 295-307 (2008).
  20. Wang, W., et al. Armet is an effector protein mediating aphid-plant interactions. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 29 (5), 2032-2045 (2015).
  21. Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z., Briggs, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (24), 8919-8924 (2014).
  22. Ma, R., Chen, J. L., Cheng, D. F., Sun, J. R. Activation of defense mechanism in wheat by polyphenol oxidase from aphid saliva. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58 (4), 2410-2418 (2010).
  23. Zheng, L., Seon, Y. J., McHugh, J., Papagerakis, S., Papagerakis, P. Clock genes show circadian rhythms in salivary glands. Journal of Dental Research. 91 (8), 783-788 (2012).
  24. Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species. Journal of Proteomics. 172, 25-35 (2018).
  25. Huang, H. J., Liu, C. W., Xu, H. J., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. Mucin-like protein, a saliva component involved in brown planthopper virulence and host adaptation. Journal of Insect Physiology. 98, 223-230 (2017).
  26. Shangguan, X., et al. A mucin-like protein of planthopper is required for feeding and induces immunity response in plants. Plant Physiology. 176 (1), 552-565 (2018).
  27. Petrova, A., Smith, C. M. Immunodetection of a brown planthopper (Nilaparvata lugens Stål) salivary catalase-like protein into tissues of rice, Oryza sativa. Insect Molecular Biology. 23 (1), 13-25 (2014).
  28. Zhu, J., et al. Genome sequence of the small brown planthopper, Laodelphax striatellus. GigaScience. 6 (12), 1-12 (2017).
  29. Van Bel, A. J., Will, T. Functional evaluation of proteins in watery and gel saliva of aphids. Frontiers In Plant Science. 7, 1840 (2016).
  30. Perez-Vilar, J., Hill, R. L. The structure and assembly of secreted mucins. The Journal of Biological Chemistry. 274 (45), 31751-31754 (1999).
  31. Pitino, M., Hogenhout, S. A. Aphid protein effectors promote aphid colonization in a plant species-specific manner. Molecular Plant-Microbe Interactions: MPMI. 26 (1), 130-139 (2013).
  32. Zhang, F., Zhu, L., He, G. Differential gene expression in response to brown planthopper feeding in rice. Journal of Plant Physiology. 161 (1), 53-62 (2004).
  33. Hogenhout, S. A., Ammar, E. -D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
  34. Boissot, N., Schoeny, A., Vanlerberghe-Masutti, F. Vat, an amazing gene conferring resistance to aphids and viruses they carry: from molecular structure to field effects. Frontiers In Plant Science. 7, 1420 (2016).

Tags

علم الأحياء، العدد 174،
اثنين من الطبقات طريقة ساندويتش الغشاء لمجموعة <em>اللعاب Laodelphax striatellus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, … More

Zhao, J., Yang, J., Zhang, L., Fang, R., Huo, Y. Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection. J. Vis. Exp. (174), e62831, doi:10.3791/62831 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter