Tijd-opgeloste Förster Resonantie Energie Transfer Assays voor meting van endogene gefosforyleerde STAT-eiwitten in menselijke cellen

Summary

Tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht cel-gebaseerde assay protocollen worden beschreven voor de eenvoudige, specifieke, gevoelige en robuuste kwantificering van endogene gefosforyleerde signaal transducer en activator van transcriptie (STAT) 1/3/4/5/6 eiwitten in cellysaten in een 384-well formaat.

Abstract

De Janus kinase (JAK)/signaaltransducer en activator of transcription (STAT) signaleringsroute speelt een cruciale rol bij het bemiddelen van cellulaire reacties op cytokines en groeifactoren. STAT-eiwitten worden geactiveerd door tyrosinefosforylering die voornamelijk wordt gemedieerd door JAKs. De abnormale activering van STAT-signaalroutes is betrokken bij veel menselijke ziekten, met name kanker en immuungerelateerde aandoeningen. Daarom is het vermogen om STAT-eiwitfosforylatie binnen de inheemse celsignaleringsomgeving te volgen belangrijk voor zowel academisch als geneesmiddelenontdekkingsonderzoek. De traditionele assayformaten die beschikbaar zijn om gefosforyleerde STAT-eiwitten te kwantificeren, omvatten western blotting en de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Deze heterogene methoden zijn arbeidsintensief, low-throughput en vaak niet betrouwbaar (specifiek) in het geval van western blotting. Homogene (no-wash) methoden zijn beschikbaar, maar blijven duur.

Hier worden gedetailleerde protocollen verstrekt voor de gevoelige, robuuste en kosteneffectieve meting in een 384-well-formaat van endogene niveaus van gefosforyleerde STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694 / Y699) en STAT6 (Y641) in cellysaten van adherente of suspensiecellen met behulp van het nieuwe THUNDER time-resolved Förster resonance energy transfer (TR-FRET) -platform. De workflow voor de cellulaire test is eenvoudig, snel en ontworpen voor high-throughput screening (HTS). Het testprotocol is flexibel, maakt gebruik van een monster met een laag volume (15 μL), vereist slechts één reagenstoevoegingsstap en kan worden aangepast aan toepassingen met een lage doorvoer en een hoge doorvoer. Elke fosfo-STAT sandwich immunoassay wordt gevalideerd onder geoptimaliseerde omstandigheden met bekende agonisten en remmers en genereert de verwachte farmacologie en Z'-factor waarden. Omdat TR-FRET-assays ratiometrisch zijn en geen wasstappen vereisen, bieden ze een veel betere reproduceerbaarheid dan traditionele benaderingen. Samen biedt deze reeks assays nieuwe kosteneffectieve hulpmiddelen voor een uitgebreidere analyse van specifieke gefosforyleerde STAT-eiwitten na celbehandeling en de screening en karakterisering van specifieke en selectieve modulatoren van de JAK / STAT-signaleringsroute.

Introduction

De JAK/STAT-signaleringsroute speelt een sleutelrol bij het bemiddelen van cellulaire reacties op diverse cytokines, interferonen, groeifactoren en gerelateerde ^moleculen1,2. De binding van deze liganden aan specifieke celoppervlakreceptoren resulteert in de activering van JAKs, die op hun beurt STAT-eiwitten activeren door fosforylering van specifieke tyrosineresiduen. STAT-fosforylering resulteert in hun dimerisatie en translocatie in de kern, waar ze hun effect uitoefenen op de transcriptie van gereguleerde doelgenen. De STAT-familie bestaat uit zeven leden: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b en STAT6. De leden spelen een complexe en essentiële rol in de regulatie van fysiologische celprocessen, waaronder proliferatie, differentiatie, apoptose, angiogenese en regulatie van het immuunsysteem. De abnormale activering van STAT-signaalroutes is betrokken bij veel menselijke ziekten, met name kanker en immuungerelateerde ^{aandoeningen3,4}. Daarom is het vermogen om STAT-eiwitfosforylatie binnen de inheemse celsignaleringsomgeving te beoordelen belangrijk voor zowel academisch als geneesmiddelenontdekkingsonderzoek.

Tot op heden zijn de conventionele methoden die worden gebruikt om intracellulaire gefosforyleerde eiwitniveaus te meten, inclusief STATs, gebaseerd op antilichamen en omvatten western blotting, ELISA en fosfoflowcytometrie. Deze heterogene methoden zijn arbeidsintensief, tijdrovend, foutgevoelig, lage doorvoer en vaak onbetrouwbaar (bijv. Specificiteitsproblemen) in het geval van western ^blotting5. Homogene assays vereisen daarentegen minder experimentele stappen, gebruiken kleinere steekproefvolumes en zijn vatbaar voor HTS. Er zijn vijf homogene celgebaseerde immunoassayplatforms in de handel beschikbaar die kunnen worden gebruikt om JAK-afhankelijke fosforylering van STATs in cellysaten kwantitatief te monitoren: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen en Lumit. Elk van deze platforms heeft zijn voor- en nadelen.

SureFire is gebaseerd op luminescente zuurstof channeling-technologie, die donor- en acceptorparels gebruikt die zijn gecoat om specifiek een paar antilichamen te vangen, waarvan er één is gebiotinyleerd. In aanwezigheid van gefosforyleerd eiwit brengen de twee antilichamen de donor- en acceptorparels in de nabijheid, waardoor een chemiluminescent signaal kan worden ^gegenereerd6. Hoewel veelzijdig en gevoelig, is deze technologie duur, wordt beïnvloed door biotine in het kweekmedium, is zeer gevoelig voor omgevingstemperatuur en licht en vereist een speciale lezer voor detectie. HTRF en LANCE zijn beide gebaseerd op TR-FRET-technologie die gebruik maakt van langlevende luminescerende lanthanide-ioncomplexen (Europium- of Terbiumchelaten of Europiumcryptaat) als donormoleculen en verrode fluoroforen als de ^{acceptormoleculen7}. Wanneer twee eiwitspecifieke antilichamen gelabeld met donor- of acceptormoleculen in de nabijheid worden gebracht, vindt FRET plaats, waardoor een toename van de fluorescentie van de acceptor en een afname van de fluorescentie van de donor ontstaat. Deze langlevende fluorescerende signalen kunnen op een tijdsgeoploeide en ratiometrische manier worden gemeten om testinterferentie te verminderen en de gegevenskwaliteit te verhogen. Andere voordelen van TR-FRET zijn dat het niet lichtgevoelig is, herhaalde metingen mogelijk maakt en een lange signaalstabiliteit vertoont. Hoewel TR-FRET op grote schaal wordt geïmplementeerd in HTS vanwege zijn veelzijdigheid, gevoeligheid en hoge robuustheid, zijn alle commerciële TR-FRET-gebaseerde testplatforms duur, waardoor de brede toepassing ervan in academische en kleine industriële laboratoria wordt uitgesloten. De LanthaScreen-test maakt ook gebruik van een op TR-FRET gebaseerde uitlezing, maar is afhankelijk van een gemanipuleerde U2OS-cellijn die stabiel groen fluorescerend eiwit (GFP) -STAT1-fusie-eiwit tot expressie brengt in combinatie met een terbium-gelabeld fosfo-specifiek STAT1-antilichaam8. Naast het feit dat deze methode beperkt is in termen van keuze van signaaleiwitten, vereist deze methode de aankoop van dure getransfecteerde cellijnen, waardoor de toepasbaarheid ervan wordt verminderd en de mogelijkheid van experimentele artefacten wordt vergroot. Lumit is een generiek bioluminescent immunoassay-platform dat secundaire antilichamen (anti-muis en anti-konijn) gebruikt die chemisch zijn gelabeld met de kleine en grote NanoBit-subeenheden van NanoLuc ^Luciferase9. De binding van twee primaire antilichamen aan het doeleiwit brengt de secundaire antilichamen in de nabijheid om een actief enzym te vormen dat een luminescentiesignaal genereert. Hoewel luminescentie over het algemeen een gevoelige en robuuste uitlezing is, beperkt de vereiste voor primaire antilichamen die in twee verschillende soorten zijn verhoogd de keuzes voor het ontwerp van de test. Bovendien kan het gebruik van secundaire antilichamen in complexe monstermatrixen gevoelig zijn voor assay-interferentie.

Er bestaat dus nog steeds behoefte aan een betrouwbaar, snel, maar betaalbaar testplatform op basis van cellen voor het meten van individuele gefosforyleerde en totale STAT-eiwitten op een manier die compatibel is met HTS. Om aan deze behoefte te voldoen, werd een nieuw high-throughput celgebaseerd immunoassayplatform ontwikkeld op basis van een verbeterde TR-FRET-technologie (THUNDER) en ontworpen om eenvoudige, gevoelige, robuuste en kosteneffectieve meting van endogene tot expressie gebrachte intracellulaire eiwitten (gefosforyleerd of totaal) in cellysaten mogelijk te maken. De voordelen van deze technologie komen voort uit de combinatie van een donor/acceptor FRET-paar met uitzonderlijke spectrale compatibiliteit en TR-FRET-signaal, rigoureus gevalideerde antilichamen en geoptimaliseerde lysisbuffers. Deze assays zijn geformatteerd als sandwich immunoassays en maken gebruik van een eenvoudige workflow in drie stappen (figuur 1). Cellen worden eerst behandeld om eiwitfosforylatie te moduleren en vervolgens gelyseerd met de specifieke lysisbuffer in de kit. Het doelgefosforyleerde of totale STAT-eiwit in het cellysaat wordt gedetecteerd in een enkele reagenstoevoegings- en incubatiestap met een paar fluorofoor-gelabelde antilichamen die verschillende epitopen op het doeleiwit herkennen (figuur 2). Eén antilichaam wordt gelabeld met een Europium-chelaatdonor (Eu-Ab1), terwijl het tweede antilichaam wordt gelabeld met een verrode acceptorfluoofoor (FR-Ab2). De twee gelabelde antilichamen binden zich aan het eiwit in oplossing, waardoor de twee labels dicht bij elkaar komen. Excitatie van het donor-europiumchelaat bij 320 of 340 nm activeert een FRET naar de acceptor, die een langlevend TR-FRET-signaal uitzendt bij 665 nm evenredig met de concentratie van doeleiwit (gefosforyleerd of totaal) in het cellysaat.

Figuur 1: TR-FRET assay workflow. De workflow bestaat uit drie stappen: celbehandeling, cellysis en eiwitdetectie met BEHULP VAN TR-FRET. In het tweeplatentestprotocol worden lysaten overgebracht naar een witte 384-well detectieplaat, terwijl in het one-plate protocol alle stappen worden uitgevoerd in dezelfde witte 384-well detectieplaat (all-in-one-well protocol). Ongeacht het gebruikte testprotocol wordt eiwitdetectie uitgevoerd in hetzelfde totale volume (20 μL per put). Afkorting: TR-FRET = time-resolved Förster resonantie energieoverdracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: TR-FRET sandwich immunoassay principe. Eén antilichaam wordt gelabeld met de Europium chelaatdonor (Eu-Ab1) en het tweede met de verrode kleine fluorofoor acceptor (FR-Ab2). De twee gelabelde antilichamen binden specifiek aan verschillende epitopen op het doeleiwit (gefosforyleerd of totaal) in het cellysaat, waardoor de twee fluoroforen in de buurt komen. Excitatie van het donor-Europiumchelaat bij 320 of 340 nm veroorzaakt een FRET van de donor naar de acceptormoleculen, die op hun beurt een signaal uitzenden bij 665 nm. Dit signaal is evenredig met de concentratie eiwit in het cellysaat. Bij afwezigheid van het specifieke doeleiwit zijn de donor- en acceptorfluooforen te ver van elkaar verwijderd om FRET te laten optreden. Afkortingen: FRET = Förster resonantie energieoverdracht; TR-FRET = tijd-opgeloste FRET; Ab = antilichaam; FR = verrood; Eu - Europiumchelaat; P = fosforylering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier worden gedetailleerde protocollen verstrekt voor het meten, in een 384-well-formaat, van de intracellulaire niveaus van gefosforyleerde STAT1 (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) en STAT6 (Y641), samen met de totale STAT1, STAT3, STAT5 en STAT6, in cellysaten van adherent- of suspensiecellen met behulp van het THUNDER TR-FRET-platform. Deze protocollen definiëren stappen voor celbehandeling, lysis en TR-FRET-gebaseerde doeleiwitdetectie met behulp van een twee-plaat overdrachtsprotocol of een één-plaat all-in-one-well-protocol. Deze celgebaseerde assays worden toegepast voor het bepalen van het farmacologische profiel van bekende activatoren en remmers van de JAK/STAT-route. De robuustheid en geschiktheid van geselecteerde testen voor HTS worden aangetoond. Ten slotte worden belangrijke experimenten voor assay-optimalisatie besproken, samen met aanbevelingen voor het oplossen van problemen met assays.

Protocol

1. Celkweek

1. Houd cellen in een bevochtigde 37 °C/5% _{CO2-incubator} en kweek met DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (HeLa- en A431-cellen) of RPMI aangevuld met 15% FBS (U266B1-cellen). Kweek de cellen totdat ze 70-80% samenvloeiing bereiken, trypsiniseer ze vervolgens en passeer of gebruik ze voor de testen.
   OPMERKING: Cultuurmedia bevatten fenolrood. Er werd geen serumuithongering uitgevoerd voor een cellijn voorafgaand aan het uitvoeren van de testen.

2. Titratie van stimulator of remmers met behulp van het tweeplatentestprotocol met aanhangende cellen

OPMERKING: In deze procedure wordt beschreven hoe de potenties van stimulatoren of remmers kunnen worden bepaald door een concentratie-responscurve te genereren uit een verdunningsreeks van de teststof.

1. Cel zaaien
   1. Doseer 50 μL cellen met de vooraf geoptimaliseerde dichtheid (40.000 HeLa-cellen / put voor zowel STAT3 als STAT6; 75.000 A431-cellen / put voor STAT5) in een 96-well weefselkweekbehandelde plaat in het juiste kweekmedium. Incubeer 's nachts bij 37 °C/5% _CO2.
      OPMERKING: Optimale celdichtheid en kweekincubatietijd moeten worden bepaald.
2. Verdunningen van teststoffen
   1. Bereid tussenliggende 2x verdunningsreeksen van teststof(en) door de verbinding(en) (halflog-intervalverdunningen) over 12 putten van een polypropyleenplaat met 96 putten serieel te verdunnen tot serumvrij medium.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om een 12-punts, half-log interval concentratie-responscurve in ten minste duplicaat uit te voeren voor een nauwkeurige schatting van de _EC50 of _IC50.
   2. Als alternatief, voor hydrofobe, dimethylsulfoxide (DMSO)-oplosbare testverbindingen, voer de initiële verdunningen uit in 100% DMSO en verdun de verdunningsreeks van de verbinding vervolgens tot serumvrij medium.
      OPMERKING: De testtolerantie voor DMSO moet worden vastgesteld voordat een titratie van de testverbinding in een DMSO-medium wordt uitgevoerd. Het is belangrijk om gelijke oplosmiddelconcentraties te behouden tussen behandelde en onbehandelde cellen. Bovendien moeten bij het testen van seriële verdunningen van verbindingen de oplosmiddelconcentraties altijd constant blijven over de hele verdunningsreeks.
3. Celbehandeling
   1. Voeg voor celstimulatie alleen 50 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de stimulator (2x).
   2. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij kamertemperatuur (RT) of 37 °C (interferon (IFN) α2b/20 min bij RT voor STAT3; epidermale groeifactor (EGF)/10 min bij RT voor STAT5; interleukine (IL)-4/20 min bij RT voor STAT6). Ga dan verder met paragraaf 2.4.
      OPMERKING: Optimale incubatietemperatuur moet worden bepaald.
   3. Voeg voor celremming alleen 25 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de remmer (4x).
   4. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (JAK-remmer 1/30 min bij RT voor STAT3 en STAT6; Erlotinib/15 min bij RT voor STAT5).
   5. Voeg 25 μL serumvrij medium alleen (onbehandelde cellen) of met de stimulator (4x) toe aan de _EC80.
   6. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (dezelfde omstandigheden als voor stap 2.3.2).
4. Cellyse
   1. Bereid de specifieke 1x supplemented Lysis Buffer van de kit voor zoals aangegeven door de fabrikant.
      OPMERKING: Het is verplicht om de 1x Lysis Buffer aan te vullen met de 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail verdund tot een eindconcentratie van 1x. De 1x Supplemented Lysis Buffer bevat 1 mM natriumfluoride, 2 mM natrium orthovanadaat en 2 mM beta-glycerofosfaat. Andere fosfataseremmers zijn niet nodig en moeten worden vermeden. Lysisbuffers en fosfataseremmers anders dan die in de kit worden niet aanbevolen omdat ze ingrediënten kunnen bevatten die de meting kunnen verstoren.
   2. Verwijder het celkweekmedium voorzichtig en gooi het weg door het supernatant op te zuigen.
   3. Voeg onmiddellijk 50 μL 1x Supplemented Lysis Buffer toe.
      OPMERKING: Het Lysis Buffer-volume (25-50 μL) kan worden geoptimaliseerd.
   4. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT onder schudden (orbitale platenschudder ingesteld op 400 tpm; matige agitatie).
      OPMERKING: De incubatietijd van Lysis (30-60 min) kan worden geoptimaliseerd. Lysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt voor doeleiwitdetectie of worden ingevroren bij -80 °C.
5. TR-FRET detectie
   1. Bereid de 4x Antilichaamdetectiemix voor in 1x Detectiebuffer zoals aangegeven door de fabrikant.
   2. Pipetteer in deze overdrachtsstap voorzichtig 15 μL cellysaat van de 96-well kweekplaat naar een put van een witte, low-volume 384-well microplaat.
   3. Voeg 15 μL van het Positive Control Lysate en 15 μL van 1x Lysis Buffer (negatieve controle) toe aan afzonderlijke testputten.
   4. Voeg 5 μL 4x Antilichaamdetectiemix (Eu-Ab1/FR-Ab2 voor detectie van het fosfo-eiwit of Eu-Ab3/FR-Ab4 voor detectie van het totale eiwit) toe aan elk van de testputten.
   5. Bedek de plaat met een platensealer en incubeer gedurende 1 uur tot een nacht bij RT, afhankelijk van de test (zie het bijbehorende technische gegevensblad).
      OPMERKING: Optimale leestijd moet worden geoptimaliseerd voor elke test en cellijn. De plaat kan meerdere keren worden gelezen zonder een negatief effect op de testprestaties.
   6. Verwijder de zelfklevende platensealer en lees de plaat af op een TR-FRET compatibele microplaatlezer.
      OPMERKING: Filtergebaseerde fluorometers worden aanbevolen, hoewel sommige monochromatorinstrumenten kunnen worden gebruikt. Controleer of de juiste optische module (filters en spiegel) voor TR-FRET is geïnstalleerd. Gebruik een excitatiegolflengte van 320 of 340 nm om het Europium-chelaat te prikkelen. Lees assays bij zowel 615 nm (of 620 nm) als 665 nm om zowel de emissie van respectievelijk het donor-europium als de acceptorfluoofoor te detecteren. De instellingen van het instrument zijn afhankelijk van de specifieke lezer. De hier gepresenteerde gegevens werden verkregen met behulp van lampgebaseerde excitatie, 90 μs vertraging, 300 μs integratietijd en 100 flitsen per put. De fosfo-STAT4-test werd echter gelezen met behulp van laserexcitatie om hogere signaal-achtergrondverhoudingen (S / B) te genereren.

3. Titratie van stimulator of remmers met behulp van het testprotocol met twee platen met suspensiecellen

1. Verdunning van teststoffen
   1. Bereid tussenliggende 2x verdunningsreeksen van teststof(en) zoals beschreven in de stappen 2.2.1 en 2.2.2.
2. Celzaaien en behandeling
   1. Doseer 20 μL cellen met de vooraf geoptimaliseerde dichtheid (200.000 U266B1-cellen / put voor STAT1; 400.000 U266B1-cellen / put voor STAT4) in een 96-well weefselkweekbehandelde plaat in het juiste kweekmedium. Ga direct over tot celbehandeling of incubeer 2-4 uur bij 37 °C, 5% _CO2.
      OPMERKING: Deze stap moet worden geoptimaliseerd voor verschillende celtypen.
   2. Voeg voor celstimulatie alleen 20 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de stimulator (2x).
   3. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (IFNα2b/15 min bij RT voor STAT1; IFNα2b/25 min bij 37 °C voor STAT4). Ga dan verder met paragraaf 3.3.
      OPMERKING: Optimale incubatietemperatuur moet worden bepaald.
   4. Voeg voor celremming alleen 10 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de remmer (4x).
   5. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (JAK-remmer 1/30 min bij RT voor STAT1 en STAT4).
   6. Voeg 10 μL serumvrij medium alleen (onbehandelde cellen) of met de stimulator (4x) toe aan de _EC80.
   7. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij RT of 37 °C (dezelfde omstandigheden als voor stap 3.2.3).
3. Cellyse
   1. Bereid de specifieke 5x Supplemented Lysis Buffer van de kit voor zoals aangegeven door de fabrikant.
      OPMERKING: Het is verplicht om de 5x Lysis Buffer aan te vullen met de 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail verdund tot een eindconcentratie van 5x. De 5x Supplemented Lysis Buffer bevat 5 mM natriumfluoride, 10 mM natriumorthopvanadaat en 10 mM bèta-glycerofosfaat. Andere fosfataseremmers zijn niet nodig en moeten worden vermeden.
   2. Voeg 10 μL 5x Supplemented Lysis Buffer toe.
   3. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT onder schudden (orbitale platenschudder ingesteld op 400 tpm; matige agitatie).
      OPMERKING: De incubatietijd van Lysis (30-60 min) kan worden geoptimaliseerd. Lysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt voor doeleiwitdetectie of worden ingevroren bij -80 °C.
4. TR-FRET detectie
   1. Voer na cellyse de TR-FRET-detectiestap uit zoals beschreven in rubriek 2.5 voor het 2-plaattestprotocol voor aanhangende cellen.

4. Titratie van de stimulator met behulp van het testprotocol met één plaat met aanhangende of suspensiecellen

1. Verdunning van teststoffen
   1. Bereid tussenverdunningsreeksen van teststof(en) bij 3x door de verbinding(en) (halflog-intervalverdunningen) over 12 putten van een polypropyleenplaat met 96 ruimen serieel te verdunnen tot serumvrij medium.
2. Celzaaien en behandeling
   1. Doseer 8 μL cellen met de vooraf geoptimaliseerde dichtheid (160.000 U266B1-cellen / put voor STAT4; 80.000 HeLa-cellen / put voor STAT6), in het juiste serumvrije kweekmedium, in een witte, laagvolume 384well-testplaat. Ga direct over tot celbehandeling of incubeer 2-4 uur bij 37 °C, 5% _CO2.
      OPMERKING: De vereiste voor een celkweekincubatietijd vóór de behandeling moet worden bepaald voor verschillende celtypen.
   2. Voeg voor celstimulatie alleen 4 μL serumvrij medium toe (onbehandelde cellen) of met de stimulator (3x).
   3. Incubeer voor de vooraf geoptimaliseerde tijd bij kamertemperatuur of 37 °C (IFNα2b/25 min bij 37 °C voor STAT4; IL-4/20 min bij 37°C voor STAT6). Ga dan verder met paragraaf 4.3.
3. Cellyse
   1. Bereid de specifieke 5x Supplemented Lysis Buffer van de kit voor zoals aangegeven door de fabrikant.
      OPMERKING: Het is verplicht om de 5x Lysis Buffer aan te vullen met de 100x Phosphatase Inhibitor Cocktail verdund tot een eindconcentratie van 5x.
   2. Voeg 3 μL 5x supplemented Lysis Buffer toe.
   3. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT onder schudden (orbitale platenschudder bij 400 tpm).
      OPMERKING: De incubatietijd van Lysis (30-60 min) kan worden geoptimaliseerd. Lysaten kunnen onmiddellijk worden gebruikt of worden ingevroren bij 80 °C.
4. TR-FRET detectie
   1. Voeg 15 μL Positive Control Lysate (onverdund) en 15 μL 1x Supplemented Lysis Buffer (negatieve controle) toe aan afzonderlijke testputten.
   2. Voeg 5 μL 4x antilichaamdetectiemix (Eu-Ab1/FR-Ab2 voor het fosfo-eiwit of Eu-Ab3-/FR-Ab4 voor het totale eiwit) bereid in 1x detectiebuffer toe aan elk van de testputten.
   3. Bedek de plaat met een platensealer en incubeer gedurende 1 uur tot een nacht bij RT, afhankelijk van de test.
      OPMERKING: Optimale leestijd moet worden geoptimaliseerd voor elke test en cellijn. De plaat kan meerdere keren worden gelezen zonder een negatief effect op de testprestaties.
   4. Verwijder de zelfklevende platensealer. Lees de plaat op een TR-FRET-compatibele microplaatlezer.

5. Data-analyse

1. Bereken de TR-FRET-verhouding voor elke put met behulp van de volgende formule (1):
   (1)
   OPMERKING: Omdat het TR-FRET-signaal wordt gelezen in een tijdomlossende modus, is aftrekken op de achtergrond meestal niet nodig. Als achtergrondaftrek wordt uitgevoerd, gebruik dan de celvrije putten met de 1x aangevulde lysisbuffer (negatieve controle) voor achtergrondaftrek. Bepaal de gemiddelde TR-FRET-verhouding van de celvrije putten en trek deze waarde vervolgens af van de TR-FRET-verhouding van elke put.
2. Voor concentratie-responscurven analyseert u de gegevens volgens een niet-lineaire regressie met behulp van de 4 parameter logistieke vergelijking (sigmoïdale dosis-responscurve met variabele helling) en een 1/^{Y2-gegevensweging} om _{EC50- of IC50-waarden} te genereren.
3. Voor het Z'-factorexperiment analyseert u de gegevens volgens de volgende formule (2)¹⁰
   (2)
   Waar μ en σ zijn de gemiddelde waarden en standaardafwijkingen voor respectievelijk de positieve controle (p; gestimuleerde cellen) en de negatieve controle (n; onbehandelde cellen).

Representative Results

Elke THUNDER TR-FRET-test werd farmacologisch gevalideerd door adherent (HeLa of A431) of suspensiecellen (U266B1) te behandelen met JAK/STAT pathway-specifieke activatoren of remmers en vervolgens de niveaus van specifieke gefosforyleerde en totale STATs te meten, indien van toepassing. Assays werden uitgevoerd in 384-well formaat met behulp van het twee-plaat overdrachtsprotocol en vooraf geoptimaliseerde testomstandigheden. Figuur 3, figuur 4, figuur 5, figuur 6 en figuur 7 geven een overzicht van representatieve concentratie-responscurven die voor alle STAT-assays zijn verkregen. Over het algemeen vertoonden alle concentratie-responscurven van stimulatoren en remmers voor de fosfo-STAT-assays robuuste TR-FRET-signalen, brede dynamische bereiken, lage inter-well variatiecoëfficiënt (meestal ≤5%) en acceptabele S/B-verhoudingen. De hier gerapporteerde _EC50 - en _IC50-waarden liggen binnen het bereik van de verwachte waarden.

Behandeling van cellen met de JAK-activatoren IFNα2b (fosfo-STAT1, fosfo-STAT3 en fosfo-STAT4), IL-4 (fosfo-STAT6) en EGF (fosfo-STAT5) toonde de verwachte concentratieafhankelijke toename van STAT-fosforylering bij specifieke tyrosineresiduen, terwijl de overeenkomstige totale STAT-eiwitten (STAT1, STAT3, STAT5 en STAT6) stabiel bleven (figuur 3, figuur 4, figuur 5, figuur 6 en figuur 7 , paneel A). De signaalafname (minder dan 20%) waargenomen voor totale STAT5 met toenemende STAT5-fosforylering wordt verwacht en is te wijten aan sterische belemmering, waarbij fosforylering van STAT5 de binding van een van de twee anti-totale STAT5-antilichamen aan zijn respectieve antigeen belemmert. De _EC50-waarden lagen in het subnanomolaire bereik voor IFNα2b en IL-4 (0,083 tot 0,47 nM) en in het lage nanomolaire bereik voor EGF (12 nM). Deze waarden zijn in overeenstemming met gepubliceerde ^gegevens6,11.

Om te bevestigen dat het signaal geïnduceerd door de activatoren werd gemedieerd door de activering van endogene receptoren, werden cellen voorbehandeld met toenemende concentraties van JAK-remmer 1 (een pan-JAK-remmer) of Erlotinib (een EGFR-tyrosinekinaseremmer) voorafgaand aan submaximale stimulatie (_EC80) met de STAT-activatoren. Zoals verwacht remden zowel JAK-remmer 1 als Erlotinib de overeenkomstige fosfo-STAT-niveaus op een concentratieafhankelijke manier, met _IC50-waarden variërend tussen het lage nanomolaire en het hoge nanomolaire bereik voor JAK-remmer 1 (29-759 nM) en in het lage nanomolaire bereik voor Erlotinib (10 nM) (figuur 3, figuur 4, figuur 5, figuur 6 en figuur 7, Paneel B). De _IC50-waarden komen overeen met de gepubliceerde gegevens11,12,13. Zoals het geval was voor stimulatie-experimenten, werden de niveaus van overeenkomstige totale STAT niet beïnvloed door beide behandelingen. Samen tonen deze resultaten de specificiteit van elke test voor zijn endogene doel STAT-eiwit (gefosforyleerd of totaal) en hun vermogen om activatoren of remmers te profileren die een reeks potenties vertonen.

Assays waarbij de hele workflow (celbehandeling, lysis en eiwitdetectie) wordt uitgevoerd in een enkele put van een 384-well plaat zonder overdrachtsstap zijn meer geschikt voor HTS. Dienovereenkomstig werden de fosfo-STAT4- en fosfo-STAT6-assays uitgevoerd met behulp van het één-plaatprotocol. Representatieve gegevens verkregen onder geoptimaliseerde omstandigheden zijn samengevat in figuur 8 en figuur 9. Stimulatie van ofwel gefosforyleerd STAT4 door IFNα2b in een suspensie cellijn (U266B1; Figuur 8) of gefosforyleerd STAT6 door IL-4 in een aanhangende cellijn (HeLa; Figuur 9) werd verkregen met aanvaardbare S/B-verhoudingen en _EC50-waarden die consistent zijn met die verkregen met behulp van het tweeplatenprotocol. Deze gegevens tonen aan dat de fosfo-STAT-assays met succes kunnen worden aangepast van een twee-plaat overdrachtsprotocol naar een één-plaat alles-in-één-putprotocol.

De Z'-factor wordt vaak gebruikt in de HTS-gemeenschap voor de evaluatie van de geschiktheid en robuustheid van een test voor ^HTS10. Om de fosfo-STAT-assays verder te valideren, werden voorlopige Z'-factorstudies handmatig uitgevoerd met behulp van het tweeplatenprotocol. Om de stabiliteit van de test te beoordelen, werden platen afgelezen na zowel een incubatie van 4 uur als een incubatie 's nachts. De resultaten verkregen voor de fosfo-STAT1- en fosfo-STAT3-assays, respectievelijk met behulp van een suspensiecellijn (U266B1) of een aanhangende cellijn (HeLa), zijn samengevat in figuur 10. Berekende Z′-factorwaarden waren 0,85 voor fosfo-STAT1 en 0,79 voor fosfo-STAT3. Na nachtelijke incubatie bleven de Z'-factorwaarden stabiel (0,83 voor fosfo-STAT1 en 0,78 voor fosfo-STAT3). Vergelijkbare Z'-factorwaarden werden verkregen voor de andere fosfo-STAT-assays (STAT4: 0,79; STAT5: 0,78; STAT6: 0,63). Een celgebaseerde test met een Z'-factor ≥ 0,40 wordt geschikt geacht voor ^HTS15. Deze resultaten tonen dan ook de robuustheid aan van deze fosfo-STAT-assays voor HTS-toepassingen.

Figuur 3: Detectie van fosfo-STAT1 (Y701) modulatie in U266B1 cellen. Cellen (200.000 cellen/put) gezaaid in een 96-well kweekplaat werden behandeld met toenemende concentraties van ofwel (A) IFNα2b gedurende 15 min bij RT of (B) JAK Inhibitor 1 gedurende 30 min bij RT, vervolgens met 1 nM (_EC80) IFNα2b gedurende 15 min bij RT. Na lysis werden lysaten overgebracht naar een 384-well witte plaat met een laag volume, gevolgd door de toevoeging van de Antibody Detection Mix. De plaat werd gedurende 4 uur geïncubeerd bij RT en vervolgens gelezen op een TR-FRET-compatibele lezer. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van drievoudige putten per testpunt. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Sommige foutbalken zijn kleiner dan de symboolgrootte. Afkortingen: STAT = signaalomvormer en activator van transcriptie; IFN = interferon; RT = kamertemperatuur; JAK = Janus kinase; TR-FRET = tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht; S/B = signaal/achtergrond verhouding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Detectie van fosfo-STAT3 (Y705) en totale STAT3-modulatie in HeLa-cellen. Cellen (40.000 cellen/put) die 's nachts in een 96-well kweekplaat werden gekweekt, werden behandeld met toenemende concentraties van ofwel (A) IFNα2b gedurende 20 min bij RT of (B) JAK-remmer 1 gedurende 30 minuten bij RT en vervolgens met 1,5 nM IFNα2b gedurende 20 min bij RT. Na mediaverwijdering en lysis werden lysaten overgebracht naar een 384-well witte plaat met een laag volume, gevolgd door de toevoeging van de Antibody Detection Mix. De plaat werd gedurende 4 uur geïncubeerd bij RT en vervolgens gelezen op een TR-FRET-compatibele lezer. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van drievoudige putten per testpunt. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Sommige foutbalken zijn kleiner dan de symboolgrootte. Afkortingen: STAT = signaalomvormer en activator van transcriptie; IFN = interferon; RT = kamertemperatuur; JAK = Janus kinase; TR-FRET = tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht; S/B = signaal/achtergrond verhouding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Detectie van fosfo-STAT4 (Y693) modulatie in U266B1 cellen. Cellen (400.000 cellen/put) gezaaid in een 96-well kweekplaat werden behandeld met toenemende concentraties van ofwel (A) IFNα2b gedurende 25 min bij 37 °C of (B) JAK-remmer 1 gedurende 30 minuten bij RT, vervolgens met 1 nM IFNα2b gedurende 25 min bij 37 °C. Na mediaverwijdering en lysis werden lysaten overgebracht naar een 384-well witte plaat met een laag volume, gevolgd door de toevoeging van de Antibody Detection Mix. De plaat werd 's nachts geïncubeerd bij RT en vervolgens gelezen op een TR-FRET-compatibele lezer. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van drievoudige putten per testpunt. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Sommige foutbalken zijn kleiner dan de symboolgrootte. Afkortingen: STAT = signaalomvormer en activator van transcriptie; IFN = interferon; RT = kamertemperatuur; JAK = Janus kinase; TR-FRET = tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht; S/B = signaal/achtergrond verhouding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Detectie van fosfo-STAT5 (Y694/Y699) en totale STAT5-modulatie in A431-cellen. Cellen (75.000 cellen/put) die 's nachts in een 96-well kweekplaat werden gekweekt, werden behandeld met toenemende concentraties van ofwel (A) EGF gedurende 10 min bij RT of (B) Erlotinib gedurende 15 min bij RT, vervolgens met 73 nM EGF gedurende 10 min bij RT. Na mediaverwijdering en lysis werden lysaten overgebracht naar een 384-well witte plaat met een laag volume, gevolgd door de toevoeging van de Antibody Detection Mix. De plaat werd 's nachts geïncubeerd bij RT en vervolgens gelezen op een TR-FRET-compatibele lezer. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van drievoudige putten per testpunt. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Sommige foutbalken zijn kleiner dan de symboolgrootte. Afkortingen: STAT = signaalomvormer en activator van transcriptie; EFG = epidermale groeifactor; RT = kamertemperatuur; TR-FRET = tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht; S/B = signaal/achtergrond verhouding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Detectie van fosfo-STAT6 (Y641) en totale STAT6-modulatie in HeLa-cellen. Cellen (40.000 cellen/put) die 's nachts in een 96-well kweekplaat werden gekweekt, werden behandeld met toenemende concentraties van ofwel (A) IL-4 gedurende 20 min bij RT of (B) JAK-remmer 1 gedurende 30 minuten bij RT, vervolgens met 0,5 nM IL4 gedurende 20 minuten bij RT. Na mediaverwijdering en lysis werden lysaten overgebracht naar een 384-well witte plaat met een laag volume, gevolgd door de toevoeging van de Antibody Detection Mix. De plaat werd gedurende 4 uur geïncubeerd bij RT en vervolgens gelezen op een TR-FRET-compatibele lezer. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van drievoudige putten per testpunt. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Sommige foutbalken zijn kleiner dan de symboolgrootte. Afkortingen: STAT = signaalomvormer en activator van transcriptie; IL = interleukine; JAK = Janus kinase; RT = kamertemperatuur; TR-FRET = tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht; S/B = signaal/achtergrond verhouding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Detectie van fosfo-STAT4 (Y693) stimulatie in U266B1 cellen met het one-plate protocol. Cellen (160.000 cellen/put) gezaaid in een laag volume 384-well witte plaat werden onmiddellijk behandeld met toenemende concentraties IFNα2b gedurende 25 minuten bij 37 °C. Na lysis werd de Antibody Detection Mix direct aan het lysaat toegevoegd. De plaat werd 's nachts geïncubeerd bij RT en vervolgens gelezen op een TR-FRET-compatibele lezer met behulp van een flitslamp of laserexcitatie. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van drievoudige putten per testpunt. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Sommige foutbalken zijn kleiner dan de symboolgrootte. Afkortingen: STAT = signaalomvormer en activator van transcriptie; IFN = interferon; RT = kamertemperatuur; TR-FRET = tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht; S/B = signaal/achtergrond verhouding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 9: Detectie van fosfo-STAT6 (Y641) stimulatie in HeLa-cellen met het één-plaatprotocol. Cellen (80.000 cellen/put) gezaaid in een laag volume 384-well witte plaat werden onmiddellijk behandeld met toenemende concentraties IL-4 gedurende 20 minuten bij RT. Na lysis werd de Antibody Detection Mix direct aan het lysaat toegevoegd. De plaat werd 4 uur bij RT geïncubeerd en vervolgens gelezen op een TR-FRET-compatibele lezer. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde van drievoudige putten per testpunt. Foutbalken geven de standaarddeviatie aan. Sommige foutbalken zijn kleiner dan de symboolgrootte. Afkortingen: STAT = signaalomvormer en activator van transcriptie; IL = interleukine; RT = kamertemperatuur; TR-FRET = tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht; S/B = signaal/achtergrond verhouding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 10: Intraplate variabiliteitsstudie van de fosfo-STAT1 (Y701) en fosfo-STAT3 (Y705) assays. (A) Phospho-STAT1 assay: suspensiecellen (200.000 U266B1 cellen/well) werden behandeld met 10 nM IFNα2b gedurende 15 min of serumvrij medium alleen (lage controles). (B) Fosfo-STAT3-test: aanhangende cellen (20.000 HeLa-cellen/put) werden behandeld met 5 nM IFNα2b gedurende 20 minuten of met serumvrij medium alleen. Voor beide testen werd het TR-FRET-signaal na 4 uur incubatie gelezen. Afkortingen: STAT = signaalomvormer en activator van transcriptie; IFN = interferon; TR-FRET = tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht; S/B = signaal/achtergrond verhouding; CV = variatiecoëfficiënt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Vergeleken met conventionele methoden voor fosfoproteïne-analyse zoals western blotting en ELISA-gebaseerde methoden, is de workflow voor een THUNDER TR-FRET cellulaire test eenvoudig en snel, maakt gebruik van een monster met een laag volume (15 μL), is ontworpen voor HTS in een 384-well formaat en is zeer vatbaar voor automatisering. Het testprotocol is flexibel en kan gemakkelijk worden aangepast aan zowel toepassingen met een gemiddelde als hoge doorvoer. Assays kunnen worden uitgevoerd met behulp van een twee-plaat overdrachtsprotocol of een één-384-well plaatprotocol. In het tweeplaatsoverdrachtsprotocol worden cellen gezaaid, behandeld en gelyseerd in één celkweekplaat, en lysaten worden vervolgens overgebracht naar een afzonderlijke witte detectieplaat (half-gebied 96-well of 384-well plaat) voor analyse. In een one-384-well plaatprotocol wordt de hele workflow in dezelfde put uitgevoerd, waardoor een vloeistofoverdrachtsstap niet nodig is. De assays konden eenvoudig worden aangepast aan het 1536-well-formaat door het volume proportioneel te verminderen. Ongeacht het testprotocol zijn er slechts drie reagensoplossingen om voor te bereiden en geen wasstappen, en de testen kunnen worden uitgevoerd volgens een "additie-only" -protocol, dat minimale hands-on tijd vereist.

Een cruciale stap bij het uitvoeren van een celgebaseerde test is de optimalisatie van celkweek en ^{behandelingsomstandigheden16}. Zowel het celnummer als de behandelingsomstandigheden vereisen zorgvuldige optimalisatie voordat een test wordt uitgevoerd, omdat deze belangrijke parameters vaak variëren voor elke cellijn en elk fosfoproteïne. De optimalisatie van deze parameters maakt het mogelijk om het testvenster te maximaliseren, optimale prestaties te verkrijgen met een hoge S / B-verhouding en een lage inter-well variatiecoëfficiënt, en de robuustheid en reproduceerbaarheid van de resultaten te garanderen. Het celnummer, de serumgebrek (indien van toepassing) en de stimulatie- of remmingstijd (bij kamertemperatuur of 37 °C) moeten voor elke cellijn en elk doeleiwit worden geoptimaliseerd. Te hoge of te lage celaantallen kunnen de modulatie van intracellulaire signaalwegen negatief beïnvloeden. Celzaaidichtheden van 40.000-80.000 cellen / goed voor aanhangende cellen of 100.000-200.000 cellen / put voor suspensiecellen zijn over het algemeen acceptabel voor de meeste cellijnen. Van belang is dat de optimale tijdsduur voor stimulatie en remming sterk kan variëren tussen cellijnen en doeleiwitten, van enkele minuten tot enkele uren. Als zodanig wordt een tijdsverloopstudie sterk aanbevolen om de optimale stimulatie- en remmingsincubatietijden te bepalen, idealiter bij zowel kamertemperatuur als 37 ° C, omdat de incubatietemperatuur de kinetiek van doeleiwitstimulatie beïnvloedt.

Het oplossen van problemen met een celgebaseerde test kan moeilijk en tijdrovend zijn vanwege de vele stappen die betrokken zijn bij de workflow (celcultuur, celbehandeling, lysis en eiwitdetectie). Deze testkits bevatten een positieve controlelysaat. Het wordt aanbevolen om deze positieve controlelysaten en negatieve controle (1x aangevuld met Lysis Buffer alleen) in elk experiment te gebruiken. Het gebruik van de juiste controles vergemakkelijkt het oplossen van problemen, omdat problemen dan snel kunnen worden toegeschreven aan de detectiestap (onjuiste reagensvoorbereiding en / of testuitvoering) of de kwaliteit van de lysaten die in het experiment worden gebruikt. Dit laatste is over het algemeen te wijten aan het gebruik van suboptimale cellulaire omstandigheden.

Een bijkomend voordeel van dit platform is de beschikbaarheid van een suite van geoptimaliseerde lysisbuffers met verschillende stringencies. Dit maakt het mogelijk om min of meer heterogene lysaten te genereren uit partiële subcellulaire fractionering. Dit is nuttig omdat signaaleiwitten zich in verschillende intracellulaire compartimenten bevinden en sommige, zoals STAT-eiwitten, pendelen tussen compartimenten (bijvoorbeeld tussen het cytoplasma en de kern). Van belang is dat gefosforyleerd en totaal STAT1 lysisbuffer 1 gebruiken omdat ze niet goed kunnen worden gedetecteerd met de lysisbuffer 2 die wordt gebruikt voor de andere STAT-eiwitten. Andere homogene methoden daarentegen vertrouwen op een enkele "universele" lysisbuffer, die een complexer monster genereert dat niet-specifieke interacties met de antilichamen kan creëren. Het gebruik van verschillende lysisbuffers kan echter de analyse van meerdere signaaleiwitten uit één lysaatmonster uitsluiten. Niettemin kan men nog steeds lysaten die met verschillende lysisbuffers tegelijk worden gegenereerd, op een enkele plaat testen voor parallelle pathway-analyse.

Kortom, de hier gepresenteerde methoden op basis van dit homogene TR-FRET cellulaire immunoassayplatform bieden een high-throughput alternatief voor het monitoren van JAK/STAT-signalering via de detectie en kwantificering van endogene gefosforyleerde STAT1/3/4/5/6-eiwitten, samen met totale STAT1/3/5/6, in cellysaten. Deze assays bieden nieuwe instrumenten voor een uitgebreidere analyse van specifieke STAT-eiwitten na celbehandeling en de screening en karakterisering van specifieke en selectieve modulatoren van de JAK/STAT-signaleringsroutes. Gezien zijn eenvoud, specificiteit, gevoeligheid, reproduceerbaarheid en kosteneffectiviteit vormt dit nieuwe testplatform een aantrekkelijk alternatief voor traditionele immunoassays, zowel in een academische omgeving als in industriële laboratoria voor HTS-toepassingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile	Corning	3595	This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used
384-well microplate, white, low-volume	PerkinElmer	6007290	This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used
A431 cell line	ATCC	CRL-1555
Adhesive microplate seal	PerkinElmer	6050185
DMSO	Fisher	D159-4
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Wisent	319-005-CL	THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
EnVision Xcite Multilabel plate reader	PerkinElmer	2104-0020A	The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option
Erlotinib hydrochloride	Sigma	CDS022564
Falcon tissue culture treated flasks	Fisher	13-680-65
Fetal bovine serum (FBS)	Wisent	098-150
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
JAK Inhibitor 1	Cayman Chemical	15146
Orbital plate shaker	Many options available	Not applicable
Recombinant human EGF	PeproTech	AF-100-15
Recombinant human IFNα2b	ProSpec	CYT-460
Recombinant human IL-4	R&D Systems	204-IL
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI)	Wisent	350-007-CL	THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT1PT-500
THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT3PT-500
THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT4P-500
THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT5PT-500
THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit	BioAuxilium Research	KIT-STAT6PT-500
Trypsin/EDTA 0.05%	Wisent	325-542-CL
U266B1 cell line	ATCC	TIB-196
Ultrapure water	NA	NA	Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer