פרוטוקולי בדיקה מבוססי תאים מבוססי-בסיס של Förster, שנפתרו בזמן, מתוארים עבור הכימות הפשוט, הספציפי, הרגיש והחזק של מתמר אותות זרחן אנדוגני ומפעיל של תמלול (STAT) 1/3/4/5/6 חלבונים בתאים ליסטים בפורמט של 384 בארות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בדיקות העברת אנרגיה תהודה Förster נפתר זמן למדידה של חלבונים STAT זרחן אנדוגני בתאים אנושיים
במאמר זה
סיכום
תקציר
מתמר האיתות יאנוס קינאז (JAK)/אותות ומפעיל מסלול איתות שעתוק (STAT) ממלא תפקיד מכריע בתיווך תגובות סלולריות לציטוקינים וגורמי גדילה. חלבונים STAT מופעלים על ידי טירוזין זרחן בתיווך בעיקר על ידי JAKs. ההפעלה החריגה של מסלולי איתות STAT מעורבת במחלות אנושיות רבות, במיוחד סרטן ותנאים הקשורים למערכת החיסון. לכן, היכולת לעקוב אחר זרחן חלבון STAT בתוך סביבת איתות התא המקומי חשובה הן למחקר אקדמי והן למחקר גילוי תרופות. פורמטי הבדיקה המסורתיים הזמינים לכימות חלבונים סטטיסטיים זרחניים כוללים סופג מערבי ובדיקת החיסון המקושרת לאנזימים (ELISA). שיטות הטרוגניות אלה הן עתירות עבודה, תפוקה נמוכה, ולעתים קרובות לא אמינות (ספציפיות) במקרה של סופג מערבי. שיטות הומוגניות (ללא כביסה) זמינות אך נשארות יקרות.
כאן, פרוטוקולים מפורטים מסופקים עבור המדידה הרגישה, החזקה והחסכונית בפורמט של 384 באר של רמות אנדוגניות של STAT1 זרחן (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) ו- STAT6 (Y641) בתאי ליסטאטים מתאי חסיד או השעיה באמצעות פלטפורמת העברת האנרגיה התהודה החדשה של Förster (TR-FRET). זרימת העבודה עבור הבדיקה הסלולרית היא פשוטה, מהירה ומיועדת להקרנה בתפוקה גבוהה (HTS). פרוטוקול הבדיקה גמיש, משתמש במדגם בנפח נמוך (15 μL), דורש רק שלב אחד של תוספת ריאגנט, וניתן להתאים אותו ליישומים בעלי תפוקה נמוכה ותפוקה גבוהה. כל אימונואסאי כריך phospho-STAT מאומת בתנאים אופטימליים עם אגוניסטים ומעכבים ידועים ומייצר את הפרמקולוגיה הצפויה וערכי Z'factor. מכיוון שבדיקות TR-FRET הן יחסיות ואינן דורשות צעדי כביסה, הן מספקות רבייה טובה בהרבה מגישות מסורתיות. יחד, חבילת בדיקות זו מספקת כלים חסכוניים חדשים לניתוח מקיף יותר של חלבוני STAT זרחניים ספציפיים לאחר טיפול בתאים והסינון ואפיון של אפננים ספציפיים וסלקטיביים של מסלול האיתות JAK / STAT.
מבוא
מסלול האיתות JAK/STAT ממלא תפקיד מרכזי בתיווך תגובות תאיות לציטוקינים מגוונים, אינטרפרונים, גורמי גדילה ומולקולות קשורות1,2. הכריכה של ליגנדים אלה לקולטנים ספציפיים של פני התא גורמת להפעלה של JAKs, אשר בתורו להפעיל חלבונים STAT על ידי זרחן של שאריות טירוזין ספציפיות. זרחן STAT גורם לדימריזציה שלהם וטרנסלוקציה לגרעין, שם הם מפעילים את השפעתם על שעתוק של גנים יעד מוסדר. משפחת STAT מורכבת משבעה חברים: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b ו- STAT6. החברים ממלאים תפקיד מורכב וחיוני בוויסות תהליכי התאים הפיזיולוגיים, כולל התפשטות, בידול, אפופטוזיס, אנגיוגנזה ווויסות מערכת החיסון. ההפעלה החריגה של מסלולי איתות ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות התא
- שמור על תאים בחממה ובתרבית לחים של 37 °C /5% CO2 עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) (תאי HeLa ו- A431) או RPMI בתוספת 15% FBS (תאי U266B1). תרבית את התאים עד שהם מגיעים 70-80% מפגש, ולאחר מכן trypsinize אותם לעבור או להשתמש בהם עבור בדיקות.
הערה: מדיה תרבותית הכילה אדום פנול. לא נערכה רעב בסרום עבור כל קו תאים לפני ביצוע הבדיקות.
2. גירוי או טיטר מעכב באמצעות פרוטוקול בדיקה שתי צלחת עם תאים דבקים
הערה: הליך זה מתאר כיצד לקבוע את עוצמת הממריץ או המעכב על ידי יצירת עקומת תגובת ריכוז מסדרת דילול של תרכובת הבדיקה.
- זריעת תאים
- חלוקת 50 μL של תאים בצפיפות ממוטבת מראש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כל בדיקת רעם TR-FRET אומתה מבחינה פרמקולוגית על ידי טיפול בתאי דבק (HeLa או A431) או השעיה (U266B1) עם מפעילים או מעכבים ספציפיים למסלול JAK / STAT ולאחר מכן מדידת רמות של STATs ספציפיים זרחן וסה"כ, כאשר ישים. הבדיקות נערכו בפורמט של 384 בארות באמצעות פרוטוקול ההעברה של שתי הצלחות ותנאי בדיקה ממוטבים מראש. איור 3, איור 4, איור 5, איור 6 ואיור 7 מסכמים עקומות ייצוגיות של תגו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בהשוואה לשיטות קונבנציונליות לניתוח פוספופרוטאין כגון סופג מערבי ושיטות מבוססות ELISA, זרימת העבודה עבור בדיקת סלולר THUNDER TR-FRET היא פשוטה ומהירה, משתמשת במדגם בנפח נמוך (15 μL), מיועדת ל- HTS בפורמט של 384 בארות, והיא נוחה מאוד לאוטומציה. פרוטוקול הבדיקה גמיש וניתן להתאים אותו בקלות הן ליישומים בעלי תפוקה בינונית והן לתפוקה גבוהה. ניתן להפעיל בדיקות באמצעות פרוטוקול העברה של שתי לוחות או פרוטוקול לוחית רישוי אחת-384 באר. בפרוטוקול ההעברה של שתי הלוחות, התאים נזרעים, מטופלים ומודבקים בלוח תרבית תא אחד, וlysates מועבר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
תחומי עניין מתחרים: חיימה פדרוס, מירי קארון וז'נבייב שאטל הם עובדי BioAuxilium Research, המייצרת את ערכות הבדיקה THUNDER TR-FRET המשמשות במחקר זה. בנוסף, חיימה פדרוס ומיריל קארון הם בעלי המניות של BioAuxilium Research. זה לא משנה את דבקות המחברים בכל מדיניות JoVE על שיתוף נתונים וחומרים.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 96 בארות מיקרו, תחתית שקופה, שטוחה, פוליסטירן, מטופל בתרבית רקמות, סטרילי | קורנינג | 3595 | זוהי הצלחת לתרבית תאים בעת שימוש בפרוטוקול הבדיקה הדו-לוחית. ניתן להשתמש בצלחות אחרות של תרבית תאים של 96 בארות |
| 384 בארות, לבן, בנפח נמוך | PerkinElmer | 6007290 | זוהי הצלחת לזיהוי TR-FRET בעת שימוש בפרוטוקולי הבדיקה של שתי או צלחת אחת. ניתן להשתמש בלוחות אחרים בנפח נמוך, 384 בארות לבנות עם 384 בארות |
| תאים A431 | ATCC | CRL-1555 | |
| חותם מיקרופלייט דבק | PerkinElmer | 6050185 | |
| DMSO | Fisher | D159-4 | |
| Dulbecco' מדיום נשר שונה (DMEM) | Wisent | 319-005-CL | THUNDER TR-FRET תואם למדיום תרבית המכיל פנול אדום |
| EnVision Xcite קורא צלחות Multilabel | PerkinElmer | 2104-0020A | ניתן לבצע את הבדיקות על מגוון קוראי צלחות המצוידים באפשרות TR-FRET |
| צלוחיות מטופלות בתרבית רקמות | |||
| סרום בקר עוברי (FBS) | Wisent | 098-150 | |
| ATCC | CCL-2 | ||
| JAK מעכב 1 | Cayman Chemical | 15146 | |
| שייקר צלחות אורביטלי | אפשרויות רבות זמינות | לא ישים | |
| רקומביננטי אנושי EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| רקומביננטי אנושי IFNα 2b | ProSpec | CYT-460 | |
| רקומביננטי אנושי IL-4 | R& D Systems | 204-IL | |
| Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) | Wisent | 350-007-CL | THUNDER TR-FRET תואם למדיום תרבית המכיל פנול |
| אדום THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + ערכת בדיקת איתות תאים STAT1 TR-FRET | מחקר BioAuxilium Research | KIT-STAT1PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + ערכת בדיקת איתות תאים כוללת STAT3 | BioAuxilium Research | KIT-STAT3PT-500 | |
| THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) ערכת בדיקת איתות תאים TR-FRET | ערכת | מחקר BioAuxilium STAT5PT ערכת מחקר BioAuxilium ערכת מחקר BioAuxilium | |
| טריפסין/EDTA 0.05% | Wisent | 325-542-CL | |
| U266B1 קו תאים | ATCC | TIB-196 | |
| מים טהורים | במיוחד NA | NA | השתמש במים בדרגת Milli-Q (18 MΩ. ס"מ) כדי לדלל את מאגר הליזיס ומאגר הזיהוי |
מקורות
- Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
- Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its brea....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
