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Biochemistry

Saggi di trasferimento di energia di Förster Resonance risolti nel tempo per la misurazione di proteine STAT fosforilate endogene in cellule umane

Published: September 9, 2021 doi: 10.3791/62915
Automatic Translation
1, 1, 1
1BioAuxilium Research

Summary

I protocolli di analisi basati su cellule di trasferimento di energia di risonanza di Förster risolti nel tempo sono descritti per la quantificazione semplice, specifica, sensibile e robusta del trasduttore di segnale fosforilato endogeno e dell'attivatore della trascrizione (STAT) 1/3/4/5/6 proteine in lisati cellulari in un formato a 384 pozzetti.

Abstract

La via di segnalazione Janus chinasi (JAK)/trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione (STAT) svolge un ruolo cruciale nel mediare le risposte cellulari alle citochine e ai fattori di crescita. Le proteine STAT sono attivate dalla fosforilazione tirosina mediata principalmente dai JAB. L'attivazione anomala delle vie di segnalazione STAT è implicata in molte malattie umane, in particolare il cancro e le condizioni immuno-correlate. Pertanto, la capacità di monitorare la fosforilazione della proteina STAT all'interno dell'ambiente di segnalazione cellulare nativo è importante sia per la ricerca accademica che per la scoperta di farmaci. I formati di analisi tradizionali disponibili per quantificare le proteine STAT fosforilate includono il western blotting e il saggio immunoassorbinte enzimatico (ELISA). Questi metodi eterogenei sono laboriosi, a bassa produttività e spesso non affidabili (specifici) nel caso del western blotting. Sono disponibili metodi omogenei (senza lavaggio) ma rimangono costosi.

Qui vengono forniti protocolli dettagliati per la misurazione sensibile, robusta ed economica in un formato a 384 pozzetti di livelli endogeni di STAT1 fosforilato (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641) in lisati cellulari da cellule aderenti o in sospensione utilizzando la nuova piattaforma THUNDER time-resolved Förster resonance energy transfer (TR-FRET). Il flusso di lavoro per il test cellulare è semplice, veloce e progettato per lo screening ad alto rendimento (HTS). Il protocollo di analisi è flessibile, utilizza un campione a basso volume (15 μL), richiede una sola fase di aggiunta del reagente e può essere adattato ad applicazioni a bassa produttività e ad alta produttività. Ogni test immunologico sandwich fosfo-STAT viene convalidato in condizioni ottimizzate con agonisti e inibitori noti e genera i valori attesi di farmacologia e fattore Z. Poiché i saggi TR-FRET sono raziometrici e non richiedono passaggi di lavaggio, forniscono una riproducibilità molto migliore rispetto agli approcci tradizionali. Insieme, questa suite di saggi fornisce nuovi strumenti economici per un'analisi più completa di specifiche proteine STAT fosforilate dopo il trattamento cellulare e lo screening e la caratterizzazione di modulatori specifici e selettivi della via di segnalazione JAK / STAT.

Introduction

La via di segnalazione JAK/STAT svolge un ruolo chiave nel mediare le risposte cellulari a diverse citochine, interferoni, fattori di crescita e molecole correlate1,2. Il legame di questi ligandi a specifici recettori della superficie cellulare provoca l'attivazione di JAK, che a loro volta attivano le proteine STAT mediante fosforilazione di specifici residui di tirosina. La fosforilazione STAT provoca la loro dimerizzazione e traslocazione nel nucleo, dove esercitano il loro effetto sulla trascrizione dei geni bersaglio regolati. La famiglia STAT è composta da sette membri: STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b e STAT6. I membri svolgono un ruolo complesso ed essenziale nella regolazione dei processi cellulari fisiologici, tra cui proliferazione, differenziazione, apoptosi, angiogenesi e regolazione del sistema immunitario. L'attivazione anomala delle vie di segnalazione STAT è implicata in molte malattie umane, in particolare il cancro e le condizioni immuno-correlate3,4. Pertanto, la capacità di valutare la fosforilazione della proteina STAT all'interno dell'ambiente di segnalazione cellulare nativo è importante sia per la ricerca accademica che per la scoperta di farmaci.

Ad oggi, i metodi convenzionali utilizzati per misurare i livelli di proteine fosforilate intracellulari, compresi gli ST, sono basati su anticorpi e includono western blotting, ELISA e citometria a fosfoflusso. Questi metodi eterogenei sono laboriosi, dispendiosi in termini di tempo, soggetti a errori, a bassa produttività e spesso inaffidabili (ad esempio, problemi di specificità) nel caso del western blotting5. Al contrario, i saggi omogenei richiedono meno passaggi sperimentali, utilizzano volumi di campione più piccoli e sono suscettibili di HTS. Esistono cinque piattaforme di immunodosaggio omogenee basate su cellule disponibili in commercio che possono essere utilizzate per monitorare quantitativamente la fosforilazione JAK-dipendente degli ST nei lisati cellulari: SureFire, HTRF, LANCE, LanthaScreen e Lumit. Ognuna di queste piattaforme ha i suoi vantaggi e svantaggi.

SureFire si basa sulla tecnologia di canalizzazione dell'ossigeno luminescente, che utilizza perline di donatore e accettore rivestite per catturare specificamente un paio di anticorpi, uno dei quali è biotinilato. In presenza di proteine fosforilate, i due anticorpi portano le perle del donatore e dell'accettore nelle immediate vicinanze, consentendo la generazione di un segnale chemiluminescente6. Sebbene versatile e sensibile, questa tecnologia è costosa, è influenzata dalla biotina nel terreno di coltura, è molto sensibile alla temperatura ambiente e alla luce e richiede un lettore speciale per il rilevamento. HTRF e LANCE sono entrambi basati sulla tecnologia TR-FRET che utilizza complessi ioni di lantanidi luminescenti di lunga durata (chelati di europio o terbio o criptato di europio) come molecole donatrici e fluorofori rosso lontano come molecole accettori7. Quando due anticorpi protein-specifici etichettati con molecole donatori o accettori vengono portati nelle immediate vicinanze, si verifica FRET, causando un aumento della fluorescenza dell'accettore e una diminuzione della fluorescenza del donatore. Questi segnali fluorescenti di lunga durata possono essere misurati in modo tempo e raziometrico per ridurre le interferenze del test e aumentare la qualità dei dati. Altri vantaggi di TR-FRET sono che non è sensibile alla luce, consente letture ripetute e presenta una lunga stabilità del segnale. Mentre TR-FRET è ampiamente implementato in HTS grazie alla sua versatilità, sensibilità e elevata robustezza, tutte le piattaforme di analisi commerciali basate su TR-FRET sono costose, precludendo così la sua ampia adozione in laboratori accademici e piccoli laboratori industriali. Il test LanthaScreen utilizza anche una lettura basata su TR-FRET, ma si basa su una linea cellulare U2OS ingegnerizzata che esprime stabilmente la proteina fluorescente verde (GFP)-STAT1 combinata con un anticorpo STAT1 fosfo-specifico marcato con terbio8. Oltre ad essere limitato in termini di scelta delle proteine di segnalazione, questo metodo richiede l'acquisto di costose linee cellulari trasfettate, riducendone l'applicabilità e aumentando la possibilità di artefatti sperimentali. Lumit è una piattaforma di immunodosaggio bioluminescente generico che utilizza anticorpi secondari (anti-topo e anti-coniglio) chimicamente etichettati con le piccole e grandi subunità NanoBit di NanoLuc Luciferase9. Il legame di due anticorpi primari alla proteina bersaglio porta gli anticorpi secondari in prossimità per formare un enzima attivo che genera un segnale di luminescenza. Mentre la luminescenza è generalmente una lettura sensibile e robusta, il requisito di anticorpi primari allevati in due specie diverse limita le scelte per la progettazione del saggio. Inoltre, l'uso di anticorpi secondari in matrici di campioni complessi può essere soggetto a interferenze di analisi.

Pertanto, esiste ancora la necessità di una piattaforma di analisi basata su cellule affidabile, rapida ma conveniente per misurare le singole proteine STAT fosforilate e totali in modo compatibile con HTS. Per rispondere a questa esigenza, è stata sviluppata una nuova piattaforma di analisi immunologica basata su cellule ad alto rendimento basata su una tecnologia TR-FRET avanzata (THUNDER) e progettata per consentire una misurazione semplice, sensibile, robusta ed economica delle proteine intracellulari espresse endogenamente (fosforilate o totali) nei lisati cellulari. I vantaggi di questa tecnologia derivano dalla combinazione di una coppia FRET donatore/accettore che presenta un'eccezionale compatibilità spettrale e un segnale TR-FRET, anticorpi rigorosamente convalidati e tamponi di lisi ottimizzati. Questi test sono formattati come test immunologici sandwich e utilizzano un flusso di lavoro semplice in tre fasi (Figura 1). Le cellule vengono prima trattate per modulare la fosforilazione proteica e poi lisate con lo specifico tampone di lisi fornito nel kit. La proteina STAT fosforilata target o totale nel lisato cellulare viene rilevata in una singola fase di aggiunta e incubazione del reagente con una coppia di anticorpi marcati con fluoroforo che riconoscono epitopi distinti sulla proteina bersaglio (Figura 2). Un anticorpo è etichettato con un donatore di chelato di europio (Eu-Ab1), mentre il secondo anticorpo è etichettato con un fluoroforo accettore rosso lontano (FR-Ab2). I due anticorpi marcati si legano alla proteina in soluzione, portando le due etichette nelle immediate vicinanze. L'eccitazione del donatore chelato di europio a 320 o 340 nm innesca un FRET all'accettore, che emette un segnale TR-FRET di lunga durata a 665 nm proporzionale alla concentrazione di proteina bersaglio (fosforilata o totale) nel lisato cellulare.

Figure 1
Figura 1: Flusso di lavoro del saggio TR-FRET. Il flusso di lavoro consiste in tre fasi: trattamento cellulare, lisi cellulare e rilevamento delle proteine utilizzando TR-FRET. Nel protocollo di analisi a due piastre, i lisati vengono trasferiti su una piastra di rilevamento bianca a 384 pozzetti, mentre nel protocollo a una piastra, tutti i passaggi sono condotti nella stessa piastra di rilevamento bianca a 384 pozzetti (protocollo all-in-one-well). Indipendentemente dal protocollo di analisi utilizzato, il rilevamento delle proteine viene eseguito nello stesso volume totale (20 μL per pozzetto). Abbreviazione: TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Principio del test immunologico sandwich TR-FRET. Un anticorpo è etichettato con il donatore di chelato di europio (Eu-Ab1) e il secondo con l'accettore di fluoroforo piccolo rosso lontano (FR-Ab2). I due anticorpi marcati si legano specificamente a epitopi distinti sulla proteina bersaglio (fosforilata o totale) nel lisato cellulare, portando i due fluorofori nelle immediate vicinanze. L'eccitazione del donatore chelato di europio a 320 o 340 nm innesca un FRET dal donatore alle molecole accettori, che a loro volta emettono un segnale a 665 nm. Questo segnale è proporzionale alla concentrazione di proteine nel lisato cellulare. In assenza della proteina bersaglio specifica, i fluorofori donatore e accettore sono troppo distanti l'uno dall'altro perché si verifichi FRET. Abbreviazioni: FRET = Förster resonance energy transfer; TR-FRET = FRET risolto nel tempo; Ab = anticorpo; FR = rosso lontano; Eu - Chelato di europio; P = fosforilazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Qui vengono forniti protocolli dettagliati per misurare, in un formato a 384 pozzetti, i livelli intracellulari di STAT1 fosforilato (Y701), STAT3 (Y705), STAT4 (Y693), STAT5 (Y694/Y699) e STAT6 (Y641), insieme a STAT1, STAT3, STAT5 e STAT6 totali, in lisati cellulari da cellule aderenti o in sospensione utilizzando la piattaforma THUNDER TR-FRET. Questi protocolli definiscono i passaggi per il trattamento cellulare, la lisi e il rilevamento di proteine bersaglio basate su TR-FRET utilizzando un protocollo di trasferimento a due piastre o un protocollo all-in-one-well a una piastra. Questi saggi basati su cellule sono applicati per determinare il profilo farmacologico di attivatori e inibitori noti della via JAK/STAT. La robustezza e l'idoneità dei saggi selezionati per HTS sono dimostrate. Infine, vengono discussi esperimenti chiave per l'ottimizzazione del test, insieme a raccomandazioni per la risoluzione dei problemi del test.

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Protocol

1. Coltura cellulare

  1. Mantenere le cellule in un incubatore e coltura a CO2 umidificata a 37 °C / 5% con DMEM integrato con siero bovino fetale al 10% (FBS) (cellule HeLa e A431) o RPMI integrato con il 15% fbS (cellule U266B1). Coltiva le cellule fino a quando non raggiungono il 70-80% di confluenza, quindi tripsinilizzale e passale o usale per i test.
    NOTA: i terreni di coltura contenevano rosso fenolo. Nessuna fame sierica è stata condotta per nessuna linea cellulare prima di condurre i test.

2. Titolazione dello stimolatore o dell'inibitore utilizzando il protocollo di dosaggio a due piastre con cellule aderenti

NOTA: questa procedura descrive come determinare le potenze dello stimolatore o dell'inibitore generando una curva concentrazione-risposta da una serie di diluizione del composto in esame.

  1. Semina cellulare
    1. Erogare 50 μL di cellule alla densità pre-ottimizzata (40.000 cellule HeLa/pozzetto sia per STAT3 che per STAT6; 75.000 cellule A431/pozzetto per STAT5) in una piastra trattata con coltura tissutale a 96 pozzetti nel terreno di coltura appropriato. Incubare durante la notte a 37 °C/5% DI CO2.
      NOTA: è necessario determinare la densità cellulare ottimale e il tempo di incubazione della coltura.
  2. Diluizioni di composti in esame
    1. Preparare serie intermedie di diluizione 2x di composti di prova diluendo in serie i composti (diluizioni a intervalli di mezzo log) attraverso 12 pozzetti di una piastra di polipropilene a 96 pozzetti in un mezzo privo di siero.
      NOTA: si raccomanda di condurre una curva concentrazione-risposta a 12 punti, intervallo di mezzo log, almeno duplicata per una stima accurata dell'EC50 o dell'IC50.
    2. In alternativa, per i composti di prova idrofobici solubili in dimetilsolfossido (DMSO), eseguire le diluizioni iniziali in DMSO al 100% e quindi diluire la serie di diluizione composta in mezzo privo di siero.
      NOTA: la tolleranza del saggio al DMSO deve essere stabilita prima di eseguire una titolazione del composto di prova nel veicolo DMSO. È importante mantenere uguali concentrazioni di solvente tra cellule trattate e non trattate. Inoltre, quando si testano le diluizioni seriali dei composti, le concentrazioni di solvente devono rimanere sempre costanti in tutta la serie di diluizione.
  3. Trattamento cellulare
    1. Per la stimolazione cellulare, aggiungere 50 μL di mezzo privo di siero da solo (cellule non trattate) o contenente lo stimolatore (2x).
    2. Incubare per il tempo pre-ottimizzato a temperatura ambiente (RT) o 37 °C (interferone (IFN) α2b/20 min a RT per STAT3; fattore di crescita epidermico (EGF)/10 min a RT per STAT5; interleuchina (IL)-4/20 min a RT per STAT6). Passare quindi alla sezione 2.4.
      NOTA: è necessario determinare la temperatura di incubazione ottimale.
    3. Per l'inibizione cellulare, aggiungere 25 μL di mezzo libero da siero da solo (cellule non trattate) o contenente l'inibitore (4x).
    4. Incubare per il tempo pre-ottimizzato a RT o 37 °C (inibitore JAK 1/30 min a RT per STAT3 e STAT6; Erlotinib/15 min a RT per STAT5).
    5. Aggiungere 25 μL di mezzo privo di siero da solo (cellule non trattate) o contenente lo stimolatore (4x) al suo EC80.
    6. Incubare per il tempo pre-ottimizzato a RT o 37 °C (stesse condizioni del passaggio 2.3.2).
  4. Lisi cellulare
    1. Preparare il buffer di lisi integrato 1x specifico del kit come indicato dal produttore.
      NOTA: È obbligatorio integrare il tampone di lisi 1x con il cocktail inibitore della fosfatasi 100x diluito ad una concentrazione finale di 1x. Il 1x Tampone di Lisi Integrato contiene 1 mM di fluoruro di sodio, 2 mM di ortovanadato di sodio e 2 mM di beta-glicerofosfato. Altri inibitori della fosfatasi non sono necessari e devono essere evitati. I tamponi di lisi e gli inibitori della fosfatasi diversi da quelli inclusi nel kit non sono raccomandati in quanto potrebbero contenere ingredienti che potrebbero interferire con la misurazione.
    2. Rimuovere con cura ed eliminare il terreno di coltura cellulare aspirando il surnatante.
    3. Aggiungere immediatamente 50 μL di 1x tampone di lisi integrato.
      NOTA: il volume del buffer di lisi (25-50 μL) può essere ottimizzato.
    4. Incubazione per 30 minuti a RT sotto agitazione (agitatore a piastre orbitali impostato a 400 giri / min; agitazione moderata).
      NOTA: il tempo di incubazione della lisi (30-60 min) può essere ottimizzato. I lisati possono essere utilizzati immediatamente per il rilevamento di proteine bersaglio o congelati a -80 °C.
  5. Rilevamento TR-FRET
    1. Preparare il 4x Antibody Detection Mix in 1x Detection Buffer come indicato dal produttore.
    2. In questa fase di trasferimento, pipettare con cura 15 μL di lisato cellulare dalla piastra di coltura a 96 pozzetti a un pozzo di una micropiastra bianca a basso volume da 384 pozzetti.
    3. Aggiungere 15 μL di lisato di controllo positivo e 15 μL di 1x tampone di lisi (controllo negativo) per separare i pozzetti di analisi.
    4. Aggiungere 5 μL di 4x Antibody Detection Mix (Eu-Ab1/FR-Ab2 per il rilevamento della fosfo-proteina o Eu-Ab3/FR-Ab4 per il rilevamento della proteina totale) a ciascuno dei pozzetti di analisi.
    5. Coprire la piastra con un sigillante a piastre e incubare per 1 ora fino a notte a RT, a seconda del test (vedere la scheda tecnica corrispondente).
      NOTA: il tempo di lettura ottimale deve essere ottimizzato per ogni test e linea cellulare. La piastra può essere letta più volte senza un effetto negativo sulle prestazioni del test.
    6. Rimuovere il sigillante per piastre adesive e leggere la piastra su un lettore di micropiastre compatibile TR-FRET.
      NOTA: si raccomandano fluorometri a base di filtro, anche se è possibile utilizzare alcuni strumenti monocromatori. Verificare che sia installato il modulo ottico appropriato (filtri e specchio) per TR-FRET. Utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione di 320 o 340 nm per eccitare il chelato di europio. Leggere i saggi sia a 615 nm (o 620 nm) che a 665 nm per rilevare sia l'emissione dall'europio donatore che dal fluoroforo accettore, rispettivamente. Le impostazioni dello strumento dipenderanno dal particolare lettore. I dati qui presentati sono stati ottenuti utilizzando l'eccitazione basata su lampada, il ritardo di 90 μs, il tempo di integrazione di 300 μs e 100 lampi per pozzetto. Il test fosfo-STAT4, tuttavia, è stato letto utilizzando l'eccitazione laser per generare rapporti segnale-sfondo (S / B) più elevati.

3. Titolazione dello stimolatore o dell'inibitore utilizzando il protocollo di dosaggio a due piastre con cellule in sospensione

  1. Diluizione dei composti in esame
    1. Preparare serie intermedie di diluizione 2x di composti in esame come descritto nei passaggi 2.2.1 e 2.2.2.
  2. Semina e trattamento cellulare
    1. Erogare 20 μL di cellule alla densità pre-ottimizzata (200.000 cellule U266B1/pozzetto per STAT1; 400.000 cellule U266B1/pozzetto per STAT4) in una piastra trattata con coltura tissutale a 96 pozzetti nel terreno di coltura appropriato. Procedere direttamente al trattamento cellulare o incubare 2-4 ore a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: questo passaggio deve essere ottimizzato per diversi tipi di celle.
    2. Per la stimolazione cellulare, aggiungere 20 μL di mezzo privo di siero da solo (cellule non trattate) o contenente lo stimolatore (2x).
    3. Incubare per il tempo pre-ottimizzato a RT o 37 °C (IFNα2b/15 min a RT per STAT1; IFNα2b/25 min a 37 °C per STAT4). Procedere quindi alla sezione 3.3.
      NOTA: è necessario determinare la temperatura di incubazione ottimale.
    4. Per l'inibizione cellulare, aggiungere 10 μL di mezzo libero da siero da solo (cellule non trattate) o contenente l'inibitore (4x).
    5. Incubare per il tempo pre-ottimizzato a RT o 37 °C (inibitore JAK 1/30 min a RT per STAT1 e STAT4).
    6. Aggiungere 10 μL di mezzo privo di siero da solo (cellule non trattate) o contenente lo stimolatore (4x) al suo EC80.
    7. Incubare per il tempo pre-ottimizzato a RT o 37 °C (stesse condizioni del punto 3.2.3).
  3. Lisi cellulare
    1. Preparare il buffer di lisi integrato 5x specifico del kit come indicato dal produttore.
      NOTA: È obbligatorio integrare il tampone di lisi 5x con il cocktail inibitore della fosfatasi 100x diluito fino a una concentrazione finale di 5x. Il 5x Tampone di Lisi Integrato contiene 5 mM di fluoruro di sodio, 10 mM di ortovanadato di sodio e 10 mM di beta-glicerofosfato. Altri inibitori della fosfatasi non sono necessari e devono essere evitati.
    2. Aggiungere 10 μL di 5x tampone di lisi integrato.
    3. Incubazione per 30 minuti a RT sotto agitazione (agitatore a piastre orbitali impostato a 400 giri / min; agitazione moderata).
      NOTA: il tempo di incubazione della lisi (30-60 min) può essere ottimizzato. I lisati possono essere utilizzati immediatamente per il rilevamento di proteine bersaglio o congelati a -80 °C.
  4. Rilevamento TR-FRET
    1. Dopo la lisi cellulare, eseguire la fase di rilevamento TR-FRET come descritto nel paragrafo 2.5 per il protocollo di analisi a 2 piastre per le cellule aderenti.

4. Titolazione dello stimolatore utilizzando il protocollo di analisi a una piastra con cellule aderenti o in sospensione

  1. Diluizione dei composti in esame
    1. Preparare serie intermedie di diluizione di composti di prova a 3x diluendo in serie i composti (diluizioni a intervalli di mezzo log) attraverso 12 pozzetti di una piastra di polipropilene a 96 pozzetti in un mezzo privo di siero.
  2. Semina e trattamento cellulare
    1. Erogare 8 μL di cellule alla densità pre-ottimizzata (160.000 cellule U266B1/pozzetto per STAT4; 80.000 cellule HeLa/pozzetto per STAT6), nel terreno di coltura privo di siero appropriato, in una piastra bianca a basso volume da 384 pozzetti. Procedere direttamente al trattamento cellulare o incubare 2-4 ore a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: Il requisito di un periodo di incubazione in coltura cellulare prima del trattamento deve essere determinato per diversi tipi di cellule.
    2. Per la stimolazione cellulare, aggiungere 4 μL di mezzo privo di siero da solo (cellule non trattate) o contenente lo stimolatore (3x).
    3. Incubare per il tempo pre-ottimizzato a temperatura ambiente o 37 °C (IFNα2b/25 min a 37°C per STAT4; IL-4/20 min a 37°C per STAT6). Passare quindi alla sezione 4.3.
  3. Lisi cellulare
    1. Preparare il buffer di lisi integrato 5x specifico del kit come indicato dal produttore.
      NOTA: È obbligatorio integrare il tampone di lisi 5x con il cocktail inibitore della fosfatasi 100x diluito fino a una concentrazione finale di 5x.
    2. Aggiungere 3 μL di 5x Buffer di Lisi Integrato.
    3. Incubare per 30 minuti a RT sotto agitazione (agitatore a piastra orbitale a 400 giri / min).
      NOTA: il tempo di incubazione della lisi (30-60 min) può essere ottimizzato. I lisati possono essere utilizzati immediatamente o congelati a 80 °C.
  4. Rilevamento TR-FRET
    1. Aggiungere 15 μL di lisato di controllo positivo (non diluito) e 15 μL di 1x tampone di lisi integrato (controllo negativo) a pozzi di analisi separati.
    2. Aggiungere 5 μL di 4x Antibody Detection Mix (Eu-Ab1/FR-Ab2 per la fosfo-proteina o Eu-Ab3-/FR-Ab4 per la proteina totale) preparato in 1x Detection Buffer a ciascuno dei pozzi di analisi.
    3. Coprire la piastra con un sigillante a piastre e incubare per 1 ora fino a notte a RT, a seconda del test.
      NOTA: il tempo di lettura ottimale deve essere ottimizzato per ogni test e linea cellulare. La piastra può essere letta più volte senza un effetto negativo sulle prestazioni del test.
    4. Rimuovere il sigillante per piastre adesive. Leggere la piastra su un lettore di micropiastre compatibile con TR-FRET.

5. Analisi dei dati

  1. Calcolare il rapporto TR-FRET per ciascun pozzo utilizzando la seguente formula (1):
    Equation 1 (1)
    NOTA: poiché il segnale TR-FRET viene letto in modalità risolta nel tempo, la sottrazione di sfondo di solito non è necessaria. Se viene condotta la sottrazione di fondo, utilizzare i pozzetti privi di cellule contenenti il buffer di lisi integrato 1x (controllo negativo) per la sottrazione di sfondo. Determinare il rapporto medio TR-FRET dai pozzetti privi di cellule e quindi sottrarre questo valore dal rapporto TR-FRET di ciascun pozzo.
  2. Per le curve concentrazione-risposta, analizzare i dati secondo una regressione non lineare utilizzando l'equazione logistica a 4 parametri (curva dose-risposta sigmoidale con pendenza variabile) e una ponderazione dei dati 1/Y2 per generare valori EC50 o IC50 .
  3. Per l'esperimento del fattore Z' analizzare i dati secondo la seguente formula (2)10
    Equation 2 (2)
    Dove μ e σ sono i valori medi e le deviazioni standard per il controllo positivo (p; cellule stimolate) e il controllo negativo (n; cellule non trattate), rispettivamente.

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Representative Results

Ogni test THUNDER TR-FRET è stato validato farmacologicamente trattando cellule aderenti (HeLa o A431) o in sospensione (U266B1) con attivatori o inibitori specifici della via JAK/STAT e quindi misurando i livelli di specifiche ST fosforilate e totali, se applicabile. I saggi sono stati condotti in formato 384 pozzetti utilizzando il protocollo di trasferimento a due piastre e condizioni di analisi pre-ottimizzate. La Figura 3, la Figura 4, la Figura 5, la Figura 6 e la Figura 7 riassumono le curve rappresentative concentrazione-risposta ottenute per tutti i saggi STAT. Nel complesso, tutte le curve concentrazione-risposta dello stimolatore e dell'inibitore per i saggi fosfo-STAT hanno mostrato robusti segnali TR-FRET, ampi intervalli dinamici, basso coefficiente di variazione inter-pozzo (tipicamente ≤5%) e rapporti S/B accettabili. I valori EC50 e IC50 qui riportati rientrano nell'intervallo dei valori attesi.

Il trattamento delle cellule con gli attivatori JAK IFNα2b (fosfo-STAT1, fosfo-STAT3 e fosfo-STAT4), IL-4 (fosfo-STAT6) ed EGF (fosfo-STAT5) ha mostrato l'aumento dipendente dalla concentrazione previsto della fosforilazione STAT in presenza di specifici residui di tirosina, mentre le corrispondenti proteine STAT totali (STAT1, STAT3, STAT5 e STAT6) sono rimaste stabili (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura 7 , Pannello A). La diminuzione del segnale (inferiore al 20%) osservata per STAT5 totale con l'aumento della fosforilazione di STAT5 è prevista ed è dovuta all'ostacolo sterico, in cui la fosforilazione di STAT5 ostacola il legame di uno dei due anticorpi anti-totale STAT5 al rispettivo antigene. I valori EC50 erano nell'intervallo sub-nanomolare per IFNα2b e IL-4 (da 0,083 a 0,47 nM) e nell'intervallo nanomolare basso per EGF (12 nM). Questi valori sono in accordo con i dati pubblicati6,11.

Per confermare che il segnale indotto dagli attivatori è stato mediato dall'attivazione di recettori endogeni, le cellule sono state pretrattate con concentrazioni crescenti di JAK Inhibitor 1 (un inibitore pan JAK) o Erlotinib (un inibitore della tirosin-chinasi EGFR) prima della stimolazione submassimale (EC80) con gli attivatori STAT. Come anticipato, sia l'inibitore JAK 1 che Erlotinib hanno inibito i corrispondenti livelli fosfo-STAT in modo dipendente dalla concentrazione, con valori IC50 compresi tra il nanomolare basso e l'intervallo nanomolare elevato per l'inibitore JAK 1 (29-759 nM) e nell'intervallo nanomolare basso per Erlotinib (10 nM) (Figura 3, Figura 4, Figura 5, Figura 6 e Figura 7, Pannello B). I valori IC50 sono coerenti con i dati pubblicati11,12,13. Come nel caso degli esperimenti di stimolazione, i livelli della corrispondente STAT totale non sono stati influenzati da nessuno dei due trattamenti. Nel loro insieme, questi risultati dimostrano la specificità di ciascun test per la sua proteina STAT bersaglio endogena (fosforilata o totale) e la loro capacità di profilare attivatori o inibitori che presentano una gamma di potenze.

I saggi in cui l'intero flusso di lavoro (trattamento cellulare, lisi e rilevamento delle proteine) viene condotto in un singolo pozzetto di una piastra a 384 pozzetti senza una fase di trasferimento sono più adatti per HTS. Di conseguenza, i saggi fosfo-STAT4 e fosfo-STAT6 sono stati eseguiti utilizzando il protocollo a una piastra. I dati rappresentativi ottenuti in condizioni ottimizzate sono riepilogati nella Figura 8 e nella Figura 9. Stimolazione di STAT4 fosforilato mediante IFNα2b in una linea cellulare in sospensione (U266B1; Figura 8) o STAT6 fosforilato da IL-4 in una linea cellulare aderente (HeLa; Figura 9) è stato ottenuto con rapporti S/B accettabili e valori EC50 coerenti con quelli ottenuti utilizzando il protocollo a due piastre. Questi dati mostrano che i saggi fosfo-STAT possono essere adattati con successo da un protocollo di trasferimento a due piastre a un protocollo all-in-one-well a una piastra.

Il fattore Z è comunemente usato nella comunità HTS per la valutazione dell'idoneità e della robustezza di un test per HTS10. Per convalidare ulteriormente i saggi fosfo-STAT, gli studi preliminari sul fattore Z sono stati condotti manualmente utilizzando il protocollo a due piastre. Per valutare la stabilità del test, le piastre sono state lette dopo un'incubazione di 4 ore e un'incubazione notturna. I risultati ottenuti per i saggi fosfo-STAT1 e fosfo-STAT3, utilizzando rispettivamente una linea cellulare in sospensione (U266B1) o una linea cellulare aderente (HeLa), sono riassunti nella Figura 10. I valori calcolati del fattore Z erano 0,85 per il fosfo-STAT1 e 0,79 per il fosfo-STAT3. Dopo l'incubazione notturna, i valori del fattore Z sono rimasti stabili (0,83 per il fosfo-STAT1 e 0,78 per il fosfo-STAT3). Valori simili del fattore Z sono stati ottenuti per gli altri saggi fosfo-STAT (STAT4: 0,79; STAT5: 0,78; STAT6: 0,63). Un test basato su cellule con un fattore Z ≥ 0,40 è considerato adatto per HTS15. Di conseguenza, questi risultati dimostrano la robustezza di questi saggi fosfo-STAT per applicazioni HTS.

Figure 3
Figura 3: Rilevazione della modulazione fosfo-STAT1 (Y701) in cellule U266B1. Le cellule (200.000 cellule/pozzetto) seminate in una piastra di coltura a 96 pozzetti sono state trattate con concentrazioni crescenti di (A) IFNα2b per 15 minuti a RT o (B) Inibitore JAK 1 per 30 minuti a RT, quindi con 1 nM (EC80) di IFNα2b per 15 minuti a RT. Dopo la lisi, i lisati sono stati trasferiti in una piastra bianca a basso volume da 384 pozzetti, seguita dall'aggiunta del mix di rilevamento degli anticorpi. La piastra è stata incubata per 4 ore a RT e poi letta su un lettore compatibile con TR-FRET. I dati sono mostrati come la media dei pozzetti triplicati per punto di analisi. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Alcune barre di errore sono più piccole della dimensione del simbolo. Abbreviazioni: STAT = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione; IFN = interferone; RT = temperatura ambiente; JAK = Janus chinasi; TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo; S/B = rapporto segnale/sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Rilevazione di fosfo-STAT3 (Y705) e modulazione totale di STAT3 in cellule HeLa. Le cellule (40.000 cellule / pozzetto) coltivate durante la notte in una piastra di coltura a 96 pozzetti sono state trattate con concentrazioni crescenti di (A) IFNα2b per 20 minuti a RT o (B) Inibitore JAK 1 per 30 minuti a RT quindi con 1,5 nM di IFNα2b per 20 minuti a RT. Dopo la rimozione e la lisi dei fluidi, i lisati sono stati trasferiti in una piastra bianca a basso volume a 384 pozzetti, seguita dall'aggiunta del mix di rilevamento degli anticorpi. La piastra è stata incubata per 4 ore a RT e poi letta su un lettore compatibile con TR-FRET. I dati sono mostrati come la media dei pozzetti triplicati per punto di analisi. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Alcune barre di errore sono più piccole della dimensione del simbolo. Abbreviazioni: STAT = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione; IFN = interferone; RT = temperatura ambiente; JAK = Janus chinasi; TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo; S/B = rapporto segnale/sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Rilevazione della modulazione fosfo-STAT4 (Y693) in cellule U266B1. Le cellule (400.000 cellule/pozzetto) seminate in una piastra di coltura a 96 pozzetti sono state trattate con concentrazioni crescenti di (A) IFNα2b per 25 min a 37 °C o (B) inibitore JAK 1 per 30 minuti a RT, quindi con 1 nM di IFNα2b per 25 min a 37 °C. Dopo la rimozione e la lisi dei fluidi, i lisati sono stati trasferiti in una piastra bianca a basso volume a 384 pozzetti, seguita dall'aggiunta del mix di rilevamento degli anticorpi. La piastra è stata incubata durante la notte a RT e poi letta su un lettore compatibile con TR-FRET. I dati sono mostrati come la media dei pozzetti triplicati per punto di analisi. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Alcune barre di errore sono più piccole della dimensione del simbolo. Abbreviazioni: STAT = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione; IFN = interferone; RT = temperatura ambiente; JAK = Janus chinasi; TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo; S/B = rapporto segnale/sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Rilevazione di fosfo-STAT5 (Y694/Y699) e modulazione totale di STAT5 in cellule A431. Le cellule (75.000 cellule / pozzetto) coltivate durante la notte in una piastra di coltura a 96 pozzetti sono state trattate con concentrazioni crescenti di (A) EGF per 10 minuti a RT o (B) Erlotinib per 15 minuti a RT, quindi con 73 nM di EGF per 10 minuti a RT. Dopo la rimozione e la lisi dei fluidi, i lisati sono stati trasferiti in una piastra bianca a basso volume a 384 pozzetti, seguita dall'aggiunta del mix di rilevamento degli anticorpi. La piastra è stata incubata durante la notte a RT e poi letta su un lettore compatibile con TR-FRET. I dati sono mostrati come la media dei pozzetti triplicati per punto di analisi. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Alcune barre di errore sono più piccole della dimensione del simbolo. Abbreviazioni: STAT = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione; EGF = fattore di crescita epidermico; RT = temperatura ambiente; TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo; S/B = rapporto segnale/sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7: Rilevazione della fosfo-STAT6 (Y641) e della modulazione totale di STAT6 in cellule HeLa. Le cellule (40.000 cellule / pozzetto) coltivate durante la notte in una piastra di coltura a 96 pozzetti sono state trattate con concentrazioni crescenti di (A) IL-4 per 20 minuti a RT o (B) Inibitore JAK 1 per 30 minuti a RT, quindi con 0,5 nM di IL4 per 20 minuti a RT. Dopo la rimozione e la lisi dei fluidi, i lisati sono stati trasferiti in una piastra bianca a basso volume a 384 pozzetti, seguita dall'aggiunta del mix di rilevamento degli anticorpi. La piastra è stata incubata per 4 ore a RT e poi letta su un lettore compatibile con TR-FRET. I dati sono mostrati come la media dei pozzetti triplicati per punto di analisi. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Alcune barre di errore sono più piccole della dimensione del simbolo. Abbreviazioni: STAT = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione; IL = interleuchina; JAK = Janus chinasi; RT = temperatura ambiente; TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo; S/B = rapporto segnale/sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8: Rilevamento della stimolazione fosfo-STAT4 (Y693) in cellule U266B1 con il protocollo a una piastra. Le cellule (160.000 cellule/pozzetto) seminate in una piastra bianca a basso volume a 384 pozzetti sono state immediatamente trattate con concentrazioni crescenti di IFNα2b per 25 minuti a 37 °C. Dopo la lisi, l'Antibody Detection Mix è stato aggiunto direttamente al lisato. La piastra è stata incubata durante la notte a RT e poi letta su un lettore compatibile con TR-FRET utilizzando una lampada flash o un'eccitazione laser. I dati sono mostrati come la media dei pozzetti triplicati per punto di analisi. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Alcune barre di errore sono più piccole della dimensione del simbolo. Abbreviazioni: STAT = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione; IFN = interferone; RT = temperatura ambiente; TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo; S/B = rapporto segnale/sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Rilevazione della stimolazione fosfo-STAT6 (Y641) in cellule HeLa con il protocollo a una piastra. Le cellule (80.000 cellule / pozzetto) seminate in una piastra bianca a basso volume da 384 pozzetti sono state immediatamente trattate con concentrazioni crescenti di IL-4 per 20 minuti a RT. Dopo la lisi, l'Antibody Detection Mix è stato aggiunto direttamente al lisato. La piastra è stata incubata 4 ore a RT e poi letta su un lettore compatibile con TR-FRET. I dati sono mostrati come la media dei pozzetti triplicati per punto di analisi. Le barre di errore indicano la deviazione standard. Alcune barre di errore sono più piccole della dimensione del simbolo. Abbreviazioni: STAT = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione; IL = interleuchina; RT = temperatura ambiente; TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo; S/B = rapporto segnale/sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 10
Figura 10: Studio di variabilità intraplacca dei saggi fosfo-STAT1 (Y701) e fosfo-STAT3 (Y705). (A) Saggio fosfo-STAT1: le cellule in sospensione (200.000 cellule U266B1/pozzetto) sono state trattate con 10 nM di IFNα2b per 15 minuti o solo con mezzo privo di siero (controlli bassi). (B) Saggio fosfo-STAT3: le cellule aderenti (20.000 cellule HeLa/pozzetto) sono state trattate con 5 nM di IFNα2b per 20 minuti o con il solo mezzo privo di siero. Per entrambi i test, il segnale TR-FRET è stato letto dopo 4 ore di incubazione. Abbreviazioni: STAT = trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione; IFN = interferone; TR-FRET = trasferimento di energia di risonanza di Förster risolto nel tempo; S/B = rapporto segnale/sfondo; CV = coefficiente di variazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Rispetto ai metodi convenzionali per l'analisi delle fosfoproteine come il western blotting e i metodi basati su ELISA, il flusso di lavoro per un test cellulare THUNDER TR-FRET è semplice e veloce, utilizza un campione a basso volume (15 μL), è progettato per HTS in un formato a 384 pozzetti ed è altamente suscettibile all'automazione. Il protocollo di analisi è flessibile e può essere facilmente adattato ad applicazioni a throughput medio e alto. I saggi possono essere eseguiti utilizzando un protocollo di trasferimento a due piastre o un protocollo a piastra a 384 pozzetti. Nel protocollo di trasferimento a due piastre, le cellule vengono seminate, trattate e lisate in una piastra di coltura cellulare e i lisati vengono successivamente trasferiti in una piastra di rilevamento bianca separata (piastra a mezza area da 96 pozzetti o 384 pozzetti) per l'analisi. In un protocollo a piastra a un pozzo, l'intero flusso di lavoro viene condotto nello stesso pozzo, eliminando la necessità di una fase di trasferimento del liquido. I saggi potrebbero essere facilmente adattati al formato a 1536 pozzetti riducendo il volume proporzionalmente. Indipendentemente dal protocollo di analisi, ci sono solo tre soluzioni reagenti da preparare e nessuna fase di lavaggio, e i test possono essere eseguiti seguendo un protocollo "solo aggiunta", che richiede un tempo minimo di intervento.

Un passo fondamentale nell'esecuzione di qualsiasi test basato su cellule è l'ottimizzazione delle condizioni di coltura e trattamento cellulare16. Sia il numero di cellule che le condizioni di trattamento richiedono un'attenta ottimizzazione prima di eseguire un test, poiché questi parametri chiave spesso variano per ogni linea cellulare e ogni fosfoproteina. L'ottimizzazione di questi parametri consente di massimizzare la finestra di analisi, ottenendo una prestazione ottimale con un elevato rapporto S/B e un basso coefficiente di variazione inter-pozzo, e garantendo la robustezza e la riproducibilità dei risultati. Il numero di cellule, la fame sierica (se del caso) e il tempo di stimolazione o inibizione (a temperatura ambiente o 37 °C) devono essere ottimizzati per ciascuna linea cellulare e proteina bersaglio. Numeri di cellule troppo alti o troppo bassi possono influenzare negativamente la modulazione delle vie di segnalazione intracellulare. Densità di semina cellulare di 40.000-80.000 cellule / pozzetto per le cellule aderenti o 100.000-200.000 cellule / pozzo per le cellule in sospensione sono generalmente accettabili per la maggior parte delle linee cellulari. Da notare, il periodo di tempo ottimale per la stimolazione e l'inibizione può variare ampiamente tra le linee cellulari e le proteine bersaglio, da pochi minuti a diverse ore. Pertanto, si consiglia vivamente di studiare il corso temporale per determinare i tempi ottimali di incubazione della stimolazione e dell'inibizione, idealmente sia a temperatura ambiente che a 37 °C, poiché la temperatura di incubazione influisce sulla cinetica della stimolazione proteica target.

La risoluzione dei problemi di un test basato su cellule può essere difficile e richiedere molto tempo a causa dei numerosi passaggi coinvolti nel flusso di lavoro (coltura cellulare, trattamento cellulare, lisi e rilevamento delle proteine). Questi kit di analisi includono un lisato di controllo positivo. Si raccomanda di utilizzare questi lisati di controllo positivi e il controllo negativo (1x buffer di lisi integrato da solo) in ogni esperimento. L'uso di controlli adeguati facilita la risoluzione dei problemi, in quanto i problemi possono essere rapidamente attribuiti alla fase di rilevamento (preparazione errata del reagente e / o esecuzione del saggio) o alla qualità dei lisati utilizzati nell'esperimento. Quest'ultimo è generalmente dovuto all'uso di condizioni cellulari non ottimali.

Un ulteriore vantaggio di questa piattaforma è la disponibilità di una suite di buffer di lisi ottimizzati con diverse stringenze. Questo permette di generare lisati più o meno eterogenei da frazionamento subcellulare parziale. Ciò è utile perché le proteine di segnalazione si trovano in vari compartimenti intracellulari e alcune, come le proteine STAT, fanno la spola tra i compartimenti (ad esempio, tra il citoplasma e il nucleo). Da notare, STAT1 fosforilato e totale utilizzano il tampone di lisi 1 perché non possono essere rilevati bene con il tampone di lisi 2 utilizzato per le altre proteine STAT. Al contrario, altri metodi omogenei si basano su un singolo tampone di lisi "universale", che genera un campione più complesso che può creare interazioni non specifiche con gli anticorpi. Tuttavia, l'uso di diversi tamponi di lisi può precludere l'analisi di più proteine di segnalazione da un singolo campione di lisato. Tuttavia, è ancora possibile testare lisati generati con diversi tamponi di lisi contemporaneamente su una singola piastra per l'analisi del percorso parallelo.

In conclusione, i metodi qui presentati basati su questa piattaforma omogenea di immunodosaggio cellulare TR-FRET offrono un'alternativa ad alto rendimento per il monitoraggio della segnalazione JAK/STAT attraverso il rilevamento e la quantificazione di proteine STAT1/3/4/5/6 fosforilate endogene, insieme a STAT1/3/5/6 totali, nei lisati cellulari. Questi saggi forniscono nuovi strumenti per un'analisi più completa di specifiche proteine STAT dopo il trattamento cellulare e lo screening e la caratterizzazione di modulatori specifici e selettivi delle vie di segnalazione JAK/STAT. Data la sua semplicità, specificità, sensibilità, riproducibilità ed economicità, questa nuova piattaforma di analisi rappresenta un'alternativa interessante ai saggi immunologici tradizionali, sia in ambito accademico che nei laboratori industriali per applicazioni HTS.

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Disclosures

Interessi in competizione: Jaime Padros, Mireille Caron e Geneviève Chatel sono dipendenti di BioAuxilium Research, che produce i kit di analisi THUNDER TR-FRET utilizzati in questo studio. Inoltre, Jaime Padros e Mireille Caron sono azionisti di BioAuxilium Research. Ciò non altera l'adesione degli autori a tutte le politiche di JoVE sulla condivisione di dati e materiali.

Acknowledgments

Nessuno.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well microplate, clear, flat bottom, polystyrene, tissue culture-treated, sterile Corning 3595 This is the plate for culturing cells when using the two-plate assay protocol. Other cell culture 96-well plates can be used
384-well microplate, white, low-volume PerkinElmer 6007290 This is the plate for TR-FRET detection when using the two- or one-plate assay protocols. Other low-volume, white 384-well plates can be used
A431 cell line ATCC CRL-1555
Adhesive microplate seal PerkinElmer 6050185
DMSO Fisher D159-4
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Wisent 319-005-CL  THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
EnVision Xcite Multilabel plate reader PerkinElmer 2104-0020A The assays can be performed on a variety of plate readers equipped with the TR-FRET option
Erlotinib hydrochloride Sigma CDS022564
Falcon tissue culture treated flasks Fisher 13-680-65
Fetal bovine serum (FBS) Wisent 098-150
HeLa cell line ATCC CCL-2
JAK Inhibitor 1 Cayman Chemical 15146
Orbital plate shaker Many options available Not applicable
Recombinant human EGF PeproTech AF-100-15
Recombinant human IFNα2b ProSpec CYT-460
Recombinant human IL-4 R&D Systems 204-IL
Roswell Park Memorial Institute 1640 medium (RPMI) Wisent 350-007-CL THUNDER TR-FRET is compatible with culture medium containing phenol red
THUNDER Phospho-STAT1 (Y701) + Total STAT1 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT1PT-500
THUNDER Phospho-STAT3 (Y705) + Total STAT3 Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT3PT-500
THUNDER Phospho-STAT4 (Y693) TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT4P-500
THUNDER Phospho-STAT5 (Y694/Y699) + Total STAT5 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT5PT-500
THUNDER Phospho-STAT6 (Y641) + Total STAT6 TR-FRET Cell Signaling Assay Kit BioAuxilium Research KIT-STAT6PT-500
Trypsin/EDTA 0.05% Wisent 325-542-CL
U266B1 cell line ATCC TIB-196
Ultrapure water NA NA Use Milli-Q grade water (18 MΩ.cm) to dilute Lysis Buffer and Detection Buffer

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References

  1. Villarino, A., Kanno, Y., O'Shea, J. Mechanisms and consequences of Jak-STAT signaling in the immune system. Nature Immunology. 18 (4), 374-384 (2017).
  2. Hammarén, H. M., Virtanen, A. T., Raivola, J., Silvennoinen, O. The regulation of JAKs in cytokine signaling and its breakdown in disease. Cytokine. 118, 48-63 (2019).
  3. O'Shea, J. J., et al. The JAK-STAT pathway: impact on human disease and therapeutic intervention. Annual Review of Medicine. 66, 311-328 (2015).
  4. Verhoeven, Y., et al. et al. potential and controversy of targeting STAT family members in cancer. Seminars in Cancer Biology. 60 (2), 41-56 (2020).
  5. Gilda, J. E., et al. et al. blotting inaccuracies with unverified antibodies: need for a Western blotting minimal reporting standard (WBMRS). PLoS One. 10 (8), 0135392 (2015).
  6. Binder, C., et al. et al. and utilization of the SureFire phospho-STAT5 assay for a cell-based screening campaign. Assay and Drug Development Technologies. 6 (1), 27-37 (2008).
  7. Ayoub, M. A., et al. Homogeneous time-resolved fluorescence-based assay to monitor extracellular signal-regulated kinase signaling in a high-throughput format. Frontiers in Endocrinology. 5, 94 (2014).
  8. Robers, M. B., Machleidt, T., Carlson, C. B., Bi, K. Cellular LanthaScreen and beta-lactamase reporter assays for high-throughput screening of JAK2 inhibitors. Assay and Drug Development Technologies. 6 (4), 519-529 (2008).
  9. Hwang, B., Engel, L., Goueli, S. A., Zegzouti, H. A. Homogeneous bioluminescent immunoassay to probe cellular signaling pathway regulation. Communications Biology. 3 (8), 1-12 (2020).
  10. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high-throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  11. Osmond, R. I. W., Das, S., Crouch, M. F. Development of cell-based assays for cytokine receptor signaling, using an AlphaScreen SureFire assay format. Analytical Biochemistry. 403 (1-2), 94-101 (2010).
  12. Haan, C., et al. Jak1 has a dominant role over Jak3 in signal transduction through γc-containing cytokine receptors. Chemistry & Biology. 18 (3), 314-323 (2011).
  13. Kim, Y., Apetri, M., Luo, B., Settleman, J. E., Anderson, K. S. Differential effects of tyrosine kinase inhibitors on normal and oncogenic EGFR signaling and downstream effectors. Molecular Cancer Research. 13 (4), 765-774 (2015).
  14. Qian, J., et al. Comparison of two homogeneous cell-based kinase assays for JAK2 V617F: SureFire pSTAT5 and GeneBLAzer fluorescence resonance energy transfer assays. ASSAY and Drug Development Technologies. 10 (2), 212-217 (2012).
  15. Iversen, P. W., et al. HTS assay validation. Assay Guidance Manual. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2012).
  16. Muelas, M. W., Ortega, F., Breitling, R., Bendtsen, C., Westerhoff, H. V. Rational cell culture optimization enhances experimental reproducibility in cancer cells. Scientific Reports. 8, 3029 (2018).

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Biochimica Segnalazione JAK/STAT Proteine STAT Fosforilazione Saggi omogenei TR-FRET Immunodosaggio Saggio cellulare Chinasi Segnalazione cellulare Screening ad alto rendimento Segnalazione citochine
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Padros, J., Chatel, G., Caron, M. Time-resolved Förster Resonance Energy Transfer Assays for Measurement of Endogenous Phosphorylated STAT Proteins in Human Cells. J. Vis. Exp. (175), e62915, doi:10.3791/62915 (2021).

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