初代ミクログリア培養は、新しい抗炎症分子を評価するために一般的に使用されます。本プロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離するための再現可能で関連性のある方法を記載しています。
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方法論記事
初代細胞培養のための新生児マウスからのミクログリア細胞の磁気単離
* These authors contributed equally
この記事について
サマリー
要約
ミクログリアは、脳に常在するマクロファージとして、環境ストレスへの応答や脳の恒常性など、いくつかの機能の基本です。ミクログリアは、広範囲の活性化表現型を採用することができる。さらに、炎症誘発性の表現型を支持するミクログリアは、神経発達障害と神経変性障害の両方に関連しています。 インビトロ 研究は、特定の細胞型における潜在的な治療戦略を評価するための研究で広く使用されています。これに関連して、初代ミクログリア培養物を用いて in vitro でミクログリア活性化および神経炎症を研究することは、ミクログリア細胞株または幹細胞由来ミクログリアよりも関連性が高い。ただし、一部の初代培養物を使用すると、再現性が不足する可能性があります。このプロトコルは、新生児の子犬からミクログリアを磁気的に分離する再現可能で関連性のある方法を提案しています。mRNA発現定量およびCy3ビーズ貪食アッセイによる4時間および24時間後のいくつかの刺激を用いたミクログリア活性化がここで実証される。今回の研究は、幼若発生段階から生理学的に重要なミクログリアを分離するための容易に再現可能な技術を提供することが期待されます。
概要
ミクログリアは、初期胚発生中に神経上皮に移動する卵黄嚢の赤血球生成前駆体に由来する中枢神経系常在マクロファージ様細胞です1。免疫機能とは別に、神経発達中、特にシナプス形成、ニューロン恒常性、髄鞘形成にも重要な役割を果たします2。成人期には、ミクログリアは環境を継続的にスキャンするための長い細胞プロセスを発達させます。脳損傷や脳疾患などの恒常性破壊の場合、ミクログリアは形態学的外観を変化させてアメーバ状を採用し、損傷領域に移動し、多くの細胞保護因子または細胞毒性因子を増加させて放出する可能性があります。ミクログリアは、その発生段階および持続した傷害の種類に応じて不均一な活性化状態を有する3,4,5。この研究では、これらの活性化状態は、炎症誘発性/食性、抗炎症性、免疫調節性の3つの異なる表現型に大きく分類され、実際には状況がより複雑になる可能性があることを念頭に置いています6。
脳発達の初期段階でのin vivoミクログリア活性化の研究と神経保護戦略のスクリーニングは、(1)離乳前の動物の脆弱性、および(2)ミクログリア細胞の数が少ない....
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プロトコル
議定書が承認され、すべての動物は、フランス、インセルム国立サンテ・エ・ラ・レシェルシュ科学研究所の制度的ガイドラインに従って取り扱われました。P8での24匹のOF1マウス子犬(オスとメスの両方)の脳からのミクログリアの磁気分離は、6ウェル、12ウェル、または96ウェルプレートに分けて提示されます。実験作業は、無菌状態を維持するためにフードの下で行われた。
1.単離および細胞培養のための滅菌溶液の調製
- 市販の10x溶液から、Ca2+およびMg2+(HBSS-/-)を含まない1xハンクス平衡塩溶液(HBSS)50mLを調製します(材料の表を参照)。
- 市販の組織解離キット(材料の表を参照)を用いて、表1に提供される組成に従って解離混合物を調製する。
- 市販の10x溶液から、Ca2+およびMg 2+(HBSS+/+)を含む1x HBSSを200 mL調製します。
- 200 mLの1x PBS + 0.5% BSA(セルソーティングバッファーと呼ばれる)を調製します。
- 表2に従ってCD11bマイ....
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結果
ミクログリアはCNS常在マクロファージであり、環境問題(外傷、毒性分子、炎症)にさらされると活性化されます4、5、6、34(図3A)。ミクログリアに関するin vitro研究は、これらの環境課題に関連する細胞自律メカニズムを評価し、薬理学的または遺伝子操作後の活性化状態を特徴付けるために一般的に使用されます。ここでは、磁気結合ビーズを用いて幼若期の初代ミクログリアを単離するアプローチを提示する。
in vitroでのミクログリア活性化の簡単な読み出しは、炎症誘発性表現型(Cd86、Nos2、Ptgs2、Tnf)または抗炎症表現型(Cd206、Igf1、Arg1、Lgasl3)
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ディスカッション
現在の研究では、磁気的に選別されたCD11b +細胞を使用した初代ミクログリア細胞培養を示しています。ミクログリア機能評価(RT-qPCRおよび食細胞アッセイ)に加えて、ミクログリア培養純度も決定しました。
古典的なミクログリア細胞培養は、通常、P1またはP2げっ歯類の新生児脳から生成され、星状細胞と少なくとも10日間共培養されます。次に、ミクログリアはオービタルシェーカーを使用して機械的に分離されます。ミクログリアをin vitroで単離して培養する方法は、1990年代の終わりに新生児ラットの脳から初めて記載された40,41。それ以来、活性化/休止ミクログリアや炎症誘発性/抗炎症性ミクログリアなどのミクログリア表現型の分析に広く使用されています。さらに、この実験は、ミクログリアをニューロンと共培養した神経毒性細胞として定義するための基礎となっています。しかし、2014年に、Biberと共同研究者は、古典的な方法を使用してin vitro<.......
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開示事項
著者は利益相反を宣言しません。
謝辞
図はBioRenderを使用して作成されました。研究は、Inserm、パリ大学、Horizon 2020(PREMSTEM-874721)、Fondation de France、Fondation ARSEP、Fondation pour la Recherche sur le Cerveau、Fondation Grace de Monaco、およびInvestissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRISおよびInvestissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.E.からの追加助成金によって資金提供されています。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 反マウスACSA-2 PE Vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-116-246 | |
| 反マウスCD11b BV421 | ソニーバイオテクノロジー | 1106255 | |
| 反マウスCD45 BV510 | ソニーバイオテクノロジー | 1115690 | |
| 抗マウスCX3CR1 PE Cy7 | ソニーバイオテクノロジー | 1345075 | |
| 抗マウスNeuN PE | Milli-Mark | FCMAB317PE | |
| 抗マウス O4 Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-120-016 | |
| BD Cytofix/Cytoperm 透過化キット | BD Biosciences | 554655 | |
| ウシ血清アルブミン | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| CD11b (Microglia) MicroBeads, h, m | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| 共焦点顕微鏡 | Leica TCS SP8 | ||
| D-PBS (10x) | Thermo Scientific | 14200067 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E1644 | |
| Falcon Cell culture 12-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353043 | |
| Falcon Cell culture 96-well plate, flat bottom + lid | Dutscher | 353072 | |
| Falcon tubes 50 mL | Dutscher | 352098 | |
| Fcブロッキング試薬(マウスCD16/32) | BD Biosciences | 553142 | |
| 蛍光顕微鏡 | Nikon ECLIPSE TE300 | ||
| gentleMACS C Tubes (4 x 25 tubes) | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| ハンクス平衡塩溶液(HBSS)+CaCl2 +MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14065049 | |
| ハンクス平衡塩溶液(HBSS)-CaCl2 -MgCl2 10x | Thermo Scientific | 14185045 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-rad | 1725006CUST | |
| Iscript c-DNA synthesis | Bio-rad | 1708890 | |
| ラテックスビーズ、アミン変性ポリスチレン、蛍光赤色 | Sigma-Aldrich | L2776-1mL | |
| リポ多糖類 (LPS) from 大腸菌 O55:B5 | Sigma-Aldrich | L2880 | |
| マクロファージ-SFM 無血清培地 | Thermo Scientific | 12065074 | |
| MACS BSA ストックソリューション | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| MACS SmartStrainers (70 μm)、4 x 25個 | Miltenyi Biotec | 130-110-916 | |
| マウス IgG1 PE | Millipore | MABC002H | |
| マウス IgG2a PE Cy7 | ソニーバイオテクノロジー | 2601265 | |
| マウス IL1 ベータ | Miltenyi Biotec | 130-101-684 | |
| Multi-24 カラム ブロック | Miltenyi Biotec | 130-095-691 | |
| MultiMACS Cell24 セパレーター | MiltenyiBiotec | ||
| 神経組織解離キット - Papain | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| Nucleocounter NC-200 | Chemometec | ||
| Nucleospin RNA Plus XS | Macherey Nagel | 740990.5 | |
| Nun EZFlip Top Conical Centrifuge Tubes | Thermo Scientific | 362694 | |
| OPTILUX ペトリ皿 - 100 x 20 mm | Dutscher | ||
| Pénicilline-streptomycine (10,000 U/mL) | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Rat IgG2b, k BV421 | BD Biosciences | 562603 | |
| Rat IgG2b, k BV510 | Sony Biotechnology | 2603230 | |
| REA control (S) PE vio 615 | Miltenyi Biotec | 130-104-616 | |
| REA control (S) Vio Bright B515 | Miltenyi Biotec | 130-113-445 | |
| 組換えマウスIFN-γタンパク質 | R&D System | 485-MI | |
| 組換えマウス IL-10 タンパク質 | R&D System | 417-ML | |
| 組換えマウスIL-4タンパク質 | R&D System | 404-ML | |
| RIPA バッファー | Sigma-Aldrich | R0278 | |
| 生存率プローブ (FVS780) | BD Biosciences 565388 |
参考文献
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via Pu.1- and Irf8-dependent pathways. Nature Neuroscience. 16 (3), 273-280 (2013).
- Wright-Jin, E. C., Gutmann, D. H. Microglia as dynamic cellular mediators of brain functio....
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