Qui presentiamo un metodo modificato per l'isolamento e la coltura di cellule epiteliali gengivali umane aggiungendo l'inibitore della roccia, Y-27632, al metodo tradizionale. Questo metodo è più semplice, richiede meno tempo, migliora le proprietà delle cellule staminali e produce un numero maggiore di cellule epiteliali ad alto potenziale sia per il laboratorio che per le applicazioni cliniche.
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Articolo metodologico
Isolamento e coltura di cellule epiteliali gengivali umane primarie utilizzando Y-27632
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tessuto gengivale è la prima struttura che protegge i tessuti parodontali e svolge ruoli significativi in molte funzioni orali. L'epitelio gengivale è un'importante struttura del tessuto gengivale, specialmente nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale. Studiare le funzioni delle cellule epiteliali gengivali ha un valore scientifico cruciale, come la riparazione dei difetti orali e la rilevazione della compatibilità dei biomateriali. Poiché le cellule epiteliali gengivali umane sono cellule cheratinizzate altamente differenziate, la loro durata è breve e sono difficili da passare. Finora, ci sono solo due modi per isolare e colturare cellule epiteliali gengivali, un metodo di espianto diretto e un metodo enzimatico. Tuttavia, il tempo necessario per ottenere cellule epiteliali utilizzando il metodo di espianto diretto è più lungo e il tasso di sopravvivenza cellulare del metodo enzimatico è inferiore. Clinicamente, l'acquisizione del tessuto gengivale è limitata, quindi è necessario un sistema di isolamento e coltura in vitro stabile, efficiente e semplice. Abbiamo migliorato il metodo enzimatico tradizionale aggiungendo Y-27632, un inibitore della chinasi rho-associata (ROCK), che può promuovere selettivamente la crescita delle cellule epiteliali. Il nostro metodo enzimatico modificato semplifica le fasi del metodo enzimatico tradizionale e aumenta l'efficienza della coltura delle cellule epiteliali, che presenta vantaggi significativi rispetto al metodo di espianto diretto e al metodo enzimatico.
Introduzione
La gengiva umana, la struttura di difesa di prima linea che protegge il tessuto parodontale, non è solo una barriera fisica e chimica1, ma secerne anche diverse classi di mediatori infiammatori che partecipano alle risposte immunitarie e costituiscono una barriera immunitaria2,3. L'epitelio gengivale svolge un ruolo importante nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale. Pertanto, studiare la difesa e l'immunità dell'epitelio gengivale è di grande importanza per comprendere l'insorgenza, la diagnosi e il trattamento della parodontite. L'isolamento e la coltura di cellule e....
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Protocollo
I tessuti umani utilizzati in questo protocollo sono tessuti gengivali adulti freschi scartati dalle estrazioni dei denti colpiti nel Dipartimento di Chirurgia Maxillo-Facciale secondo le linee guida del Comitato Etico della Ricerca Umana dell'Istituzione (Protocollo n. GR201711, Data: 27-02-2017).
1. Preparativi
- Raccogliere tessuti gengivali adulti freschi in provette da 15 mL contenenti 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con penicillina/streptomicina (P/S) al 3% e mantenere i tessuti a 4 °C.
NOTA: Trattare i tessuti come descritto di seguito entro 24 ore dall'escissione.
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Risultati
La Figura 1 mostra un diagramma schematico del metodo di espianto diretto e del metodo enzimatico modificato. Il metodo di espianto diretto non ha bisogno di alcun enzima digestivo durante l'intero processo. Al contrario, il metodo enzimatico tradizionale di solito ha bisogno di due serie di enzimi digestivi, dispasi e collagenasi, per separare il foglio epiteliale dallo strato di fibroblasti sottostante, e quindi tripsina per rilasciare le cellule epiteliali in sospensione. Il nostro nuovo .......
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Discussione
Il tessuto gengivale è una struttura chiave che mantiene l'integrità parodontale e la salute. Le cellule epiteliali gengivali hanno ruoli significativi nella riparazione e rigenerazione del tessuto parodontale e possono essere utilizzate nella ricerca scientifica e nelle applicazioni cliniche e campi correlati, tra cui biologia orale, farmacologia, tossicologia e carenze della mucosa orale18. Pertanto, è necessario sviluppare un metodo stabile ed efficiente per raccogliere le cellule epiteliali or.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Key Program della Shandong Province Natural Science Foundation (ZR2019ZD36) e dal Key Research and Development Program of Shandong Province (2019GSF108107) a X.W.; il programma chiave di ricerca e sviluppo della provincia di Shandong (2018GSF118240) a J.G.; Progetto di sviluppo medico e sanitario scientifico e tecnologico della provincia di Shandong (2018WS163) a Z.X. e il progetto di sviluppo medico e sanitario scientifico e tecnologico della provincia di Shandong (2019WS045) a J.S.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nomi | Abbreviazioni & Contatori | ||
| di cellule automatizzati Countess | Shanghai Ruiyu Bio-science& La tecnologia Co.Ltd. | BBA0218AC | Conta cellulare automatico |
| Incubatore a CO2 | Thermo Scientific | 51026333 | Per incubazione cellulare |
| Centrifuga Sorvall ST 16R | Thermo Scientific | 75004380 | Centrifuga cellulare |
| Piatto per coltura cellulare | Eppendorf | 30702115 | Per colture cellulari |
| Tubo da centrifuga da 50 ml | KIRGEN | 171003 | Per centrifugazione cellulare |
| Provette per microcentrifuga da 1,5 ml | KIRGEN | 190691J | Per la digestione cellulare |
| Filtro cellulare | Corning incorporato | 431792 | Filtrazione cellulare |
| Soluzione tamponata con fosfato | Solarbio Life Science | P1020-500 | Soluzione di lavaggio |
| DMEM | Thermo Scientific | C11995500 | Componente del mezzo di neutralizzazione |
| Definito K-SFM | Life Tecnologie | 10785-012 | Terreno di coltura di cellule epiteliali gengivali |
| Penicillina Streptomicina | Thermo Scientific | 15140-122 | Antibiotici |
| Fetale Siero bovino | Industrie biologiche | 04-001-1AC5 | Componente del mezzo di neutralizzazione |
| 0,05% Tripsina | Life Technologies | 25300-062 | Per la dissociazione degli HGGEPC |
| Mezzo di diluizione | Life Technologies | 50-9701 | Per la matrice di rivestimento |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Per l'isolamento degli HGGEPC |
| Collagenasi di tipo I | Life Technologies | 17100-017 | Per l'isolamento degli HGGEPC |
| Miscela di nutrienti F12, Hams | Life Technologies | 31765035 | Componente dell'integratore G-medium |
| B27 | Life Technologies | 17504044 | Fattore di crescita nel G-medium |
| FGF-2 Millipore | Merck Biosciences | 341595 | Fattore di crescita nel G-medium |
| Y-27632 | Funzionamento del gene | IAD1011 | Inibitore ROCK |
| Fungizone | Gibco | 15290026 | Preparazione per G-medium |
| EGF Proteina umana ricombinante | Gibco | PHG0311 | Fattore di crescita nel G-medium |
| Cell Counting Kit-8 | Dojindo Molecular Technologies | CK04 | Per il saggio di proliferazione cellulare |
| Coniglio anti-umano CK18 | Abcam | ab82254 | Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC |
| Coniglio Anti-Citocheratina Umana10 | Abcam | ab76318 | Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC |
| Mouse anti-umano Vimentina | Cell Signaling Technology | 3390 | Per la colorazione in immunofluorescenza dei fibroblasti gengivali |
| Coniglio Anti-Human pan-ck | BD | 550951 | Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC |
| coniglio anti-Ki67 | Abcam | 15580 | Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC |
| coniglio anti-p63 | Biolegend 619002 | Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC | |
| coniglio anti-p75NGFR | Abcam | ab52987 | Per la colorazione in immunofluorescenza per controllare il marcatore di differenziazione degli HGGEPC |
Riferimenti
- Takahashi, N., et al. Gingival barrier: regulation by beneficial and harmful microbes. Tissue Barriers. 7, 1651158(2019).
- Michea, P., et al. Epithelial control of the human pDC response to extracellular bacteria. European Journal of Im....
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Ristampe e permessi
