Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Вскрытие и иммуноокрашивание личиночных слюнных желез комаров Anopheles gambiae

Published: September 30, 2021 doi: 10.3791/62989
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 3, 1
1Department of Cell Biology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Tufts School of Medicine, 3Department of Biomedical Sciences, Idaho College of Osteopathic Medicine

Summary

Слюнная железа взрослого комара (SG) необходима для передачи всех переносимых комарами патогенов их человеческим хозяевам, включая вирусы и паразитов. Это видео демонстрирует эффективную изоляцию SGs от личиночных (L4) стадии комаров Anopheles gambiae и подготовку SGs L4 для дальнейшего анализа.

Abstract

Слюнные железы комаров (SGs) являются необходимым органом-шлюзом для передачи патогенов, переносимых насекомыми. Болезнетворные агенты, в том числе вирусы и паразиты Plasmodium, вызывающие малярию, накапливаются в секреторных полостях SG-клеток. Здесь они готовы к передаче своим позвоночным хозяевам во время последующей кровяной трапезы. Поскольку взрослые железы формируются как развитие остатков почек личиночного протока SG, которые сохраняются после раннего гистолиза pupal SG, личиночный SG является идеальной мишенью для вмешательств, ограничивающих передачу заболевания. Понимание развития личиночного SG может помочь лучше понять его морфологию и функциональные адаптации и помочь в оценке новых вмешательств, которые нацелены на этот орган. Этот видеопротокол демонстрирует эффективную технику выделения, фиксации и окрашивания личинок SGs от комаров Anopheles gambiae. Железы, рассеченные из личинок в 25% растворе этанола, фиксируют в смеси метанола и ледниковой уксусной кислоты с последующей холодной промывкой ацетоном. После нескольких полосканий в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS) SGs могут быть окрашены широким спектром маркерных красителей и / или антисывороток против SG-экспрессированных белков. Этот метод выделения личинок SG также может быть использован для сбора ткани для анализа гибридизации in situ, других транскриптомных применений и протеомных исследований.

Introduction

Малярия является серьезной угрозой общественному здравоохранению, вызывающей почти 230 миллионов инфекций и, по оценкам, 409 000 смертей в 2019году 1. Большинство смертей происходит в странах Африки к югу от Сахары и вызваны паразитом Plasmodium falciparum, переносчикомнасекомых которого является Anopheles gambiae,предмет этой видеодемонстрации. Хотя цифры указывают на значительное снижение годового уровня смертности с начала века (>300 000 меньше ежегодных смертей), многообещающее снижение показателей заболеваемости, наблюдаемое с 2000 по 2015 год, сокращается, что свидетельствует о необходимости новых подходов к ограничению передачиболезней2. Среди перспективных дополнительных стратегий борьбы и, возможно, ликвидации малярии — нацеливание на потенциал комаров-переносчиков с использованием редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 и генногодрайва3,4,5. Действительно, именно борьба с комарами-переносчиками (за счет более широкого использования обработанных инсектицидами надкроватных сеток длительного пользования) оказала наибольшее воздействие на сокращение передачи болезней6.

Самки комаров приобретают гаметоциты Plasmodium от инфицированного человека во время кровяной трапезы. После оплодотворения, созревания, прохождения эпителия средней кишки, расширения популяции и навигации гемокоэли в их облигатных комарах-хозяевах от сотен до десятков тысяч спорозоитов Plasmodium вторгаются в SG комаров и заполняют секреторные полости составляющих секреторных клеток. Оказавшись внутри секреторных полостей, паразиты имеют прямой доступ к слюнному протоку и, таким образом, готовы к передаче новому хозяину позвоночных при следующем приеме пищи в кровь. Поскольку SG имеют решающее значение для передачи вызывающих малярию спорозоитов их человеческим хозяевам, а лабораторные исследования показывают, что SG не являются необходимыми для кровоснабжения, выживания комаров или плодовитости7,8,9,они представляют собой идеальную мишень для мер по блокированию передачи. Взрослые комары SGs формируются как развитие остатков «протоковой почки» в личиночных SGs, которые сохраняются за пределами раннего гистолиза pupal SG10,что делает личиночную SG идеальной мишенью для вмешательств по ограничению передачи заболевания на взрослой стадии.

Характеристика личиночной стадии развития SG может помочь не только лучше понять его морфологию и функциональные адаптации, но также может помочь в оценке новых вмешательств, которые нацелены на этот орган посредством редактирования генов ключевых регуляторов SG. Поскольку все предыдущие исследования архитектуры личиночных слюнных желез предшествовали иммуноокрашиванию и современным методам визуализации10,11,мы разработали протокол выделения и окрашивания слюнных желез различными антителами и клеточными маркерами12. Это видео демонстрирует этот подход к извлечению, фиксации и окрашиванию личинок SGs из личинок Anopheles gambiae L4 для конфокальной визуализации.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка растворов и инструментов

  1. Приготовление раствора для рассечения
    1. Для приготовления рассеченного раствора добавляют 2,5 мл 100% этанола к 7,5 мл дистиллированногоH2Oв пластиковой тубе из 15 штук. Переверните трубку 3 раза, чтобы перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких недель.
  2. Приготовление 10-кратного запаса фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS)
    1. Чтобы приготовить 10 штоков PBS, добавьте 17,8 г Na2HPO4• 2H2O, 2,4 г KH2PO4,80 г NaCl и 2 г KCl до 800 мл деионизированной воды. Перемешать с перемешиванием на перемешиваемой пластине до полного растворения твердых веществ. Отрегулируйте конечный объем до 1 л с очищенной водой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
  3. Подготовка 1x PBS
    1. Добавьте 10 мл 10x PBS к 90 млH2Oв стерильной стеклянной бутылке. Плотно закройте крышку и переверните в 3 раза, чтобы перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
  4. Приготовление фиксатора.
    1. Добавьте 600 мкл метанола к 200 мкл ледяной уксусной кислоты. Каждый раз делайте раствор свежим.
  5. Конструкция шпаклевочной пластины (тарелка для культивирования тканей, заполненная силиконовой резиной)
    1. Смешайте компоненты (1:50) эпоксидной смолы (1 г) и воды (50 мл) и перелейте смесь в чашку Петри. Подождите, пока компоненты высохнут перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После постройки шпаклевочная пластина может использоваться в течение многих лет.

2. Рассечение железы(рисунок 1А)

  1. Собирайте личинок L4 поздней стадии (~10 дней после вылупления; Рисунок 2) из лотков для кормления с использованием пластиковой передаточной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите это полезное онлайн-руководство по стандартному разведению комаров и культуре личинок13.
    1. Поместите шпаклевочную пластинку на ступень рассекающего микроскопа и перенесите личинок на шпаклевочную пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При аликвотировании личинок для первоначального рассечения полезно перенести ~ 10 личинок на слайд за один раз с помощью пластиковой переносной пипетки.
  2. Поместите каплю раствора для рассечения (1:3 EtOH:H2O) на шпаклевочную пластину отдельно от 10 личинок.
  3. Используйте пластиковую переносную пипетку или одноразовую стеклянную пипетку, чтобы поместить одну личинку L4 в 25% каплю EtOH.
  4. Возьмите щипцы (No 5), по одному в каждой руке, и недоминирующей рукой захватите голову личинки. Используя доминантную руку, схватите личинку щипцами чуть ниже головы и осторожно потяните с минимальной постоянной силой, чтобы голова отделялась от остальной части тела, а железы оставались прикрепленными к голове. Отбросьте часть тела туши личинки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При вскрытии установите бумажное полотенце рядом, чтобы собрать туши личинок.
  5. Соберите головные железы в 1 мл 1x PBS в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл. Используйте 1 мл PBS для ~ 40 рассеченных желез с прикрепленными головками. Подождите, пока головки/СГ опустятся на дно буфера.

3. Фиксация для окрашивания антителами(рисунок 1B)

  1. Дренируйте PBS, начиная с верхней части трубки микроцентрифуги, используя стеклянную передаточную пипетку, избегая липких тканей комара и удаляя как можно больше раствора PBS, не повреждая ткани. Замените раствор 800 мкл смеси метанола 3:1 с уксусной кислотой ледниковой. Поместите в тубу при температуре 4 °C на ночь (рекомендуется 12-24 ч; предпочтительно 19 ч).
  2. На следующий день слейте раствор и замените его 1 мл холодного 100% ацетона. Оставьте на 90 с.
  3. Удалите ацетон и осторожно промойте ткани три раза по 1 мл 1x PBS каждый раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы должны медленно всплывать вместе с потоком, а затем падать обратно на дно трубы к моменту завершения каждого добавления PBS.

4. Иммуноокрашивание(рисунок 1B)

  1. Добавляют первичное антитело (например, Rab11) в соответствующем разведении (1:100) в 200 мкл от общего объема 1x PBS. Аккуратно покрутите содержимое трубки кончиком пипетки. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
  2. Удалите раствор первичного антитела и трижды промыть 1 мл 1x PBS (осторожно пипетку в пипетку и из нее).
  3. Добавляют вторичное антитело (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) в соответствующем разведении (1:200) в 200 мкл общего объема. Аккуратно покрутите содержимое трубки кончиком пипетки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 90 мин.
  4. Добавьте красители, такие как Nile Red (липиды, 5 мкл 1 мкг/мкл) и/или Hoechst (ДНК, 3 мкл 1 мкг/мкл), в 200 мкл PBS на этом этапе. Инкубировать при комнатной температуре еще 60 мин. Аккуратно вымойте три раза с 1x PBS.

5. Монтаж окрашенных желез для микроскопии(рисунок 1С)

  1. Пипетка 200 мкл 100% глицерина на предметном стекле микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку глицерин вязкий, оставьте кончик пипетки в жидкости до тех пор, пока он не достигнет соответствующего объема. Не наблюдалось сокращения тканей при переходе прямо в 100% глицерин. Тем не менее, исследователи могут пройти через промывки 30% и 50% глицерина в пробирках, прежде чем перемещать образцы в 100% глицерин.
  2. Перенесите окрашенные головки (до 20 на слайд) с прикрепленными железами (вместе с другими внутренними структурами) на предметное стекло микроскопа с помощью мягкой кисти(рисунок 3А). Распределите образцы так, чтобы они равномерно распределились по стеклянной горке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При отложении желез на затворе щеткой щипцы можно использовать для мягкой ориентации СГ так, чтобы все они были ориентированы в одном направлении.
  3. Рассматривая под рассекающим микроскопом, отделите личиночную головку от желез с помощью двух пар щипцов и осторожно потяните две ткани в противоположных направлениях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку трудно полностью изолировать СГ, просто удалите головки, оставив СГ и связанные с ними внутренние структуры. Даже если SG остаются связанными с другими тканями, они легко распознаются при окрашивании Hoechst и другими маркерами(Рисунок 3B,C).
  4. Снимите и выбросьте головки и повторите процесс разделения для каждого SG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При снятии головок установите бумажное полотенце рядом, чтобы собрать их.
  5. Аккуратно поместите сверху обшивку толщиной 1,5 мм (избегая пузырьков воздуха) и запечатайте прозрачным лаком для ногтей.
  6. Хранить при температуре 4 °C в светонепроницаемом контейнере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовленные слайды окрашенных желез можно хранить при температуре 4 °C в темноте от шести месяцев до одного года без каких-либо заметных изменений качества. Если глицерин начинает просачиваться с течением месяцев, осторожно поднимите крышку и пипетку в большее количество глицерина, чтобы заполнить отверстия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Слюнные железы относительно легко рассекаются от всех личинок 4 стадии. Личинки самцов и самок можно отличить на поздней личиночной стадии L4 по красной полосе вдоль спинной грудной клетки самок, но не самцов(рисунок 2). Мы также наблюдаем, что антеннальная морфология гораздо более сложна у самцов, чем у самок личинок L4(рисунок 2),аналогично различиям, наблюдаемым в этой структуре у взрослых комаров. Наряду со значительным общим ростом во время стадии L4, слюнные железы также образуют просвет во время L412. Слюнные железы, выделенные из личинок ранней стадии L4, окрашенных Hoechst, обнаруживают проксимальные и дистальные доли, разделенные узким сужением(рисунок 3B,C). Формирующий просвет будет простираться от слюнного протока на самом проксимальном конце (не показан) через дистальную долю. Образующийся просвет можно увидеть в иммуноокрашенной дистальной слюнной железе средне-поздней личинки L4(рисунок 4). Апикальные домены секреторных клеток, окружающих формирующийся просвет, имеют интенсивное окрашивание в красный нил(рисунок 4B,C),наводящее на мысль о микроворсиноподобных структурах. Также вблизи апикальной поверхности наблюдается окрашивание Rab11(рисунок 4C,D,стрелки). Rab11 локализуется для апикальной рециркуляции эндосом. Окрашивание Rab11, которое также накапливается вдоль базальной поверхности железы, является артефактом из-за липкости базальной мембраны. Подобное фоновое окрашивание характерно для иммуноокрашивания как личиночных, так и взрослых слюнных желез и было ошибочно принято за добросовестный сигнал.

Figure 1
Рисунок 1:Мультяшная визуализация процесса иммуноокрашивания от рассечения железы до подготовки слайдов. Сокращения: SGs = слюнные железы; PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор; MeOH = метанол; DAPI = 4',6-диамидин-2-фенилиндол; Abs = антитела; LH = левая рука; RH = правая рука. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2:Мужские и женские личинки L4 стадии Anopheles gambaie. (A, B) Ранние личинки L4. (C, D) Поздние личинки L4. На стадии L4 наблюдается значительный рост. Самки(A, C)были описаны как имеющие отличительную красную полосу вниз по спинной грудной клетке(C;черная стрела), которая не присутствует у самцов(B, D),но и их усики гораздо менее сложны (легкомысленно), чем у личинок самцов как раннего, так и позднего L4 (белые стрелки на увеличенных изображениях). Шкала стержней = 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3:Ранние L4 слюнные железы. (A) Ранняя L4 женская личиночная голова со слюнными железами и другими внутренними органами все еще прикреплена. Выделена слюнная железа. Шкала бар = 50 мкм. (B, C) Изолированные личиночные железы, окрашенные Хёхстом. (B)Слияние флуоресцентных и номарских изображений, показывающих форму проксимальных и дистальных долей и синее окрашивание Hoechst в ядрах. (C) Флуоресцентное изображение Хохста выделяет только ядра. Шкала в нижних панелях = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4:Иммуноокрашенная дистальная L4 слюнная железа. (A)Железа была окрашена Hoechst (ядерная ДНК, синий) и(B)Nile Red (мембранный маркер, красный); иммуноокрашен для Rab11 (апикальные рециркуляционные везикулы, зеленый)(C). (D) Объединенное изображение. Обратите внимание, что просвет присутствует на показанной стадии(B-D). Стрелки в C и D указывают на ожидаемое окрашивание пузырьков Rab11 вблизи апикальной поверхности, которая перекрывает нильский красно-положительное везикулярное окрашивание в слиянии (белые стрелки). Также наблюдается неспецифическое фоновое окрашивание вокруг базальной поверхности (звездочки), распространенный тип фона наблюдается у личиночных и взрослых слюнных желез. Шкала = 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Протокол, описанный в настоящем описании, был адаптирован из протокола рассечения Drosophila SG и протокола рассечения взрослых комаров14,15,16. Однако большинство маркеров не проникали через базальную мембрану (данные не показаны) при использовании взрослых методов рассечения и окрашивания SG. Адаптация протокола для взрослых включала рассечение желез в 25% растворе EtOH, промывание желез комбинацией MeOH и ледниковой уксусной кислоты и промывку ацетона 90 с. В первоначальном протоколе для взрослых СГ для взрослых были рассечены в 1x PBS14,15,16. Рассечение в 25% растворе EtOH помогло сохранить SGs и предотвратить повреждение в периоды окрашивания. При выполнении начального рассечения легче всего было сориентировать личинку СГ головой, обращенной к недоминирующей руке и мягко вытягивая доминантную руку наружу (потому что личинки очень активно двигаются). Улучшенное проникновение в ткани, достигаемое путем промывания желез раствором MeOH: ледниковой уксусной кислоты, предполагает, что содержание липидов в личиночной SG базальной мембране и / или клеточных плазматических мембранах отличается от содержания липидов у взрослого SG. Промывка ацетоном 90 с улучшила прозрачность желез для визуализации. Хотя период фиксации был рекомендован не менее 19 ч (ночью), более длительные периоды работали так же эффективно.

Морфология SGs может широко варьироваться в зависимости от того, когда личинки рассекаются на 2-дневной стадии L4. При ранних рассечениях L4 (день 1) просвет оказывается значительно меньше12. При поздних рассечениях L4 (вторая половина 2-го дня) просвет большой, а клетки вытянуты. Мы выяснили, что оптимальным периодом для работы с личинками является L4; SG L1-L3 просто слишком малы для ручного вскрытия. В результатах визуализации железы, рассеченные в середине и конце L4, показали меньшие клетки, смешанные с более крупными, латерально удлиненными клетками, особенно в дистальном мешке.

Предыдущие доклады о разработке Anopheles SG обеспечили много рекомендаций для текущих исследований. Эти отчеты включали иллюстрации рассеченных эмбриональных и личиночных SGs17,18,подробный микроскопический анализ рассеченных желез19,20и транскриптомические исследования20,21,22. Особенности Anopheles stephensi SG были сообщены в течение 1950-х годов двумя различными группами10,11. Описаны многие морфологические особенности личиночных желез, в том числе общая организация СГ, относительные положения различных типов клеток внутри органа (проток, взрослые предшественники SG, проксимальный и дистальный секреторные мешочки личинок)10,11. Обе группы также сообщили о дополнительных морфометрических данных, включая количество и распределение секреторных клеток в каждом мешочке и их ядерный размер10,11. Ришикеш показал, что, как и личинки Drosophila SGs, личиночные SG-хромосомы из Anopheles stephensi политенизированы10. Эти важные основополагающие обзоры описывали широкие биологические аспекты личиночных Anopheles SGs.

Способ, описанный в настоящем описании, должен быть полезен для изучения не только личиночных SGs An. gambiae, но также может применяться к тем, кто изучает другие виды комаров. Действительно, тот же протокол был успешно использован (неопубликованный) с An. stephensi,видом, часто изучаемым в лаборатории. Одним из ограничений протокола является ограниченное количество антител, которые были специально сгенерированы против белков комаров. Хотя использование антител Drosophila для высококонсервативных белков обогнуло это ограничение12,область может извлечь выгоду из большего количества антител к белкам комаров. Понимание клеточной и молекулярной биологии личинок SG может способствовать новым стратегиям контроля или мишени и позволить обнаружить новые гены-кандидаты-мишени для нарушения SG.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Научно-исследовательский институт по борьбе с малярией Университета Джона Хопкинса за доступ к личинкам An. gambiae и их выращивание.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
 KH2PO4 Millipore Sigma P9791
 Na2HPO4 • 2H2O Millipore Sigma 71643
 NaCl Millipore Sigma S7653
Acetone Millipore Sigma 179124
Brush with soft bristles Amazon (SN NJDF) Detail Paint Brush Set B08LH63D89
Cover slips (22 x 50 mm) VWR 48393-195
DAPI (DNA) ThermoFisher Scientific D1306
Ethyl alcohol 200 proof Millipore Sigma EX0276
Gilson Pipetman P200 Pipette Gilson P200
Glacial Acetic Acid Sigma Aldrich 695092
Jewelers forceps, Dumont No. 5 Millipore Sigma F6521
KCl Millipore Sigma 58221
Methanol Millipore Sigma 1414209
Nail polish Amazon (Sally Hansen) B08148YH9M
Nile Red (lipid) ThermoFisher Scientific N1142
Paper towels/wipes ULINE S-7128
Petri plate (to make putty plate) ThermoFisher Scientific FB0875712
Pipette Tips Gilson Tips E200ST
Plastic Transfer Pipette Fisher Scientific S304671
Primary antibodies (e.g., Crb, Rab11) Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab Mouse anti-Crb (Cq4) or Rabbit anti-Rab11
Secondary antibodies with fluorescent tags (e.g., Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit) ThermoFisher Scientific A11008
Silicone resin and curing agent for putty plate Dow Chemicals - Ximeter Silicone PMX-200
Slides, frosted on one end for labelling VWR  20 X 50 mm 48393-195
Wheat Germ Agglutinin ThermoFisher Scientific W834

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660 (2020).
  2. Feachem, R. G. A., et al. Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary. Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).
  3. Adolfi, A., et al. Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature Communications. 11, 5553 (2020).
  4. Kyrou, K., et al. A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes. Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).
  5. Rostami, M. N. CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections. Parasite Immunology. 42 (9), 12762 (2020).
  6. Bhatt, S., et al. Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017. Elife. 4, 09672 (2015).
  7. Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti. Mosquito News. 41 (1), 115 (1981).
  8. Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. Role of mosquito saliva in blood vessel location. Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).
  9. Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells. PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872 (2016).
  10. Rishikesh, N. Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto. Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).
  11. Jensen, D. V., Jones, J. C. The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae). Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824 (1957).
  12. Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands. Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).
  13. Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf (2015).
  14. Wells, M. B., Andrew, D. J. Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi. Parasites & Vectors. 8, 617 (2015).
  15. Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Scientific Reports. 7 (1), 601 (2017).
  16. Wells, M. B., Andrew, D. J. Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission. mBio. 10 (4), 01238 (2019).
  17. Clements, A. N. The physiology of mosquitoes. , Pergamon Press. Paris. (1963).
  18. Imms, A. D. On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen. Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).
  19. Favia, G., et al. Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).
  20. Neira Oviedo, M., et al. The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).
  21. Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation. Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).
  22. Linser, P. J., et al. Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal. Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).

Tags

Биология выпуск 175
Вскрытие и иммуноокрашивание личиночных слюнных желез комаров <em>Anopheles gambiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti,… More

Chiu, M. Z., Lannon, S., Luchetti, M., Wells, M. B., Andrew, D. J. Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes. J. Vis. Exp. (175), e62989, doi:10.3791/62989 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter