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Biology

आसंजन पदचिह्न परख द्वारा सेल रोलिंग में इमेजिंग आणविक आसंजन

Published: September 27, 2021 doi: 10.3791/63013
Automatic Translation
*1,2, *1, *1,2, *1,2, 2, 1,3, 1,2
1Department of Chemistry, The University of British Columbia, 2Biochemistry and Molecular Biology, The University of British Columbia, 3Faculty of Medicine, The University of British Columbia
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल तेजी से सेल रोलिंग आसंजन के दौरान आसंजन घटनाओं की छवि के लिए आसंजन पदचिह्न परख प्रदर्शन करने के लिए प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रस्तुत करता है।

Abstract

रोलिंग आसंजन, selectin-मध्यस्थता इंटरैक्शन द्वारा सुविधाजनक, सूजन की साइट के लिए ल्यूकोसाइट्स की भर्ती में एक अत्यधिक गतिशील, निष्क्रिय गतिशीलता है। यह घटना पोस्टकेशिका वेन्यूल्स में होती है, जहां रक्त प्रवाह एंडोथेलियल कोशिकाओं पर एक रोलिंग गति में ल्यूकोसाइट्स को धक्का देता है। स्थिर रोलिंग के लिए आसंजन बंधन गठन और उनके यांत्रिक रूप से संचालित पृथक्करण के बीच एक नाजुक संतुलन की आवश्यकता होती है, जिससे सेल को प्रवाह की दिशा में रोल करते समय सतह से जुड़ा रहने की अनुमति मिलती है। अपेक्षाकृत स्थिर वातावरण में होने वाली अन्य आसंजन प्रक्रियाओं के विपरीत, रोलिंग आसंजन अत्यधिक गतिशील है क्योंकि रोलिंग कोशिकाएं प्रति सेकंड दसियों माइक्रोन पर हजारों माइक्रोन पर यात्रा करती हैं। नतीजतन, पारंपरिक मेकानोबायोलॉजी विधियां जैसे कि कर्षण बल माइक्रोस्कोपी व्यक्तिगत आसंजन घटनाओं और संबंधित आणविक बलों को मापने के लिए अनुपयुक्त हैं, जो कम समय के पैमाने और उच्च संवेदनशीलता की आवश्यकता के कारण हैं। यहां, हम आसंजन पदचिह्न परख के हमारे नवीनतम कार्यान्वयन का वर्णन करने के लिए पी-selectin छवि: PSGL-1 आणविक स्तर पर रोलिंग आसंजन में बातचीत. यह विधि प्रतिदीप्ति पटरियों के रूप में आणविक आसंजन घटनाओं के स्थायी इतिहास का उत्पादन करने के लिए अपरिवर्तनीय डीएनए-आधारित तनाव गेज टेथर का उपयोग करती है। इन पटरियों को दो तरीकों से चित्रित किया जा सकता है: (1) दृश्य के एक बड़े क्षेत्र का उत्पादन करने के लिए हजारों विवर्तन-सीमित छवियों को एक साथ सिलाई करना, लंबाई में हजारों माइक्रोन पर प्रत्येक रोलिंग सेल के आसंजन पदचिह्न के निष्कर्षण को सक्षम करना, (2) डीएनए-पेंट का प्रदर्शन देखने के एक छोटे से क्षेत्र के भीतर प्रतिदीप्ति पटरियों की सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों का पुनर्निर्माण करने के लिए। इस अध्ययन में, आसंजन पदचिह्न परख का उपयोग एचएल -60 कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए किया गया था जो विभिन्न कतरनी तनावों पर रोलिंग करते हैं। ऐसा करने में, हम पी-सेलेक्टिन के स्थानिक वितरण की छवि बनाने में सक्षम थे: पीएसजीएल -1 इंटरैक्शन और प्रतिदीप्ति तीव्रता के माध्यम से उनके आणविक बलों में अंतर्दृष्टि प्राप्त करें। इस प्रकार, यह विधि आणविक स्तर पर रोलिंग आसंजन में शामिल विभिन्न सेल-सतह इंटरैक्शन की मात्रात्मक जांच के लिए आधार प्रदान करती है।

Introduction

रोलिंग आसंजन कैस्केड का वर्णन करता है कि रक्त वाहिका wall1 के साथ कोशिकाओं को टेदर और रोल करने के लिए कैसे परिसंचारी। निष्क्रिय रोलिंग मुख्य रूप से selectins, सेलुलर आसंजन अणुओं (CAMs) का एक प्रमुख वर्ग द्वारा मध्यस्थता की जाती है। रक्त के कतरनी प्रवाह के तहत, पी-सेलेक्टिन ग्लाइकोप्रोटीन लिगैंड -1 (पीएसजीएल -1) को व्यक्त करने वाले ल्यूकोसाइट्स पी-सेलेक्टिन के साथ अत्यधिक क्षणिक बंधन बनाते हैं, जिसे सूजन एंडोथेलियल कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त किया जा सकता है। यह प्रक्रिया ल्यूकोसाइट्स के लिए सूजन की साइट पर माइग्रेट करने के लिए महत्वपूर्ण है2। इसके अलावा, PSGL-1 भी एक mechanosensitive रिसेप्टर P-selectin3 के साथ अपनी सगाई पर रोलिंग आसंजन कैस्केड के बाद के फर्म आसंजन चरण को ट्रिगर करने में सक्षम है।

सीएएम फ़ंक्शन को प्रभावित करने वाले आनुवंशिक उत्परिवर्तन प्रतिरक्षा प्रणाली को गंभीर रूप से प्रभावित कर सकते हैं, जैसे कि ल्यूकोसाइट आसंजन की कमी (एलएडी) की दुर्लभ बीमारी में, जहां रोलिंग की मध्यस्थता करने वाले आसंजन अणुओं की खराबी गंभीर रूप से इम्यूनोकॉम्प्रोमाइज्ड व्यक्तियों की ओर ले जाती है4,5,6। इसके अलावा, परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं को एक समान रोलिंग प्रक्रिया के बाद माइग्रेट करने के लिए दिखाया गया है, जिससे मेटास्टेसिस 7,8 हो जाता है। हालांकि, क्योंकि सेल रोलिंग तेज और गतिशील है, पारंपरिक प्रयोगात्मक mechanobiology विधियां सेल रोलिंग के दौरान आणविक इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त हैं। जबकि परमाणु बल माइक्रोस्कोपी और ऑप्टिकल चिमटी जैसे एकल-सेल और एकल-अणु हेरफेर विधियां एकल-अणु स्तर 9 पर पीएसजीएल -1 के साथ पी-सेलेक्टिन की बल-निर्भर बातचीत जैसे आणविक इंटरैक्शन का अध्ययन करने में सक्षम थीं, वे सेल रोलिंग के दौरान लाइव आसंजन घटनाओं की जांच के लिए अनुपयुक्त हैं। इसके अतिरिक्त, विट्रो में विशेषता वाली बातचीत सीधे विवो में आणविक आसंजन के बारे में सवाल का जवाब नहीं दे सकती है। उदाहरण के लिए, जब कोशिकाएं अपने मूल वातावरण में काम कर रही हैं तो कौन सी आणविक तनाव सीमा जैविक रूप से प्रासंगिक है? कम्प्यूटेशनल विधियों जैसे चिपकने वाली गतिशीलता सिमुलेशन 10 या सरल स्थिर-राज्य मॉडल 11 ने कुछ आणविक विवरणों पर कब्जा कर लिया है और वे रोलिंग व्यवहार को कैसे प्रभावित करते हैं लेकिन मॉडलिंग पैरामीटर और मान्यताओं की सटीकता पर अत्यधिक निर्भर हैं। अन्य तकनीकें जैसे कर्षण बल माइक्रोस्कोपी सेल माइग्रेशन के दौरान बलों का पता लगा सकती हैं लेकिन आणविक तनाव पर पर्याप्त स्थानिक संकल्प या मात्रात्मक जानकारी प्रदान नहीं करती हैं। इन तकनीकों में से कोई भी अस्थायी गतिशीलता, स्थानिक वितरण, और आणविक बलों की परिमाण विषमता के प्रत्यक्ष प्रयोगात्मक अवलोकन प्रदान नहीं कर सकता है, जो सीधे अपने मूल वातावरण में सेल फ़ंक्शन और व्यवहार से संबंधित हैं।

इसलिए, एक आणविक बल सेंसर को लागू करना जो चयन-मध्यस्थता इंटरैक्शन को सटीक रूप से मापने में सक्षम है, रोलिंग आसंजन की हमारी समझ में सुधार करने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां, हम आसंजन पदचिह्न परख 12 के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जहां पीएसजीएल -1 लेपित मोतियों को पी-सेलेक्टिन कार्यात्मक तनाव गेज टेथर (टीजीटी) 13 प्रस्तुत करने वाली सतह पर लुढ़काया जाता है। ये टीजीटी अपरिवर्तनीय डीएनए-आधारित बल सेंसर हैं जिनके परिणामस्वरूप प्रतिदीप्ति रीडआउट के रूप में टूटने की घटनाओं का स्थायी इतिहास होता है। यह टीजीटी (dsDNA) के rupturing के माध्यम से प्राप्त किया जाता है और फिर एक फ्लोरोसेंटली लेबल पूरक स्ट्रैंड के साथ टूट टीजीटी (ssDNA) के बाद लेबलिंग। इस प्रणाली का एक प्रमुख लाभ विवर्तन-सीमित और सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग दोनों के साथ इसकी संगतता है। फ्लोरोसेंटली लेबल पूरक स्ट्रैंड को या तो विवर्तन-सीमित इमेजिंग के लिए स्थायी रूप से बाध्य (>12 बीपी) या डीएनए पेंट के माध्यम से सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए क्षणिक रूप से बाध्य (7-9 बीपी) किया जा सकता है। रोलिंग आसंजन का अध्ययन करने के लिए यह एक आदर्श प्रणाली है क्योंकि सक्रिय रोलिंग के दौरान टीजीटी टूट जाते हैं, लेकिन प्रतिदीप्ति रीडआउट का विश्लेषण पोस्ट-रोलिंग के बाद किया जाता है। दो इमेजिंग विधियां उपयोगकर्ता को रोलिंग आसंजन की जांच करने के लिए अधिक स्वतंत्रता भी प्रदान करती हैं। आमतौर पर, विवर्तन-सीमित इमेजिंग प्रतिदीप्ति तीव्रता 13 के माध्यम से आणविक टूटना बल निकालने के लिए उपयोगी है, जबकि सुपर-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग रिसेप्टर घनत्व के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। रोलिंग आसंजन के इन गुणों की जांच करने की क्षमता के साथ, यह दृष्टिकोण कतरनी प्रवाह के तहत रोलिंग कोशिकाओं के आणविक आसंजन पर बल-विनियमन तंत्र को समझने के लिए एक आशाजनक मंच प्रदान करता है।

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Protocol

1. ऑलिगोन्यूक्लियोटाइड लेबलिंग और संकरण

  1. प्रोटीन जी डाइसल्फ़ाइड बांड की कमी
    1. अल्ट्राप्योर पानी के 1 मिलीलीटर में 10 मिलीग्राम प्रोटीन जी (प्रोटजी) को भंग करें।
      नोट: प्रोटीन जी यहाँ सी टर्मिनस और एक एन टर्मिनस पॉली हिस्टिडीन टैग पर एक एकल सिस्टीन अवशेषों के साथ संशोधित किया गया है।
    2. बफर विनिमय ≥20 μL ProtG (10 मिलीग्राम / एमएल) के 1x PBS (pH 7.2) में एक P6 स्तंभ के साथ.
    3. बफर विनिमय के बाद प्रोटीन एकाग्रता को मापें।
      नोट: 7-8 मिलीग्राम / एमएल की विशिष्ट एकाग्रता।
    4. 120 mM Tris (2-carboxyethyl) फॉस्फीन (TCEP) 1x PBS (pH 7.2) के 90 μL में TCEP के 3 मिलीग्राम को भंग करके तैयार करें, इसके बाद 0.5 M EDTA के 10 μL।
      नोट: TCEP को नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए।
    5. 120 mM TCEP (480 nmol) के 4 μL को ProtG (4-5 nmol) के 20 μL में जोड़ें।
      नोट: प्रोटीन के लिए ~ 100: 1 TCEP के दाढ़ अनुपात के लिए लक्ष्य।
    6. प्रतिक्रिया को कमरे के तापमान (आरटी) पर 30 मिनट के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें।
    7. एक P6 कॉलम (बफर 1x PBS, pH 7.2 में आदान-प्रदान) के साथ कम ProtG से अतिरिक्त TCEP निकालें।
    8. एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ कम प्रोटजी की एकाग्रता को मापें और स्पेक्ट्रा को सहेजें।
      नोट: 3.5-4.5 मिलीग्राम / एमएल की विशिष्ट एकाग्रता।
  2. Sulfo-SMCC के साथ अमाइन-लेबल ssDNA प्रतिक्रिया
    1. न्यूक्लिएज मुक्त पानी में 1 mM की एकाग्रता के लिए amine-लेबल ssDNA (amine-ssDNA) को भंग करें। एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ स्ट्रैंड एकाग्रता को सत्यापित करें।
    2. 11.5 mM sulfo-SMCC (sulfo-NHS एस्टर और maleimide के साथ एक हेटेरो-bifunctional crosslinker) समाधान ताजा अल्ट्राप्योर पानी और भंवर के 400 μL में sulfo-SMCC के 2 मिलीग्राम भंग करके ताजा समाधान तैयार करने के लिए मिश्रण करने के लिए।
    3. 1 mM amine-ssDNA (6 nmol) के 6 μL को 11.5 mM sulfo-SMCC (60 nmol) के 5.2 μL और 1x PBS (pH 7.2) के 88.8 μL जोड़ें। 5 s के लिए भंवर 3 मिनट के लिए 8600 x g पर centrifugation के बाद।
    4. प्रतिक्रिया को आरटी पर 30 मिनट के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें।
    5. SMCC संयुग्मित अमाइन-ssDNA (mal-ssDNA) से अतिरिक्त sulfo-SMCC को P6 कॉलम (1x PBS, pH 7.2 में विनिमय किए गए बफर) के साथ निकालें।
    6. एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ माल-एसएसडीएनए की एकाग्रता को मापें और स्पेक्ट्रा को सहेजें।
      नोट: 35-45 μM की विशिष्ट एकाग्रता।
  3. ProtG-ssDNA संयुग्मन
    1. 4.5 मिलीग्राम / एमएल कम ProtG (3 nmol) के 21 μL को mal-ssDNA (~ 4-5 nmol) में जोड़ें।
      नोट: वॉल्यूम और सांद्रता यहाँ विशिष्ट मान हैं। व्यक्तिगत प्रयोगात्मक माप के अनुसार समायोजित करें। हमेशा ~ 1.5: 1 के अनुपात में ProtG पर mal-ssDNA की एक अतिरिक्त राशि सुनिश्चित करें।
    2. 5 s के लिए भंवर और प्रतिक्रिया को आरटी पर 3 ज के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें।
  4. ProtG-ssDNA शुद्धिकरण और लक्षण वर्णन
    1. चुंबकीय निकल-नाइट्रिलोट्रायएसिटिक एसिड (Ni-NTA) मोतियों के साथ अपने टैग अलगाव के माध्यम से संयुग्मित ProtG-ssDNA को शुद्ध करें।
    2. एक P6 स्तंभ (बफर 1x PBS, pH 7.2 में आदान-प्रदान किया गया) के साथ उत्पाद से अतिरिक्त imidazole (Ni-NTA क्षालन बफर) निकालें।
      नोट: संयुग्मन को परिमाणित करने के लिए यह चरण आवश्यक है, क्योंकि इमिडाज़ोल में 280 एनएम पर महत्वपूर्ण अवशोषण है।
    3. उत्पाद ProtG-ssDNA के स्पेक्ट्रा के साथ-साथ Ni-NTA क्षालन बफर (1x) को रिकॉर्ड करने के लिए एक UV/Vis spectrophotometer का उपयोग करें।
      नोट: 260 एनएम और 280 एनएम पर विशिष्ट ProtG-ssDNA absorbance क्रमशः 0.8 और 0.6 है।
    4. संयुग्मन दक्षता और SSDNA के लिए ProtG के अनुपात को निर्धारित करने के लिए, कस्टम-लिखित MATLAB स्क्रिप्ट (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) का उपयोग करने के लिए तीन स्पेक्ट्रा पहले एकत्र (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA मनका क्षालन बफर) के आधार पर अंतिम उत्पाद स्पेक्ट्रम को विघटित करने के लिए।
      नोट:: संक्षेप में, कोड चरण 1.4.5-1.4.8 में वर्णित के रूप में काम करता है। विशिष्ट एकाग्रता प्रोटजी-एसएसडीएनए के 4 μM है, जिसमें ProtG और ssDNA के साथ ~ 1: 1 दाढ़ अनुपात (चित्रा 2A) है।
    5. इनपुट ProtG, SMCC-स्ट्रैंड, Ni-NTA मनका क्षालन बफर, और MATLAB स्क्रिप्ट में ProtG-ssDNA UV/
    6. स्रोत स्पेक्ट्रा (ProtG, SMCC-स्ट्रैंड, और Ni-NTA मनका क्षालन बफर स्पेक्ट्रा) से ProtG-ssDNA स्पेक्ट्रा का पुनर्निर्माण करने के लिए एक बहुआयामी अप्रतिबंधित nonlinear न्यूनीकरण निष्पादित करें
      नोट:: न्यूनीकरण फ़ंक्शन आउटपुट तीन परिवर्तन कारक, प्रत्येक स्रोत स्पेक्ट्रा के लिए एक।
    7. उनके इसी कारक से स्पेक्ट्रा गुणा करके और परिवर्तित स्रोत स्पेक्ट्रा के संयोजन से ProtG-ssDNA स्पेक्ट्रा का पुनर्निर्माण करें।
    8. ProtG-ssDNA उत्पाद में SMCC-strand और ProtG की सांद्रता निर्धारित करने के लिए इसी परिवर्तन कारकों द्वारा ProtG और SMCC-स्ट्रैंड की प्रारंभिक एकाग्रता को गुणा करें।
    9. (वैकल्पिक) प्रत्येक घटक और चरण अपेक्षा के अनुरूप काम करता है यह सुनिश्चित करने में मदद करने के लिए चित्र 2B के अनुसार मूल पृष्ठ चलाएँ।
  5. TGT संकरण
    1. प्रोटजी-एसएसडीएनए (शीर्ष स्ट्रैंड) को बायोटिनिलेटेड बॉटम स्ट्रैंड के साथ 1.2: 1 के दाढ़ अनुपात में क्रमशः 240 एनएम और 200 एनएम की सांद्रता के साथ T50M5 बफर (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2) में पूर्ण TGT निर्माण को हाइब्रिड करने के लिए हाइब्रिड करें। चलो आरटी ≥1 ज पर संकरित करते हैं।

2. सतह PEGilation

  1. सतह की सफाई
    1. हर 8 coverslips के लिए एक Erlenmeyer फ्लास्क और दो धुंधला जार साफ करें। प्रत्येक कंटेनर को 1 M KOH समाधान से भरें और RT पर 1 h के लिए sonicate करें। प्रत्येक कंटेनर को अल्ट्राप्योर पानी से अच्छी तरह से धोलें और N2 के साथ या ओवन में सुखाएं।
      नोट: ढक्कन को छूने के लिए KOH को शीर्ष पर भरें, इसलिए उन्हें भी साफ किया जाता है।
    2. अल्ट्राप्योर पानी के साथ प्रत्येक कवरस्लिप को अच्छी तरह से कुल्ला करें और उन्हें साफ किए गए धुंधला जार में से एक में रखें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि वे एक दूसरे से या धुंधला जार की दीवार पर अटक नहीं रहे हैं।
    3. एक धुएं के हुड में, 250 एमएल बीकर में 90 मिलीलीटर केंद्रित (95% -98%) सल्फ्यूरिक एसिड के लिए 30 मिलीलीटर हाइड्रोजन पेरोक्साइड (30%) जोड़कर एक पिरान्हा समाधान तैयार करें।
      सावधानी: केंद्रित सल्फ्यूरिक एसिड अत्यधिक संक्षारक है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड को सल्फ्यूरिक एसिड में बहुत धीरे-धीरे जोड़ें और मिश्रण करने के लिए सावधानीपूर्वक घुमाएं।
    4. पूरी तरह से piranha समाधान के साथ धुंधला जार में coverslips जलमग्न. धुएं के हुड में 30 मिनट के लिए पिरान्हा में कवरलिप्स छोड़ दें।
      सावधानी: धुंधला जार क्रैकिंग को रोकने के लिए डालने से पहले 80 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं करने के लिए पिरान्हा समाधान को ठंडा करें।
    5. एक 1000 mL बीकर में पिरान्हा समाधान त्यागें और कांच की सफाई से 1 एम KOH के साथ बेअसर.
    6. (वैकल्पिक) एक ताजा पिरान्हा समाधान के साथ पिरान्हा सफाई (चरण 2.1.3-2.1.5) को दोहराएं।
    7. सभी अवशिष्ट पिरान्हा समाधान को हटाने के लिए अल्ट्राप्योर पानी की प्रचुर मात्रा के साथ कवरलिप्स को कुल्ला करें। हटाने की सुविधा के लिए प्रत्येक वृद्धि के दौरान धीरे से धुंधला जार हिलाएं (10 कुल्ला की सिफारिश की जाती है)।
    8. कवरस्लिप सतह से पानी को हटाने के लिए 3 बार मेथनॉल के साथ कवरस्लिप को कुल्ला करें और कवरलिप्स को मेथनॉल में डूबे रखें।
  2. सतह silanization
    1. अच्छी तरह से मेथनॉल के 94 mL, aminosilane के 1 mL, और साफ और सूखे Erlenmeyer फ्लास्क में ग्लेशियल एसिटिक एसिड के 5 mL मिश्रण द्वारा एक 1% aminosilane समाधान तैयार करें। दूसरे साफ और सूखे दाग jar14 में डालो.
    2. मेथनॉल समाधान के तहत डूबे कवरलिप्स को 1% एमिनोसिलेन समाधान वाले धुंधला जार में स्थानांतरित करें और जार को कवर रखें।
      नोट: हवा के लिए कांच की सतह के संपर्क को सीमित करने के लिए aminosilane करने के लिए स्थानांतरण करते समय coverslips सूखने की अनुमति न दें।
    3. एक ओवन 15 में 70 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए aminosilane में coverslips युक्त धुंधला जार incubate.
    4. ध्यान से एक अलग अपशिष्ट कंटेनर में aminosilane समाधान त्याग और मेथनॉल के साथ धुंधला जार में coverslips कुल्ला 5 बार aminosilane समाधान को हटाने के लिए.
    5. अल्ट्राप्योर पानी के साथ धुंधला जार में कवरलिप्स को 5 बार कुल्ला करें और उन्हें एन 2 के साथ सुखाएं।
    6. 20 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में धुंधला जार में सूखे coverslips बेक करें। कवरलिप्स को आरटी को ठंडा करने की अनुमति दें, फिर उन्हें PEGilation रैक पर रखें।
      नोट: सतह 15 पर विशेष और रासायनिक जमाव को कम करने के लिए सेंकने के दौरान एक ढक्कन के साथ धुंधला जार को कवर करें।
  3. खूंटी समाधान तैयारी
    1. Thaw PEG (Polyethylene glycol) और PEG-biotin के बारे में 30 मिनट के लिए आरटी करने के लिए।
      नोट:: यह चरण नमी संक्षेपण जो PEG पर NHS एस्टर को नीचा दिखा सकते हैं को कम करता है।
    2. अल्ट्राप्योर पानी के 10 मिलीलीटर में 84 मिलीग्राम सोडियम बाइकार्बोनेट जोड़कर पीईजी बफर बनाएं। इस सूत्रीकरण को पीएच 8.4 पर एक बफर प्रदान करना चाहिए।
    3. 8 coverslips के लिए, 20: 1 PEG: PEG-biotin के साथ एक PEGylated पक्ष के साथ प्रत्येक: PEG बफर के 400 μL में जोड़ने के लिए PEG के 100 मिलीग्राम और PEG-biotin के 5 मिलीग्राम उपाय। भंवर 30 s के लिए समाधान और अधिकतम गति (≥18000 x g) पर 1 मिनट के लिए centrifuge.
      नोट: यह चरण समय-संवेदनशील है, क्योंकि एसवीए एनएचएस-एस्टर हाइड्रोलिसिस तुरंत शुरू होता है और पीएच 8.0 पर 34 मिनट का आधा जीवन होता है, जिसमें पीएच 8.4 पर एक छोटा आधा जीवन होता है।
  4. खूंटी इनक्यूबेशन और कवरस्लिप भंडारण
    1. आर्द्रता कक्ष स्थापित करें और कवरलिप्स को अंदर रखें।
    2. नमी कक्ष में एक coverslip करने के लिए खूंटी समाधान के 90 μL जोड़ें और समान रूप से खूंटी समाधान फैलाने के लिए coverslip होल्डिंग चिमटी का उपयोग कर खूंटी समाधान के शीर्ष पर एक दूसरा coverslip जगह.
    3. सुनिश्चित करें कि समाधान में कोई बुलबुले नहीं हैं जो कवरस्लिप पर गिराए गए हैं। पहले कवरस्लिप पर दूसरे कवरस्लिप के एक छोर को कम करें और धीरे-धीरे दूसरे छोर को छोड़ दें ताकि कवरस्लिप के बीच सैंडविच किए गए बुलबुले न हों।
      नोट: बुलबुले खराब PEGylated किया जा करने के लिए कुछ क्षेत्रों का कारण होगा।
    4. तब तक दोहराएं जब तक कि सभी कवरस्लिप में पीईजी न हो (यानी, 8 कवरस्लिप = 4 पीईजी सैंडविच)। अंधेरे 16 में एक आर्द्रता कक्ष में आरटी पर रात भर (~ 12 ज) खूंटी समाधान इनक्यूबेट करें।
    5. कवरस्लिप जोड़े को अलग करें और उन्हें एक धुंधला जार में रखें। PEGylated पक्षों पर ध्यान दें।
    6. Ultrapure पानी के साथ अच्छी तरह से coverslips कुल्ला और N2 के साथ सूखी.
      नोट: चिमटी के साथ coverslips पकड़ो और सतह पर सूखने से contaminants को रोकने के लिए चिमटी की ओर सतह भर में N2 झटका.
    7. एक स्थायी मार्कर या हीरे के पेन का उपयोग कर एक कोने पर एक बिंदु के साथ गैर-PEGylated पक्ष को चिह्नित करें।
    8. PEGylated पक्षों के साथ मेलर ट्यूबों में 2 PEGylated coverslips जगह एक दूसरे का सामना करना पड़ रहा है उपयोग से पहले PEGylated पक्ष की पहचान करने में मदद करने के लिए.
    9. 5 मिनट के लिए ट्यूब वैक्यूम और N2 के साथ backfill. पैराफिल्म के साथ ट्यूब को सील करें।
    10. 6 महीने तक के लिए सील किए गए मेलर ट्यूबों में -20 डिग्री सेल्सियस पर PEGylated coverslips स्टोर करें।
      नोट:: चिप असेंबली से पहले RT करने के लिए संग्रहण ट्यूबों को गर्म करें। सीलिंग के दौरान कवरलिप्स पर संघनन रिसाव का कारण बनेगा।

3. प्रवाह कक्ष तैयारी

  1. चिप असेंबली
    1. पतले एक रेजर ब्लेड के साथ डबल-साइडेड टेप के दोनों किनारों पर एपॉक्सी की एक छोटी राशि फैलाएं।
      नोट: असेंबली के दौरान चैनल में बहुत अधिक epoxy फैल सकता है।
    2. लेजर 4 चैनल बनाने के लिए epoxy लेपित टेप में कटौती. एक 4-छेद स्लाइड और खूंटी coverslip (चित्रा 1A) के बीच epoxy टेप sandwiching द्वारा प्रवाह चिप बनाएँ.
    3. एक पिपेट टिप का उपयोग करके, एक अच्छी मुहर बनाने के लिए चैनलों की लंबाई के साथ कोमल दबाव लागू करें। ≥1 ज के लिए epoxy का इलाज.
      नोट: epoxy के खिलाफ फिसलने से बचने के लिए कांच कतरनी मत करो.
  2. चैंबर असेंबली
    1. चिप को संरेखित करें ताकि प्रत्येक चैनल का उद्घाटन एडाप्टर (चित्रा 1 ए) के केंद्रों पर स्थित हो। चिप के शीर्ष पर दो पारदर्शी ऐक्रेलिक स्पेसर रखें, ब्लॉक के बीच में फर्म दबाव लागू करें, और प्रत्येक स्पेसर के सिरों पर दो 4-40 शिकंजा में पेंच करें।
      नोट: पेंच को मजबूर न करें या स्पेसर्स पर बहुत कठिन दबाएं, या चिप क्रैक हो सकती है।
    2. ब्रैकेट के दूसरी तरफ, थ्रेडेड छेद में इनलेट्स को पेंच करें। पारदर्शी ऐक्रेलिक ब्लॉक के माध्यम से सीलिंग स्थिति की निगरानी करें।
    3. जैसा कि टयूबिंग चिप के उद्घाटन के साथ संपर्क करता है, ट्यूबिंग दक्षिणावर्त को धीरे से घुमाकर कनेक्शन को सील करें।
      नोट:: Overtightened इनलेट्स प्रवाह रुकावट का कारण हो सकता है, जबकि ढीले संपर्क रिसाव का कारण होगा।

4. सतह की तैयारी

नोट:: समग्र वर्कफ़्लो के लिए चित्र 1B को देखें।

  1. गैर-विशिष्ट बाइंडिंग को रोकने के लिए एजेंटों को अवरुद्ध करना
    1. रिसाव की जांच करने के लिए कक्ष में वॉश बफर (10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 और 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20) के 200 μL प्रवाह करने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें। यदि चैनल में बुलबुले बनते हैं, तो बुलबुले को हटाने के लिए आक्रामक रूप से एक अतिरिक्त 200 μL धक्का दें।
      नोट: इस चरण में नहीं हटाए गए बड़े हवा के बुलबुले बाद में सतह functionalization को विस्थापित और नष्ट कर सकते हैं।
    2. 10 मिनट के लिए nonspecific बाध्यकारी और इनक्यूबेट को रोकने के लिए प्रवाह कक्ष के लिए BSA (1% w / v) के 40 μL जोड़ें।
    3. प्रवाह कक्षों को भरने और इनलेट्स और आउटलेट्स पर बूंदों को बनाने के लिए प्रत्येक इनक्यूबेशन अवधि के दौरान पर्याप्त मात्रा जोड़ना सुनिश्चित करें। तदनुसार इनक्यूबेशन मात्राओं को समायोजित करें और एक आर्द्रता कक्ष में सभी ऊष्मायन प्रदर्शन करें।
    4. प्रवाह कक्ष में Tween 20 (5% v/ v) के 40 μL जोड़ें। आगे nonspecific बाध्यकारी को कम करने के लिए 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    5. (वैकल्पिक) चैनल के माध्यम से polystyrene मोतियों बह द्वारा पर्याप्त passivation के लिए सतह की जाँच करें. ProtG लेपित polystyrene मोती (0.01% w / v) के 40 μL जोड़ें और 10x उद्देश्य के साथ एक darkfield माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि। यदि मोती सतह का पालन नहीं करते हैं, तो अगले चरण पर आगे बढ़ें।
    6. सभी passivation एजेंटों को हटाने के लिए धोने बफर के 200 μL के साथ चैनल को धोएं।
  2. कक्ष पृष् ठ कार्यात्मकता
    1. प्रवाह कक्ष में स्ट्रेप्टाविडिन (100 μg / mL) के 40 μL जोड़ें और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, धोने के बफर के 200 μL के साथ धोएं।
    2. प्रवाह कक्ष के लिए संकरित ProtG-TGT (100 nM) के 40 μL जोड़ें और 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, 200 μL धोने बफर के साथ धोएं।
    3. सतह पर किसी भी unhybridized TGT नीचे स्ट्रैंड को पूरा करने के लिए 20 मिनट के लिए ProtG-TGT शीर्ष स्ट्रैंड (100 nM) के 40 μL जोड़ें। धोने बफर के 200 μL के साथ धोना.
    4. प्रवाह कक्ष में पी-सेलेक्टिन-एफसी (10 μg / mL) के 40 μL जोड़ें और 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। फिर, धोने के बफर के 200 μL के साथ धोएं।
      नोट:: इनक्यूबेशन अवधि महत्वपूर्ण है।

5. प्रयोग और इमेजिंग

  1. प्रवाह प्रणाली सेटअप
    1. रोलिंग बफर के साथ एक 5 एमएल ग्लास सिरिंज भरें (2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 0.1% BSA के साथ HBSS)। सुनिश्चित करें कि सिरिंज में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं, बुलबुले को हटाने के लिए सिरिंज के किनारों को टैप करके और उन्हें बाहर धकेलने के लिए क्योंकि वे टिप की ओर तैरते हैं।
    2. पॉलीइथिलीन टयूबिंग (आईडी: 0.38 मिमी) के ~ 200 मिमी में एक बाँझ सुई (26 जी, 5/8 इंच लंबाई) डालें; ओ.डी. 1.09 मिमी) और कांच की सिरिंज के लिए सुई कनेक्ट।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सुई कनेक्टर में कहीं भी कोई हवा फंस गई है।
    3. सिरिंज पंप पर सिरिंज को ठीक करें और सिरिंज पंप को झुकाएं जैसे कि प्लंजर पक्ष चैनल में प्रवेश करने से हवा के बुलबुले को रोकने के लिए ऊंचा है। प्रवाह कक्ष इनलेट में ट्यूब के अंत को सम्मिलित करें।
      नोट: इनलेट्स पर बूंदों को जमा करके और सिरिंज टयूबिंग के अंत में बूंदों होने से कनेक्शन बनाते समय तरल से तरल संपर्क सुनिश्चित करें। सुनिश्चित करें कि कोई भी एयर बुलबुले इनलेट में डालने से पहले सिरिंज टयूबिंग के अंत में एक छोटी सी बूंद बनाने की अनुमति देकर चैनल में प्रवेश न करें।
    4. आउटलेट में पॉलीथीन टयूबिंग के एक और 200 मिमी के एक छोर को डालें, और दूसरा छोर एक अपशिष्ट बीकर में डूबा हुआ है।
  2. कक्ष रोलिंग के लिए सेट अप करना
    1. IMDM मीडिया में 25 सेमी 2 हवादार संस्कृति फ्लास्क में एचएल -60 कोशिकाओं को 20% भ्रूण गोजातीय सीरम और 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक बढ़ाएं। 1 x 105-2 × 106 कोशिकाओं / एमएल के बीच सेल घनत्व बनाए रखें।
    2. (वैकल्पिक) 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल के प्रारंभिक घनत्व पर 1.25% डीएमएसओ युक्त एक पूर्ण IMDM माध्यम में एचएल -60 कोशिकाओं को अलग करें। कोशिकाओं को 5-6 दिनों के लिए सबसे अधिक सक्रिय होने के लिए इनक्यूबेट करें।
    3. कोशिकाओं को गोली मारने के लिए सेल निलंबन और सेंट्रीफ्यूज (200 x g, 3 मिनट) से एक नमूना (1-2 मिलीलीटर) लें।
    4. मध्यम निकालें और धीरे रोलिंग बफर के 500 μL में कोशिकाओं resuspend. सेलुलर मलबे को हटाने के लिए दो बार धोने के चरण को दोहराएं।
    5. हेमोसाइटोमीटर के साथ सेल घनत्व को मापें। 2 x 105 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व के लिए रोलिंग बफर के साथ सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
    6. ध्यान से इनलेट्स / आउटलेट से टयूबिंग को डिस्कनेक्ट करें और प्रवाह कक्ष में सेल निलंबन के पिपेट 40 μL। पहले वर्णित के रूप में टयूबिंग को फिर से कनेक्ट करें, सुनिश्चित करें कि प्रवाह चैनल में कोई बुलबुले पेश नहीं किए गए हैं।
    7. वांछित प्रवाह दरों पर सिरिंज पंप शुरू करके सेल रोलिंग प्रयोग शुरू करें।
      नोट: फ्लोरोसेंट पटरियों की तीव्रता कतरनी तनाव पर निर्भर करती है, और कम सेल वेग कतरनी तनाव / सेल वेग आम तौर पर डिमर पटरियों (चित्रा 4 ए) का उत्पादन करेगा। सतह पर उच्च सेल घनत्व या अत्यधिक रोलिंग अवधि से बचें ताकि वियोज्य एकल-सेल ट्रैक सुनिश्चित किया जा सके (चित्रा 4 बी, सी)।
    8. सेल रोलिंग मनाया जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए 10x उद्देश्य के साथ एक डार्कफील्ड माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    9. एक बार प्रयोग पूरा हो जाने के बाद, सतह सेल-मुक्त होने तक 100 एमएल / घंटा पर रोलिंग बफर को इनफ्यूज करके चैनल से कोशिकाओं को हटा दें।
  3. इमेजिंग स्थानीय पटरियों द्वारा "डीएनए-आधारित बिंदु संचय नैनोस्केल स्थलाकृति में इमेजिंग के लिए" (डीएनए-पेंट)
    1. डीएनए-पेंट बफर (0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA) में चैनल के लिए डीएनए-पेंट इमेजर स्ट्रैंड (500 pM) के 40 μL जोड़ें।
    2. कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी एक 100x तेल विसर्जन TIRF उद्देश्य लेंस का उपयोग कर प्रदर्शन. इलेक्ट्रॉन-गुणा चार्ज-युग्मित डिवाइस (EMCCD) कैमरे का उपयोग करके 300 के इलेक्ट्रॉन-गुणा (EM) लाभ पर प्रति फ्रेम 25 ms एक्सपोज़र समय के साथ 40000+ फ्रेम प्राप्त करें।
    3. स्थानीयकृत करने और सुपर-रिज़ॉल्यूशन छवियों (चित्रा 4D) 5.3.4-5.3.5 चरणों का पालन करने के लिए रेंडर करने के लिए पिकासो सॉफ़्टवेयर package17 का उपयोग करें।
    4. प्रत्येक फ्रेम में प्रत्येक fluorophore के स्थानीयकरण को निर्धारित करने के लिए स्थानीयकरण कार्यक्रम में डीएनए-पेंट फिल्म लोड करें।
      नोट:: ऑप्टिमाइज़ बॉक्स साइड लंबाई और न्यूनतम नेट ग्रेडिएंट पैरामीटर जब तक केवल fluorophores सटीक रूप से ट्रैक कर रहे हैं। न्यूनतम. नेट ग्रेडिएंट पैरामीटर अक्सर इष्टतम ट्रैकिंग प्राप्त करने के लिए 100000 से ऊपर जा सकता है। फ़िट सेटिंग: MLE, एकीकृत गाऊसी विधि सबसे अच्छा परिणाम उत्पन्न करता है। अंत में, यदि फिल्म बहुत लंबी है, तो इसे 10000 फ्रेम के ढेर में विभाजित करें ताकि स्थानीयकरण में पूर्वावलोकन ट्रैकिंग के लिए उन्हें अंतिम hdf5 फ़ाइल में पुन: संयोजित करने से पहले ठीक से काम किया जा सके।
    5. उसके बाद, बहाव सुधार और रेंडरिंग करने के लिए रेंडर प्रोग्राम में परिणामी hdf5 फ़ाइल लोड करें।
      नोट:: अंतिम परिणाम में सुधार करने के लिए RCC द्वारा Undrift के माध्यम से एकाधिक बहाव सुधार निष्पादित करें।
  4. स्थायी लेबलिंग द्वारा लंबी पटरियों इमेजिंग
    1. स्थायी इमेजर स्ट्रैंड जोड़ें और T50M5 बफर में 120 s के लिए इनक्यूबेट करें। धोने बफर के 200 μL infusing द्वारा चैनल धोएं।
    2. पृष्ठभूमि कैमरा शोर प्राप्त करने के लिए उत्तेजना लेजर बंद के साथ एक छवि रिकॉर्ड करें। टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी द्वारा ग्रिड पैटर्न में एक बड़े क्षेत्र की छवि।
      नोट:: फ़्रेम-ओवर-फ़्रेम ओवरलैप ≥10% के बाद के सिलाई के लिए अनुशंसित है।
    3. 400 x 50 छवियों (कुल में 20000 छवियों) के क्षेत्र में स्कैन करने के लिए माइक्रोस्कोप प्रोग्राम करें। फिजी प्रोग्राम का उपयोग करते हुए, कच्चे डेटा को व्यक्तिगत टिफ़ फ़ाइलों में विभाजित करें, जिनमें से प्रत्येक में अधिकतम 10000 छवियां होती हैं।
    4. रोशनी प्रोफ़ाइल (चित्रा 3A-C) का उपयोग करके सभी छवियों को समतल करें 5.4.5-5.4.7 चरणों का पालन करें।
    5. प्रत्येक फ्रेम से पृष्ठभूमि कैमरा शोर घटाएँ। प्रत्येक पृष्ठभूमि-घटाए गए फ़्रेम का माध्य स्टैक प्रोजेक्शन (रोशनी प्रोफ़ाइल) प्राप्त करें.
    6. इसके अधिकतम मान से रोशनी प्रोफ़ाइल को सामान्य करें। सामान्यीकृत रोशनी प्रोफ़ाइल द्वारा प्रत्येक पृष्ठभूमि-घटाया गया फ्रेम विभाजित करें।
    7. संबंधित बिट गहराई के लिए उपयुक्त श्रेणी के लिए सही फ़्रेम rescale।
    8. छवियों को सिलाई करने के लिए MIST18 का उपयोग करें (चित्रा 3D, E)।

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Representative Results

ऊपर प्रोटोकॉल आसंजन पदचिह्न परख की प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन करता है। सामान्य प्रयोग वर्कफ़्लो को चित्र 1 में दर्शाया गया है, प्रवाह कक्ष असेंबली (चित्रा 1A) से सतह कार्यात्मकता (चित्रा 1B) और प्रयोग और इमेजिंग चरणों (चित्रा 1C) तक।

चित्रा 2 ProtG-ssDNA bioconjugation लक्षण वर्णन के लिए एक प्रतिनिधि परिणाम है। अंतिम उत्पाद में तीन घटकों के यूवी / विस स्पेक्ट्रा, अर्थात्, प्रोटजी, माल-एसएसडीएनए, और इमिडाज़ोल क्षालन बफर, अंतिम संयुग्मन (चित्रा 2 ए) से पहले एकत्र किए गए थे, जिनमें से प्रत्येक एक ज्ञात एकाग्रता के अनुरूप था। ये स्पेक्ट्रा बायोकंज्यूगेशन उत्पाद स्पेक्ट्रम में फिटिंग के लिए ऑर्थोगोनल आधार बनाते हैं, जहां तीन अज्ञात पैरामीटर उनकी सांद्रता हैं। MATLAB में एक कस्टम फ़ंक्शन का उपयोग सांद्रता निर्धारित करने के लिए किया गया था। परिणाम SSDNA (चित्रा 2A) के लिए ProtG के लगभग 1: 1 अनुपात दिखाते हैं। यह उम्मीद के अनुसार है क्योंकि एसएसडीएनए में केवल एक अमाइन संशोधन है, और प्रोटजी में अपने सी-टर्मिनस पर इंजीनियर एक एकल सिस्टीन है। यह दृष्टिकोण पहले से रिपोर्ट किए गए दृष्टिकोण 19 के लिए अधिक फायदेमंद है, जो प्रोटजी पर प्राथमिक अमीनों की भीड़ को लक्षित करने के लिए एक एकल थिओल संशोधित डीएनए का उपयोग करता है, जहां संयुग्मन अनुपात को आसानी से बनाए नहीं रखा जा सकता है।

इसके अतिरिक्त, मूल पृष्ठ bioconjugation (चित्रा 2B) की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया गया था। डीएनए को GelGreen और प्रोटीन द्वारा क्रमशः Coomassie नीले रंग द्वारा दाग दिया जाता है। जैसा कि GelGreen ssDNA की तुलना में dsDNA को अधिक दृढ़ता से दागता है, यह उम्मीद की जाती है कि किसी भी ssDNA बैंड को dsDNA बैंड (लेन 3, 4) के बराबर दाढ़ एकाग्रता की तुलना में डिमर होना चाहिए। क्योंकि स्टॉक प्रोटजी में एक सी-टर्मिनल सिस्टीन अवशेष होता है, प्रोटीन का एक अंश एक डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड के माध्यम से डिमर बनाता है, जैसा कि लेन 5 (चित्रा 2 बी) में देखा गया है। दूसरी ओर, कम प्रोटजी, एक एकल बैंड (लेन 6) दिखाता है। सीधे डीएनए संयुग्मन में स्टॉक प्रोटजी का उपयोग करते समय, डाइसल्फ़ाइड डाइमेराइज्ड प्रोटजी डीएनए पर प्रतिक्रिया नहीं करता है और किसी भी GelGreen धुंधला (लेन 7, 8) के बिना एक बैंड के रूप में दिखाता है। ProtG डिमर बैंड संयुग्मन उत्पाद में कम ProtG (लेन 9, 10) का उपयोग करके गायब हो जाता है। क्योंकि संयुग्मन के दौरान प्रोटजी (1.5: 1) के लिए माल-एसएसडीएनए की अधिकता का उपयोग किया जाता है, टीजीटी केवल बैंड अंतिम संयुग्मन उत्पाद (लेन 8, 10) में दिखाई देते हैं। चमकीले GelGreen बैंड monomeric ProtG बैंड के साथ मेल खाता है सफल संयुग्मन और अच्छी उपज का संकेत देते हैं.

चित्रा 3 प्रतिनिधि कच्चे माइक्रोस्कोपी छवियों और बाद की छवि सिलाई और विश्लेषण के लिए उन्हें सही करने के लिए वर्कफ़्लो को दर्शाता है। एक एकल-मोड फाइबर से पेश किया गया टीआईआरएफ रोशनी प्रोफ़ाइल आमतौर पर दृश्य के क्षेत्र के बीच में उज्ज्वल होता है और किनारों के चारों ओर डिमर (चित्रा 3 ए, बी)। असमान रोशनी के लिए क्षतिपूर्ति करने और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए छवियों को समतल करने के लिए, रोशनी प्रोफ़ाइल को हजारों व्यक्तिगत फ्रेम (चित्रा 3 बी) के औसत से निर्धारित किया गया था। चपटी छवियों को कच्चे और रोशनी प्रोफाइल दोनों से कैमरा शोर घटाकर और फिर रोशनी प्रोफ़ाइल (चित्रा 3 सी) द्वारा सामान्य करके उत्पादित किया गया था। छवि समतलीकरण का प्रभाव स्पष्ट रूप से सचित्र है जब छवियों को एक बड़ी छवि बनाने के लिए सिला जाता है। किसी भी सेल पटरियों के बिना पृष्ठभूमि क्षेत्रों में छवि तीव्रता स्पष्ट आवधिक पैटर्न uncorrected छवियों (चित्रा 3 डी) के अनुरूप दिखाता है। चपटी छवियों से सिले हुए दृश्य का एक ही क्षेत्र एक सपाट पृष्ठभूमि (चित्रा 3 ई) का उत्पादन करता है। एक सपाट पृष्ठभूमि होने के नाते एक सेल ट्रैक के साथ तीव्रता के उतार-चढ़ाव की व्याख्या करने के लिए महत्वपूर्ण है। पहले प्रयोग के रूप में, चित्रा 3 एफ में सचित्र के समान एक रैंप-अप प्रवाह प्रोफ़ाइल का उपयोग स्थिर सेल रोलिंग और स्पष्ट फ्लोरोसेंट सेल ट्रैक दोनों को सुनिश्चित करने वाले प्रयोग के लिए उपयुक्त कतरनी तनाव की सीमा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। इस प्रवाह प्रोफ़ाइल के तहत एक विशिष्ट एकल-सेल आसंजन पदचिह्न चित्रा 3 जी में दिखाया गया है, जहां कतरनी तनाव बढ़ने के साथ तीव्रता बढ़ जाती है जब तक कि सेल अब उच्च कतरनी तनाव पर रोलिंग को बनाए नहीं रख सकता है और सतह से अलग नहीं हो सकता है, एक ट्रैक के अंत को चिह्नित करता है।

चित्रा 4 सबऑप्टिमल से इष्टतम प्रतिनिधि प्रयोगात्मक परिणामों के लिए संभावित परिणामों को दर्शाता है। चित्रा 4A एक सबऑप्टिमल परिणाम को दर्शाता है जहां फ्लोरोसेंट पटरियों में कम सिग्नल-टू-शोर अनुपात होता है। यह पूरी तरह से संयुग्मित जांच के कम सतह घनत्व या कम प्रवाह दर के कारण होने की संभावना है। चित्रा 4 बी एक और सबऑप्टिमल परिणाम को दर्शाता है जहां फ्लोरोसेंट पटरियों को बाद के विश्लेषण के लिए अलग-अलग पटरियों को हल करने और अलग करने के लिए बहुत घनी रूप से पैक किया जाता है। चित्रा 4 सी एक अच्छे परिणाम का एक उदाहरण है जहां व्यक्तिगत ट्रैक लंबी दूरी पर हल करने योग्य हैं और पृष्ठभूमि के खिलाफ स्पष्ट हैं। चित्रा 4 डी डीएनए-पेंट (दाएं आधे) द्वारा चित्रित एक ही ट्रैक की तुलना में विवर्तन-सीमित TIRF छवि (बाएं आधे) का एक उदाहरण है। इस सेटअप में डीएनए-पेंट 28.8 एनएम की NeNA (निकटतम-पड़ोसी-आधारित विश्लेषण) परिशुद्धता का उत्पादन करता है।

Figure 1
चित्रा 1: आसंजन पदचिह्न परख के प्रयोग वर्कफ़्लो. (ए) प्रवाह सेल और प्रवाह कक्ष की असेंबली। (बी) सतह passivation और functionalization. प्रत्येक इनक्यूबेशन चरण को अवधि द्वारा चिह्नित किया जाता है, जिसके बाद एक धोने का चरण होता है। (सी) सेल रोलिंग प्रयोग और इमेजिंग। सतह पर रोलिंग कोशिकाएं डीएनए को खोल देंगी जहां आसंजन इंटरैक्शन बनते हैं, सतह पर एसएसडीएनए को छोड़ देते हैं जो प्रत्येक आसंजन घटना के स्थान को चिह्नित करता है। सतह को व्यापक क्षेत्र इमेजिंग के लिए स्थायी इमेजर एसएसडीएनए के साथ लेबल किया गया है, जिसे धोने से पहले 2 मिनट के दाग की आवश्यकता होती है। सुपर-रिज़ॉल्यूशन डीएनए-पेंट इमेजिंग के लिए, इमेजर स्ट्रैंड को बफर में रखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: Bioconjugation लक्षण वर्णन. (ए) संयुग्मन अनुपात निर्धारित करने के लिए नी-एनटीए शुद्ध बायोकंजिगेशन उत्पाद (नीला) और वक्र फिट (लाल) का यूवी-वीआईएस अवशोषण। ProtG (magenta), mal-ssDNA (हरा), और imidazole (ग्रे) के अवशोषण स्पेक्ट्रा का उपयोग उत्पाद स्पेक्ट्रम (नीले) के लिए सबसे अच्छा फिट (लाल) बनाने के लिए घटकों के रूप में किया गया था। फिट के अवशेषों को काली धराशायी रेखा के रूप में दिखाया गया है। यह हमें शुद्ध bioconjugation उत्पाद और उनके दाढ़ अनुपात में ProtG और ssDNA की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है। (बी) जैवसंयुग्मन प्रक्रिया में घटकों का मूल पृष्ठ। पहली लेन एक कम आणविक वजन डीएनए सीढ़ी (25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 500, 766 बीपी) दिखाती है। जेल छवि झूठी रंग की है, जिसमें डीएनए-स्टेनिंग जेलग्रीन हरे रंग में और कूमासी ब्लू प्रोटीन दाग (मजेंटा में व्युत्क्रम) है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: छवि प्रसंस्करण और व्यापक क्षेत्र इमेजिंग से प्रतिनिधि परिणाम. (ए) कच्चे TIRF छवियों के हजारों एक व्यापक क्षेत्र tiling. (बी) कच्ची छवियों से व्युत्पन्न रोशनी प्रोफ़ाइल। (सी) रोशनी प्रोफ़ाइल समतल करके सही छवियों. (डी) कच्ची छवि टाइल्स से सिले हुए छवि। असमान रोशनी प्रोफ़ाइल को छवि में आवधिक पैटर्न के रूप में देखा जा सकता है। नीले और लाल बक्से छवि वर्गों को इंगित करते हैं जहां औसत तीव्रता प्रोफाइल का अनुमान लगाया जाता है (नीले और लाल निशान)। माध्य तीव्रता मान (मनमाना इकाई) 8-बिट छवियों (0-255) का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ई) (डी) के रूप में एक ही क्षेत्र, लेकिन चपटी छवियों का उपयोग करके सिला। अनुमान किसी भी बड़े पैमाने पर आवधिक पैटर्न नहीं दिखाते हैं। (एफ) कतरनी तनाव प्रोफ़ाइल कतरनी तनाव की सीमा निर्धारित करने के लिए प्रयोगों में उपयोग करने के लिए जो सेल रोलिंग और उपज प्रतिदीप्ति पटरियों के परिणामस्वरूप होता है। (जी) प्रवाह प्रोफ़ाइल के तहत एक एकल सेल से एक नमूना फ्लोरोसेंट ट्रैक (एफ) में सचित्र। सेल बाएं से दाएं यात्रा करता है, प्रतिदीप्ति तीव्रता बढ़ जाती है क्योंकि कतरनी तनाव तब तक बढ़ जाता है जब तक कि सेल अब रोलिंग को बनाए नहीं रख सकता है और सतह से अलग हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि suboptimal और इष्टतम परिणाम. (ए) अपर्याप्त विपरीत के साथ फ्लोरोसेंट पटरियों का एक उदाहरण। (बी) अत्यधिक फ्लोरोसेंट ट्रैक घनत्व का एक उदाहरण। (सी) इष्टतम ट्रैक घनत्व और इसके विपरीत का एक उदाहरण। सभी तीन छवियों को एक ही स्थिति में अधिग्रहित किया गया था, चपटा और सिला गया था। प्रत्येक छवि में लाल बक्से उस क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं जहां तीव्रता अनुमान (दाएं) लिए गए थे। (डी) विवर्तन-सीमित (बाएं आधे) और डीएनए-पेंट (दाएं आधे) इमेजिंग में दिखाया गया एक फ्लोरोसेंट ट्रैक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

समस्या संभावित कारण घोल
Epoxy टेप ठीक से कटौती नहीं Epoxy परत बहुत मोटी रेजर ब्लेड के साथ epoxy परत के रूप में ज्यादा के रूप में संभव के रूप में पतला
लेजर उत्कीर्णक शक्ति और गति अनुकूलित नहीं लेजर उत्कीर्णक शक्ति और गति का अनुकूलन
बुलबुले प्रवाह कक्ष के किनारों पर अटक अनुचित प्रारंभिक तरल परिचय बुलबुले को धोने के लिए उच्च प्रवाह दर पर चैनल के माध्यम से बफर समाधान पुश करें
बुलबुले प्रवाह कक्ष के माध्यम से पारित इनलेट और आउटलेट के माध्यम से अनुचित तरल परिचय सुनिश्चित करें कि पिपेट टिप और इनलेट के बीच तरल-से-तरल संपर्क सुनिश्चित करने के लिए इनलेट टयूबिंग पर एक तरल बूंद है
सिरिंज से बुलबुले प्रवाह लाइन में मिल गया बुलबुले प्लंजर अंत में फंस रहे हैं यह सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज पंप झुकाव
तरल चैनलों में प्रवेश नहीं कर सकता inlets खराब पर बहुत तंग सील को ऑप्टिमाइज़ करने के लिए समायोजित करें। इनलेट टयूबिंग को ठीक से खराब होने पर चैनल खोलने को छूना चाहिए।
चैनल रिसाव Epoxy पूरी तरह से ठीक नहीं हुआ है चैनलों को फिर से बनाएं, 5 मिनट तेजी से इलाज एपॉक्सी का उपयोग करना सुनिश्चित करें और कम से कम 1 घंटे के लिए इलाज करें
इनलेट्स ठीक से सील नहीं कर रहे हैं सील ऑप्टिमाइज़ करने के लिए समायोजित करें
अटकी हुई कोशिकाएं गरीब PEGilation गैर-विशिष्ट बंधन के लिए अग्रणी आदर्श रूप से, रीमेक पीईजी. इसके अतिरिक्त, अतिरिक्त ब्लॉकिंग एजेंटों (बीएसए और ट्वीन -20) को इनक्यूबेट करने और बफर धोने के लिए ब्लॉकिंग एजेंटों को जोड़ने की कोशिश कर सकते हैं।
चैनल के माध्यम से गुजरने वाले बड़े हवा के बुलबुले द्वारा नष्ट हो गई सतह passivation सुनिश्चित करें कि कोई बुलबुले चैनल के माध्यम से जाना
कोशिकाओं के साथ समस्या जमे हुए से सेल संस्कृति को पुनरारंभ करने के 2 सप्ताह बाद एचएल -60 का उपयोग करें। केवल P-selectin के साथ नियंत्रण सतह पर रोलिंग सेल की पुष्टि करें।
कोशिकाएं सतह के साथ विरल इंटरैक्शन नहीं करती हैं या होती हैं पी-सेलेक्टिन घनत्व बहुत कम है, खराब सतह कार्यात्मकता और / या खराब बायोकंजिगेशन के परिणामस्वरूप सबसे पहले, यह निर्धारित करने के लिए कि समस्या बायोकंजीकरण या सतह बायोटिन घनत्व के कारण है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए प्रोटजी-टीजीटी के बजाय प्रोटजी-टीजीटी के बजाय प्रोटजी-बायोटिन का उपयोग करें। Bioconjugation गुणवत्ता और सतह biotin घनत्व सुनिश्चित करने के बाद, TGT-ProtG और P-selectin-Fc एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय में वृद्धि।
कोशिकाएं रोल करती हैं लेकिन फ्लोरोसेंट पटरियों का उत्पादन नहीं करती हैं आसंजन इंटरैक्शन TGT टूटने के लिए बहुत कमजोर इंटरैक्शन बल को बढ़ाने के लिए रोलिंग प्रयोग के दौरान प्रवाह दर बढ़ाएं। हम इष्टतम प्रवाह दर खोजने के लिए एक प्रारंभिक रैंप अप फ्लो प्रोफ़ाइल (चित्रा 3 एफ) की सिफारिश करते हैं जो स्थिर रोलिंग और प्रतिदीप्ति पटरियों दोनों का उत्पादन करता है (चित्रा 3 जी)
खराब गुणवत्ता की सतह उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और पटरियों को देखने के लिए अपर्याप्त विपरीत की ओर जाता है सतह passivation की जाँच करें

तालिका 1: समस्या निवारण. तालिका इस परख प्रदर्शन करते समय होने वाली समस्याओं के लिए संभावित कारणों और समाधानों को सूचीबद्ध करती है

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: कस्टम-लिखित MATLAB स्क्रिप्ट तीन स्पेक्ट्रा के आधार पर अंतिम उत्पाद स्पेक्ट्रम को विघटित करने के लिए पहले एकत्र किए गए (ProtG, SMCC-strand, Ni-NTA मनका क्षालन बफर) संयुग्मन दक्षता और SSDNA के लिए ProtG के अनुपात को निर्धारित करने के लिए। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

आसंजन पदचिह्न परख सेल रोलिंग आसंजन के दौरान PSGL-1 और पी-selectin के बीच आणविक आसंजन घटनाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है। इस प्रक्रिया को पी-सेलेक्टिन-मध्यस्थता कैप्चरिंग द्वारा शुरू किया जाता है, जिसके बाद तरल पदार्थ कतरनी तनाव के तहत रोलिंग होती है। प्रयोग के दौरान संभावित मुद्दों में आमतौर पर खराब सेल रोलिंग या लापता फ्लोरोसेंट ट्रैक शामिल होते हैं, भले ही कोशिकाएं अच्छी तरह से रोल करें। ये समस्याएँ अक्सर प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर गुणवत्ता नियंत्रण के परिणामस्वरूप होती हैं, जैसा कि समस्या निवारण तालिका (तालिका 1) में सूचीबद्ध है।

बायोमोलेक्यूल्स और बफर को संदूषण को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर फ़िल्टर और संग्रहीत करने की आवश्यकता होती है क्योंकि सतह की तैयारी में कई चरण शामिल होते हैं। उच्च गुणवत्ता वाली सतह passivation उचित सतह functionalization घनत्व को प्राप्त करने और biomolecules के nonspecific बंधन को कम करने के लिए एक आवश्यकता है। सतह पर बायोमोलेक्यूल्स का गैर-विशिष्ट बंधन एक उच्च प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि बना सकता है, जो एकल-अणु प्रतिदीप्ति इमेजिंग और सांख्यिकीय डेटा विश्लेषण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। कई कारक सतह passivation को प्रभावित कर सकते हैं। एमिनोसिलेन और पीईजी-एनएचएस के हाइड्रोलिसिस से पीईजिलेशन की बहुत कम दक्षता प्राप्त होती है। पर्याप्त KOH धुलाई और पिरान्हा सफाई कांच की सतह पर मुक्त हाइड्रॉक्सिल समूहों को उत्पन्न करके हाइड्रोफिलिसिटी को बढ़ाती है, जिससे रासायनिक रूप से प्रतिक्रियाशील समूह का घनत्व बढ़ जाता है। कोशिकाओं को खराब passivated सतहों पर फंस जाएगा। सतह passivation की गुणवत्ता से पहले और फ्लोरोसेंट biomolecules का उपयोग PEGilation के बाद पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा जाँच की है.

लिगेंड की सतह घनत्व सेल रोलिंग के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है, जिसे पीईजी द्वारा नियंत्रित किया जाता है: पीईजी-बायोटिन अनुपात, टीजीटी संकरण, और पी-सेलेक्टिन बाइंडिंग। इस प्रणाली में, एक पीईजी: 20: 1 का पीईजी-बायोटिन अनुपात सेल रोलिंग के लिए पर्याप्त पी-सेलेक्टिन के साथ सतह कार्यात्मकता के लिए पर्याप्त है। कुशल टीजीटी संकरण भी सतह घनत्व और फ्लोरोसेंट पटरियों के सिग्नल-टू-शोर अनुपात में सुधार करता है। इस प्रोटोकॉल में शीर्ष-स्ट्रैंड-टीजीटी-प्रोटजी का एक पुनर्भरण चरण शामिल है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि किसी भी अस्वास्थ्यकर टीजीटी बॉटम स्ट्रैंड को प्रयोगों से पहले पूरक किया जाता है। प्रोटजी के लिए डीएनए का संयुग्मन भी सतह घनत्व को प्रभावित करता है। Sulfo-SMCC linker को डीएनए में 10 गुना दाढ़ अतिरिक्त पर जोड़ा गया था ताकि सभी डीएनए लिंकर के साथ प्रतिक्रिया कर सकें। सी-टर्मिनस पर एक एकल सिस्टीन अवशेषों (प्रोटजी-साइस) के साथ प्रोटजी का उपयोग 1: 1 डीएनए: प्रोटजी संयुग्मन अनुपात प्राप्त करने के लिए किया गया था। क्योंकि ProtG-Cys डाइसल्फ़ाइड बांड के माध्यम से डिमर बना सकता है, सल्फहाइड्रिल-प्रतिक्रियाशील क्रॉस-लिंकिंग प्रतिक्रियाओं से पहले डाइसल्फ़ाइड बॉन्ड को कम करने के लिए TCEP के उपचार की आवश्यकता होती है। प्रोटीन-संयुग्मित डीएनए और टीजीटी संकरण को देशी पेज विश्लेषण के साथ मान्य किया जा सकता है, जिसमें संयुग्मित डीएनए और डीएनए डुप्लेक्स आणविक वजन की वृद्धि के कारण मंद गतिशीलता दिखाएंगे। असेंबली दक्षता का अनुमान जेल डेन्सिटोमेट्री (चित्रा 2 बी) द्वारा भी लगाया जा सकता है। सावधानीपूर्वक PEGilation और bioconjugation प्रक्रियाओं एक सुसंगत सतह के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण हैं। कभी-कभी, सेल स्थिति सेल रोलिंग और ट्रैक गठन को प्रभावित कर सकती है। यद्यपि सेल घनत्व पर पीएसजीएल -1 अभिव्यक्ति की सूचना नहीं दी गई है, सेल घनत्व विकास चरण के दौरान सेल चक्र और प्रोटीन अभिव्यक्ति का एक शक्तिशाली नियामक है।

यह देखते हुए कि पीएसजीएल -1 सिग्नल ट्रांसडक्शन रिसेप्टर के रूप में भी कार्य करता है और सेल प्रसार को नियंत्रित करता है20,21, सेल घनत्व जैसी संस्कृति की स्थिति को पीएसजीएल -1 की सुसंगत अभिव्यक्ति स्तर और बाध्यकारी क्षमता के लिए बनाए रखा जाता है। सतह पर ProtG द्वारा मध्यस्थता पी-selectin-Fc का लगाव आसंजन और कोशिकाओं के रोलिंग के लिए महत्वपूर्ण है। ProtG के लिए P-selectin के बाध्यकारी कैनेटीक्स एकाग्रता पर निर्भर है। पी-सेलेक्टिन की कम सांद्रता संतुलन तक पहुंचने के लिए समय की वृद्धि का कारण बनती है। 100 nM22 से कम सांद्रता के लिए संतृप्ति बंधन के लिए कम से कम 30 मिनट की आवश्यकता होती है। पी-सेलेक्टिन के 10 एनएम का उपयोग सतह पर गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए किया गया था और प्रोटजी के साथ पर्याप्त बातचीत के लिए इनक्यूबेशन समय में वृद्धि हुई थी। एक 1 ज इनक्यूबेशन इस प्रणाली में सेल आसंजन और रोलिंग को प्रेरित करने के लिए पर्याप्त समय है।

टीजीटी और इसके संबंधित बल-निर्भर जीवनकाल इस परख के परिणामों में एक महत्वपूर्ण कारक है। रोलिंग आसंजन के दौरान, टेदर पर बल टीजीटी और पी-सेलेक्टिन दोनों के माध्यम से प्रेषित किया जाता है: पीएसजीएल -1 इंटरैक्शन। इन व्यक्तिगत घटकों में से प्रत्येक में एक अद्वितीय बल-निर्भर जीवनकाल होता है, और लागू बल के आधार पर, टूटने की संभावना दूसरे पर एक के पक्ष में होगी। उदाहरण के लिए, यह दिखाया गया है कि इस लेख में वर्णित टीजीटी का उपयोग करते समय, 13.6 पीएन से नीचे बलों पर, पी-सेलेक्टिन: पीएसजीएल -1 मुख्य रूप से अलग हो जाता है, जबकि 13.6 पीएन से ऊपर, टीजीटी मुख्य रूप से 13 को अलग करता है। यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है जब इस परख प्रदर्शन क्योंकि अगर कतरनी तनाव बहुत कम है या मोती बहुत धीमी गति से रोलिंग कर रहे हैं, टूटना घटनाओं मुख्य रूप से पी-selectin होगा: PSGL-1 बातचीत, और वहाँ कम से कम या TGTs से कोई औसत दर्जे का प्रतिदीप्ति संकेत हो जाएगा. टीजीटी की तनाव सीमा भी परिणामों को प्रभावित करेगी। यदि टीजीटी एक बल के बहुत अधिक पर टूट जाता है, तो टूटने की घटनाएं मुख्य रूप से पी-सेलेक्टिन होंगी: पीएसजीएल -1, और न्यूनतम प्रतिदीप्ति संकेत होगा।

यहां वर्णित विधि आणविक टूटना बलों के विश्लेषण के साथ-साथ रोलिंग आसंजन में शामिल आणविक आसंजन घटनाओं के स्थानों के लिए अनुमति देती है। आसंजन के वास्तविक समय का पता लगाने के बजाय, इस विधि का सबसे महत्वपूर्ण लाभ यह है कि यह पोस्ट-एक्सपेरिमेंट इमेजिंग और विश्लेषण की अनुमति देता है। एक बार आसंजन पदचिह्न को एसएसडीएनए के रूप में सतह पर छोड़ दिया गया है, पटरियों को अभी भी 12 घंटे के बाद चित्रित किया जा सकता है यदि प्रवाह चैनलों को अंधेरे आर्द्रता कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज में बनाए रखा जाता है, जिसमें इनलेट्स और आउटलेट दोनों सूखने को रोकने के लिए अवरुद्ध होते हैं। इस परख के लिए प्रतिदीप्ति readout की व्याख्या चुना इमेजिंग विधि पर निर्भर है. सुपर संकल्प इमेजिंग के माध्यम से, इस परख उच्च स्थानिक संकल्प (<50 एनएम) है कि टूट TGTs13 के घनत्व के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है प्राप्त करता है. रिसेप्टर घनत्व या टूट टीजीटी घनत्व का विश्लेषण विभिन्न परिस्थितियों में रोलिंग आसंजन व्यवहार की जांच करने में उपयोगी होगा। इसके विपरीत, विवर्तन-सीमित इमेजिंग एक उच्च स्थानिक संकल्प प्रदान नहीं करता है; हालांकि, यह एक बड़े सतह क्षेत्र को देखने के सैकड़ों क्षेत्रों में कई मोतियों के प्रतिदीप्ति पटरियों का विश्लेषण करने के लिए चित्रित करने की अनुमति देता है। यह लाभप्रद है क्योंकि एक ट्रैक की प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण एक बड़ी दूरी पर एक एकल मनका के लिए किया जा सकता है जो समय के साथ रोलिंग व्यवहार में परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रदान करता है। इस तरह का एक उदाहरण समय के साथ कतरनी तनाव को बदल रहा है और प्रतिदीप्ति तीव्रता में संबंधित परिवर्तनों को देख रहा है। हाल ही में, यह दिखाया गया है कि एक साधारण मॉडल के माध्यम से, पटरियों की प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग आणविक बल वितरण का अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है। इस परख23 के साथ बल परिमाणीकरण प्राप्त करने के लिए ratiometric तरीकों का संभावित अनुप्रयोग भी है।

क्योंकि सेल रोलिंग तेजी से होता है (μm / s के 10s) और एक विस्तारित दूरी (μm के 1000s) पर, उनके आणविक तनाव का अध्ययन पारंपरिक वास्तविक समय आणविक तनाव सेंसर के साथ चुनौतीपूर्ण रहा है। आसंजन पदचिह्न परख पोस्ट घटना इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए इस मांग बाधा को तोड़ता है। यद्यपि टीजीटी टूटना घटना सीधे टूटने से पहले अनुभव किए गए तनाव के परिमाण की रिपोर्ट नहीं करती है, रोलिंग आसंजन 13,23,24 में शामिल आणविक बलों की मात्रात्मक जांच के लिए अनुमति देने के लिए प्रतिदीप्ति पटरियों के विश्लेषण में आशाजनक विकास किए गए हैं।

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Disclosures

लेखकों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

इस काम को कनाडा फाउंडेशन ऑफ इनोवेशन (सीएफआई 35492), कनाडा डिस्कवरी ग्रांट के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (आरजीपीआईएन-2017-04407), रिसर्च फंड में नई सीमाएं (NFRFE-2018-00969), माइकल स्मिथ फाउंडेशन फॉर हेल्थ रिसर्च (SCH-2020-0559), और ब्रिटिश कोलंबिया एमिनेंस फंड विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-channel drill guide Custom made 3D printed with ABS filament
4-holes slide Custom made Drill clean microscope slide using a Dremel with diamond coated drill bits on a 4-channels drill guide which has a layout that matches with the centers of the 8-32 threaded holes on the aluminum clamp.
Acetone VWR BDH1101-4LP
Acrylic spacer Custom made Cut two blocks of acrylic sheets with the dimension of 40 mm x 30 mm x 2.5 mm. On each block, drill two 3 mm holes that are precisely aligned with the 4-40 holes on the aluminium holder.
Aluminium chip holder Custom made Machine anodized aluminium block into a C-shaped holder with the outer dimension of 640 mm x 500 mm x 65 mm and the opening dimension of 400 mm x 380 mm x 65 mm. Inlets and outlets are tapped with 8-32 thread.
Aminosilane AlfaAesar L14043 CAS 1760-24-3
Antibiotic/antimycotic solution Cytiva HyClone SV3007901 Pen/Strep/Fungiezone
Beads, ProtG coated polystyrene Spherotech PGP-60-5
Bovine serum albumin VWR 332
Buffer, DNA PAINT 0.05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM EDTA
Buffer, T50M5 10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2
Buffer, Rolling HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% BSA
Buffer, Wash 10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 and 2 mM CaCl2, 0.05% Tween 20
Calcium chloride VWR BDH9224
Cell culture flasks VWR 10062-868
Concentrated sulfuric acid VWR BDH3072-2.5LG 95-98%
Coverslip holding tweezers Techni-Tool 758TW150
Diamond-coated drill bits Abrasive technology C5250510 0.75 mm diamond drill
DNA, amine-ssDNA (top strand) IDT DNA Custom oligo CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/
DNA, biotin-ssDNA (bottom strand) IDT DNA Custom oligo /5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG
DNA, imager strand for DNA-PAINT IDT DNA Custom oligo GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/
DNA, imager strand for permanent labelling IDT DNA Custom oligo CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/
Double-sided tape Scotch 237 3/4 inch width, permanent double-sided tape
EDTA Thermofisher 15575020 0.5 M EDTA, pH 8.0
Epoxy Gorilla 42001 5 minute curing time
Fetal Bovine Serum (FBS) Avantor 97068-085
GelGreen Biotium 41005
Glacial acetic acid VWR BDH3094-2.5LG
Glass, Coverslips Fisher Scientific 12-548-5P
Glass, Microscope slide VWR 48300-026 75 mm x 25 mm x 1 mm
Glass, Staining jar VWR 74830-150 Wheaton Staining Jar (900620)
Hanks' Balanced Salt solution (HBSS) Lonza 04-315Q
Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA
HL-60 cells ATCC CCL-240
Humidity chamber slide support Custom made 3D printed with ABS filament
Hydrogen peroxide VWR BDH7690-1 30%
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Inlets/outlets Custom made Drill through eight 8-32 set screws using cobalt drill bits. Insert 1.5 cm  polyethylene tubing (Tygon, I.D. 1/32” O.D. 3/32”) into each hollow setscrew
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM) Lonza 12-722F
Magnesium chloride VWR BDH9244
Magnetic Ni-NTA beads Invitrogen 10103D
Mailer tubes EMS EMS71406-10
Methanol VWR BDH1135-4LP
Micro Bio-Spin P-6 Gel Columns Biorad 7326200 In SSC Buffer
PEG Laysan Bio MPEG-SVA-5000
PEG-biotin Laysan Bio Biotin-PEG-SVA-5000
Potassium hydroxide VWR 470302-132
Protein, Protein G Abcam ab155724 N-terminal His-Tag and C-terminal cysteine
Protein, P-selectin-Fc R&D System 137-PS Recombinant Human P-Selectin/CD62P Fc Chimera Protein, CF
Protein, Streptavidin Cedarlane CL1005-01-5MG
Pump Syringe Harvard Apparatus 704801
Sodium bicarbonate Ward’s Science 470302-444
Sodium chloride VWR 97061-274
Sulfo-SMCC Thermofisher 22322
Syringe Hamilton 81520 Syringes with PTFE luer lock, 5 mL
Syringe needles BD 305115 Precision Glide 26 G, 5/8 Inch Length
TCEP Sigma-Aldrich C4706-2G
Tris VWR BDH4502-500GP
Tubing, Adaptor Tygon ABW00001 Formulation 3350, I.D. 1/32”; O.D. 3/32”
Tubing, Polyethylene BD Intramedic 427406 Intramedic (PE20) I.D. 0.38mm; O.D. 1.09mm
Tween-20 Sigma-Aldrich 93773

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References

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जीव विज्ञान मुद्दा 175 रोलिंग आसंजन ल्यूकोसाइट selectin पी-selectin ग्लाइकोप्रोटीन लिगैंड -1 (PSGL-1) आणविक बल सेंसर आसंजन पदचिह्न परख तनाव गेज टेदर (TGT) नैनोस्केल स्थलाकृति (डीएनए-पेंट) में इमेजिंग के लिए डीएनए-आधारित बिंदु संचय
आसंजन पदचिह्न परख द्वारा सेल रोलिंग में इमेजिंग आणविक आसंजन
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An, S. M., Kim, S. H., White, V. J., … More

An, S. M., Kim, S. H., White, V. J., Yasunaga, A. B., McMahon, K. M., Murad, Y., Li, I. T. S. Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay. J. Vis. Exp. (175), e63013, doi:10.3791/63013 (2021).

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