يوضح هذا البروتوكول كيفية استخدام مضيف النبات للكشف عن البروتينات اللعابية لنطاط الأوراق والبروتينات الفيروسية النباتية التي تطلقها ناقلات نطاط الأوراق.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف عن الفيروسات والبروتينات اللعابية لناقل نطاط الأوراق في مضيف النبات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تنقل ناقلات الحشرات أفقيا العديد من الفيروسات النباتية ذات الأهمية الزراعية. ينتقل أكثر من نصف فيروسات النبات عن طريق الحشرات النصفية التي لها أجزاء فم خارقة مصة. أثناء انتقال الفيروس ، يربط لعاب الحشرات مضيف الفيروس الناقل لأن اللعاب ينقل الفيروسات ، وبروتينات الحشرات ، تحفز أو تثبط الاستجابة المناعية للنباتات من الحشرات إلى مضيفات النباتات. أصبح تحديد البروتينات اللعابية وتحليلها وظيفيا مجالا جديدا للتركيز في مجال البحث في تفاعلات الفيروسات المنقولة بالمفصليات مع المضيف. يوفر هذا البروتوكول نظاما للكشف عن البروتينات في لعاب نطاطات الأوراق باستخدام مضيف النبات. ومن الأمثلة على ذلك ناقل نطاط الأوراق Nephotettix cincticeps المصاب بفيروس قزم الأرز (RDV). يمكن الكشف عن vitellogenin وبروتين القفيصة الخارجي الرئيسي P8 من RDV المتجه بواسطة لعاب N. cincticeps في وقت واحد في نبات الأرز الذي يتغذى عليه N. cincticeps. هذه الطريقة قابلة للتطبيق لاختبار البروتينات اللعابية التي يتم الاحتفاظ بها بشكل عابر في مضيف النبات بعد تغذية الحشرات. ويعتقد أن نظام الكشف هذا سيفيد دراسة تفاعلات فيروس نصف الدم أو النبات النصفي.
المقدمة
إن طريقة انتقال الفيروسات المنقولة بالمفصليات ذات النواقل والمضيف ، وهي مشكلة أساسية ، هي في حدود العلوم البيولوجية. تنتقل العديد من الفيروسات النباتية ذات الأهمية الزراعية أفقيا عن طريق ناقلات الحشرات1. يتم نقل أكثر من نصف فيروسات النبات بواسطة الحشرات النصفية ، بما في ذلك حشرات المن ، والذباب الأبيض ، ونطاطات الأوراق ، ونطاطات النبات ، والتريبس. هذه الحشرات لها سمات مميزة تمكنها من نقل فيروسات النبات بكفاءة1. لديهم أجزاء فم مص خارقة ويتغذون على النسغ من اللحاء ونسيج الخشب ، ويفرزون لعابهم1،2،3،4.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم نشر نطاطات الأوراق البالغة غير الخبيثة في مركز أبحاث الفيروسات المنقولة بالنواقل في جامعة فوجيان للزراعة والغابات ، الصين.
1. تربية الحشرات غير المميتة
- قم بتربية البالغين على شتلات الأرز في قفص مكعب بحجم 40 سم × 35 سم × 20 سم (الطول × العرض × الارتفاع). احتفظ بجانب واحد من القفص مغطى بشبكة مقاومة للحشرات للتهوية.
- احتفظ بالأقفاص مع نطاطات الأوراق في حاضنة تحتوي على وحدة تحكم مدمجة في الرطوبة عند 26 درجة مئوية مع رطوبة نسبية تتراوح بين 60-75٪ تحت فترة ضوئية تبلغ 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات مظلمة.
- استخدم شفاطا لنقل جميع البالغين برفق من قفصهم إلى قفص جديد يحتوي على شتلات الأرز الطازجة كل أسبوع.
- د....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يوضح الشكل 1 جميع الخطوات في هذا البروتوكول: تربية الحشرات ، واكتساب الفيروسات ، وجمع البروتينات اللعابية عن طريق تغذية الأرز ، واللطخة الغربية. أظهرت نتائج البقع الغربية أنه لوحظت نطاقات محددة ومتوقعة تبلغ حوالي 220 كيلو دالتون في عينات تغذية الأرز والغدد اللعابية للحشرات على الغشاء المحتضن بالأجسام المضادة ضد Vg. في المقابل ، لم يلاحظ أي شريط في عينة الأرز غير المغذية. تشير النتيجة في الشكل 2 إلى أن Vg تم إطلاقه إلى مضيف النبات باعتبا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يلعب اللعاب الذي تفرزه الغدد اللعابية مباشرة للحشرات الماصة للثقب دورا محوريا لأنه يهضم ويزيل السموم من الأنسجة المضيفة والعوامل البيولوجية عبر المملكة في المضيفين1،3،4. العوامل البيولوجية عبر المملكة ، بما في ذلك المستنبطات والمستجيبات والحمض النووي الريبي الصغير ، ضرورية للتواصل بين الحشراتالمضيفة 14،15،16. لذلك ، فإن الكشف عن المزيد .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31772124 و 31972239) وجامعة فوجيان للزراعة والغابات (Grant KSYLX014).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي > كواشف < / قوي > | |||
| تريس قاعدة | روش | D609K69032 | لمدة 5 مرات ؛ عازلة تريس جلايسين و 10 مرات ؛ TBS المخزن المؤقت |
| تحضير الجلايسين | سيجما ألدريتش | WXBD0677V | ل 5 & مرات ؛ تحضير المخزن المؤقت Tris-glycine |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | ل 5 مرات ؛ تحضير المخزن المؤقت Tris-glycine |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd | 10019318 | لمدة 10 مرات ؛ TBS المخزن المؤقت |
| إعداد KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd | 10016318 | لمدة 10 مرات ؛ TBS المخزن المؤقت |
| للتحضير ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | ل 4 مرات تحضير عينة البروتين العازلة |
| بروموفينول الأزرق | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | ل 4 مرات تحضير عينة البروتين العازلة |
| الجلسرين | Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd | 10010618 | ل 4 مرات تحضير عينة البروتين العازلة |
| الميثانول | Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd | 10014118 | لإعداد المخزن المؤقت للنقل |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE & TeCHNoLoGY | CT30111220 | لتحضير TBST |
| الحليب الجاف الخالي من الدسم | Becton.Dickinso وشركاه | 252038 لحجب الأغشية ، الأجسام المضادة | |
| الماعز المضادة للأرانب IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | التعرف على مجموعة ECL |
| الغربية | الأولية والجسم ThermoFisher Scientific | 32209 | الركيزة |
| الكيميائية النيتروسليلوز غشاء | Pall Corporation | 25312915 | لنقل البروتينات |
| < قوي > مخازن وحلول < / قوي > | |||
| <قوي > عازلة < / قوي > | < قوي > تكوين < / قوي > | < قوي > تعليقات / وصف < / قوي > | |
| ؛ 5 وأقات. عازلة تريس جلايسين | 15.1 جم تريس بيس 94 جم جلايسين ؛ 5 جم SDS في 1 لتر ماء | ; حل المخزون | |
| 1 & مرات ؛ عازلة تريس جلايسين | 200 مل من 5 & مرات ؛ محلول عمل Tris-glycine Buffer 800 مل من الماء | المعقم ، ل SDS-PAGE | |
| 10 & مرات ؛ محلول ملحي مخزن مؤقت من Tris (TBS) | 80 جم كلوريد الصوديوم 30 جم قاعدة Tris 2 جم KCl في 1 لتر محلول مخزون | ||
| الماء المعقم TBS مع محلول Tween 20 (TBST) | 100 مل 10 مرات ؛ محلول TBS 3 مل توين 20 900 مل ماء | محلول عمل | |
| 4 مرات ؛ عازلة عينة البروتين | 8 جم SDS 4 مل ß ؛ -mercaptoethanol 0.02 جم بروموفينول أزرق 40 مل جلسرين في 40 مل 0.1 م Tris-HCl (درجة الحموضة 6.8) | لاستخراج البروتين | |
| نقل المخزن | المؤقت 800 مل عازلة Tris-glycine 200 مل من الميثانول | ل نقل البروتين | |
| < قوي > الأدوات < / قوي > | |||
| بروموفينول الأزرق | سيجما ألدريتش | SHBL3668 | لإعداد عازلة عينة بروتين 4x |
| حاضنة درجة حرارة | ثابتة نينغبو سايفو للأدوات التجريبية المحدودة | PRX-1200B | لتربية نطاطات الأوراق |
| الرحلان الكهربائي | Tanon Science & التكنولوجيا المحدودة | Tanon EP300 | لوحدة |
| النقل الكهربائي الأساسية | SDS-PAGE BIO-RAD | 1703935 | ل SDS-PAGE |
| الجلسرين | Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd | 10010618 | لتحضير عازلة عينة البروتين 4x |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | لتحضير عازلة Tris-glycine |
| الماعز المضادة للأرانب IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | التعرف على |
| أداة طحن الأنسجة الأولية وعالية التمرير | Shanghai Jingxin Industrial Development Co.، Ltd. | JXFSIPRP-24 | لطحن الأنسجة النباتية |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd | 10016318 | لإعداد العازلة 10x TBS |
| الميثانول | Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd | 10014118 لإعداد عازلة النقل | |
| الصغير الحوض الصغير لنقل الحرارة | الرطب BIO-RAD | 1703930 | ل SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co.، Ltd | 10019318 | لتحضير 10x TBS |
| غشاء النيتروسليلوز | Pall | Corporation 25312915 | للبروتينات نقل |
| الحليب الجاف الخالي من الدسم | Becton.Dickinso والشركة | 252038 | لحجب الأغشية ، تخفيف الأجسام المضادة |
| Pierce ECL Western Kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | الركيزة الكيميائية |
| أداة لون البروتين | GE العلوم الحيوية للرعاية الصحية AB | Amersham lmager 600 | للكشف عن البروتينات SDS |
| Sigma-Aldrich | SLCB4394 | لتحضير 5x Tris-glycine Buffer | |
| Tris | Roche | D609K69032 ل 5x Tris-glycine buffer و 10 & times ؛ إعداد المخزن المؤقت TBS | |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE & TeCHNoLoGY | CT30111220 | لإعداد TBST |
| خزان الرحلان الكهربائي للوحة العمودية | BIO-RAD | 1658001 | لحمام مائي SDS-PAGE |
| Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co.، Ltd. | XMTD-8222 | لغلي عينات البروتين | |
| & beta mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | لتحضير عينة البروتين 4x |
المراجع
- Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. Insect vector interactions with persistently transmitted viruses. Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).
- Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. Encyclopedia of Insects. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amste....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
