Questo contributo descrive come impostare la cristallizzazione delle proteine su dispositivi cristallo su cristallo e come eseguire la raccolta automatica di dati seriali a temperatura ambiente utilizzando la piattaforma di cristallizzazione su chip.
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Articolo metodologico
Cristallizzazione su chip e diffrazione seriale su larga scala a temperatura ambiente
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le reazioni biochimiche e i processi biologici possono essere meglio compresi dimostrando come le proteine passano tra i loro stati funzionali. Poiché le temperature criogeniche non sono fisiologiche e possono prevenire, scoraggiare o addirittura alterare la dinamica strutturale delle proteine, è altamente auspicabile un metodo robusto per esperimenti di diffrazione a raggi X di routine a temperatura ambiente. Il dispositivo cristallo su cristallo e l'hardware e il software di accompagnamento utilizzati in questo protocollo sono progettati per consentire la diffrazione a raggi X in situ a temperatura ambiente per cristalli proteici di diverse dimensioni senza alcuna manipolazione del campione. Qui presentiamo i protocolli per i passaggi chiave dall'assemblaggio del dispositivo, alla cristallizzazione su chip, alla scansione ottica, al riconoscimento dei cristalli, alla pianificazione dei colpi a raggi X e alla raccolta automatica dei dati. Poiché questa piattaforma non richiede la raccolta di cristalli né altre manipolazioni del campione, centinaia di migliaia di cristalli proteici cresciuti su chip possono essere introdotti in un fascio di raggi X in modo programmabile e ad alto rendimento.
Introduzione
A causa degli effetti ionizzanti delle radiazioni a raggi X, la cristallografia delle proteine, in larga misura, è stata limitata alle condizioni criogeniche negli ultimi tre decenni. Pertanto, l'attuale conoscenza dei movimenti delle proteine durante la sua funzione deriva in gran parte da confronti tra strutture statiche osservate in diversi stati in condizioni criogeniche. Tuttavia, le temperature criogeniche ostacolano inevitabilmente la progressione di una reazione biochimica o l'interconversione tra diversi stati conformazionali mentre le molecole proteiche sono al lavoro. Per osservare direttamente la dinamica strutturale delle proteine a risoluzione atomica me....
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Protocollo
1. Pre-assemblaggio del dispositivo
- Etichettare l'anello esterno (diametro 30 mm) per l'identificazione del campione. Se necessario, includere il nome del progetto, il numero del dispositivo, la condizione di cristallizzazione e la data (Figura 1A). Posizionare l'anello esterno capovolto su una superficie pulita (Figura 1B) e posizionare con attenzione un wafer di quarzo all'interno dell'anello (Figura 1C). Questo primo wafer di quarzo funge da finestra d'ingresso per i raggi X incidenti.
- Versare una piccola quantità di olio da immersione al m....
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Risultati
Negli ultimi anni sono stati pubblicati diversi set di dati rappresentativi 10,12 insieme ai risultati cristallografici e ai risultati scientifici di una vasta gamma di campioni proteici, tra cui proteine ed enzimi fotorecettoriali, ad esempio, un fotorecettore UV-B UVR8, una fotoliasi di riparazione del DNA guidata dalla luce PhrB10, una nuova proteina sensibile alla luce rossa da una istidina chinasi sensoriale multidominio 14
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Discussione
La cristallografia delle proteine nei primi anni condotta a temperatura ambiente ha incontrato enormi difficoltà nel combattere i danni da radiazioni a raggi X. Pertanto, è stato sostituito dal metodo criocristallografico più robusto poiché le sorgenti di raggi X di sincrotrone sono diventate prontamente disponibili20. Con l'avvento dei laser a elettroni liberi a raggi X, la cristallografia proteica a temperatura ambiente è stata rianimata negli ultimi anni, con molti nuovi sviluppi guidati dal de.......
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Dichiarazioni
ZR è l'inventore dei chip cristallo su cristallo sul brevetto statunitense 9632042 concesso a Renz Research, Inc.
Ringraziamenti
L'uso di Advanced Photon Source, una struttura dell'Office of Science User gestita per il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti dall'Argonne National Laboratory, è stato supportato dal contratto DE-AC02-06CH11357. L'uso di BioCARS è stato sostenuto dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health con il numero di sovvenzione R24GM111072. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. L'uso del settore LS-CAT 21 è stato sostenuto dalla Michigan Economic Development Corporation e dalla sovvenzione Michigan Technology Tri-Cor....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Software di analisi | Sviluppato | ||
| Granato di ittrio e alluminio drogato con cerio | Forniture MSE Substrati | monocristallini Ce:Y3Al5O12, YAG | |
| Portachip Sviluppato | internamente | ||
| Software di controllo | Olio da immersione sviluppato | ||
| Cargille Laboratories | 16482 | Tipo A basso viscosità 150 cSt | |
| piattaforma inSituX | internamente | ||
| Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED con lente in vetro, 1085 nm, 5 mW, microscopio TO-18 | |
| Zeiss | SteREO Discovery V8 | ||
| Anello esterno Piastra di | sviluppata | ||
| Fisher Scietific | FB0875713 | ||
| Pipetta | Pipetman | F167380 | P10 |
| Pompa laser | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø 9 mm, codice pin E, diodo laser |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Anello | ||
| Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 Anello di ritenzione per Ø 1" tubi per lenti e supporti | |
| in cristallo di quarzo senza semi | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25,4 mm di diametro Z-cut 0,05 mm di spessore doppia lucidatura laterale 8 mm su -X |
| Shim | |||
Riferimenti
- Brändén, G., Neutze, R. Advances and challenges in time-resolved macromolecular crystallography. Science. 373, (2021).
- Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, (2021).
- Schaffer, J. E., Kuks....
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Ristampe e permessi
