寄生性線虫 Strongyloides stercoralis および Strongyloides ratti のための機能的ゲノムツールキットには、トランスジェネシス、CRISPR/Cas9媒介突然変異誘発、およびRNAiが含まれる。このプロトコルは、生殖腺内マイクロインジェクションを使用して、導入遺伝子およびCRISPR成分を S. stercoralis および S. rattiに導入する方法を実証する。
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この記事について
サマリー
要約
ストロンギロイデス属は、ストロンギロイデス・ステロイドおよびストロンギロイデス・ラティを含む、異なる宿主範囲を有する皮膚貫通線虫の複数種からなる。S. stercoralisは、約6億1000万人に感染するヒト寄生性の皮膚透過性線虫であり、ラット寄生虫S. rattiはS. stercoralisと密接に関連しており、S. stercoralisの実験室モデルとしてしばしば使用されている。 S. stercoralisとS. rattiの両方は、生殖腺内マイクロインジェクションの外因性核酸送達技術によるトランスジェニックおよびノックアウトの生成に容易に順応性であり、したがって、この技術にまだ順応していない他の寄生性蠕虫のモデルシステムとして浮上している。
寄生性 ストロンギロイデス 成虫は宿主の小腸に生息し、糞便を介して子孫を環境に放出する。環境に入ると、幼虫は糞便に住み、新しい宿主を見つけて侵入しなければならない子孫を産む自由生活の成虫に発達する。この環境生成は ストロンギロイデス 種に特有のものであり、モデルの自由生活線虫 Caenorhabditis elegansに形態が十分に類似しており、 C. elegans のために開発された技術は、性腺内マイクロインジェクションを含むこれらの寄生性線虫での使用に適合させることができる。生殖腺内マイクロインジェクションを用いて、多種多様な導入遺伝子を ストロンギロイデスに導入することができる。CRISPR/Cas9成分をマイクロインジェクションして、変異型 ストロンギロイデス 幼虫を作成することもできる。ここでは、自由生存成人の調製、注射手順、およびトランスジェニック子孫の選択を含む、 ストロンギロイデス への性腺内マイクロインジェクションの技術について説明する。CRISPR/Cas9突然変異誘発を用いて作製されたトランスジェニックスト ロンギロイデス 幼虫の画像が含まれる。この論文の目的は、他の研究者がマイクロインジェクションを使用してトランスジェニックおよび変異型の ストロンギロイデスを作成できるようにすることです。
概要
ストロンギロイデス・ステコラリスは、より広く認識されている鉤虫や回虫のアスカリス・ルンブリコイデス1と比較して、重要なヒト病原体として長い間見過ごされてきた。ワームの負担に関する以前の研究では、S.スターコラリス2の一般的な診断方法の感度が低いため、S.スターコラリスの有病率をしばしばひどく過小評価していました。近年、改良された診断ツールに基づく疫学的研究は、S.ステルコラリス感染症の真の有病率は、以前に報告されたよりもはるかに高く、世界中で約6億1000万人と推定されている2。
S. stercoralisと他のストロンギロイデス種(近縁のラット寄生虫および共通ラボモデルS. rattiを含む)は、寄生世代と自由生活(環境)世代の両方からなるため、実験的ゲノム研究に有利な異常なライフサイクルを持っています3(図1)。具体的には、S. stercoralisとS. rattiの両方が単一の自由生活世代を循環させることができます。自由生....
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プロトコル
注:スナネズミはS. ステルコラリスの継代に使用され、ラットは S.ラッティの継代に使用された。すべての手順は、AAALAC規格および実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠しているUCLA動物研究監督局(議定書番号2011-060-21A)によって承認されました。以下のタスクは、マイクロインジェクションの少なくとも1日前に完了しなければならない:ワームの培養、マイクロインジェクションパッドの調製、マイクロインジェクションミックス用の構築物の作成、および細菌(大腸菌 HB101)を6cm線虫増殖培地(NGM)プレート上に広げる8。自由生活の女性は、マイクロインジェクションを受ける前に若年成人に発達するために、25°Cで最低24時間の糞便収集を必要とします。マイクロインジェクションパッドは完全に乾燥している必要があります。バクテリアプレートは乾燥して小さな芝生を確立しなければなりません。
1.マイクロインジェクションスライドの調製:注射の少なくとも1日前
注:ワームは、注射用の乾燥寒天パッドを備えたマイクロインジェクションカバースリップに取り付けられています。
- ヒートブロックを90°Cに設定します。
- 5mLのddH2O、次いで100mgのアガロースをホウケイ酸ガ....
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結果
実験が成功した場合、F1幼虫は目的の導入遺伝子および/または変異表現型を発現する(図4)。しかし、形質転換率は非常に変動し、構築物、ワームの健康状態、注射後の培養条件、および実験者のスキルに依存する。一般に、実験が成功すると、注射された雌あたり>15F1幼虫が得られ、蛍光マーカーの形質転換率は>3%となる。生きている子孫の総数が平均して10匹未満の幼虫/雌である場合、構築物は有毒であり、形質転換された幼虫は生存していない可能性がある。蛍光幼虫ではなく蛍光卵を多数見つけることは、注入混合物が有毒である可能性があるという別の指標である。この手法を初めて学ぶときは、体壁筋13の堅牢な表現を駆動するact-2::mRFPmarsなど、よく表現するコンストラクトを使用することをお勧めします(図4)。
CRISPR/Cas9媒介標的突然変異誘発によって変異.......
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ディスカッション
このマイクロインジェクションプロトコルは、トランスジェネシスおよびCRISPR/Cas9媒介突然変異誘発のための構築物を S. stercoralis および S. ratti に導入するための方法を詳述する。S. stercoralis と S. rattiの両方について、注射後の生存率およびトランスジェネシスまたは突然変異誘発の速度は、微調整可能ないくつかの変数の影響を受けます。
トランスジェネシスを成功させるための最初の重要な考慮事項は、プラスミド導入遺伝子がどのように構築されるかです。以前の研究では、ストロンギロイデスにおける外因性導入遺伝子の発現には、ストロンギロイデス5'プロモーターおよび3'UTRエレメント3、13、19の使用が必要であることが分かっている。C. ele.......
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開示事項
著者らは利益相反がないと宣言しています。
謝辞
pPV540とpPV402は、ペンシルベニア大学のジェームズ・ロック博士からの親切な贈り物でした。原稿に関する有益なコメントをくれたAstra Bryantに感謝します。この研究は、バローズ・ウェルカム基金の研究者から、疾患の病因賞、ハワード・ヒューズ医学研究所教員奨学生賞、国立衛生研究所R01 DC017959(E.A.H.)から資金提供を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| (&マイナス;)-ニコチン、≥99% (GC)、液体 | Sigma-Aldrich | N3876-5ML | ニコチン 麻痺虫用 |
| 3" 鉄 C クランプ、3" x 2" (容量 x 深さ) | VWR | 470121-790 | C クランプ ベンチトップ |
| アガロース LE | Phenix | RBA-500 | アガロース スライド用 |
| 骨炭、4 ポンド バケツ、10 x 28 メッシュ | Ebonex | n/a | 糞便炭培養 |
| 用木炭骨炭、顆粒、10 x 28メッシュ | 、Reade | bonechar10x28 | 、木炭(上記に代わるもの)、 |
| 粗いマイクロマニピュレーター | 、成茂 | 、MMN-1 | 、粗いマイクロマニピュレーター |
| 、コーニング、Costar Spin-X、遠心分離管フィルター | 、フィッシャー | 、07-200-385 | 、マイクロフィルターカラム |
| 、カバーガラス、48 x 60 mm、厚さNo.1 | ブレインリサーチラボ | 、4860-1 | カバースリップ(48 x 60 mm) |
| 深いペトリ皿、6つの通気口、直径100 mmの | VWR | 82050-918 | 10 cmのペトリ皿(糞便炭文化用) |
| Eiscoレトルトベースw /ロッド | フィ | ッシャー12-000-101 | スタンドベアマン装置 |
| Eppendorf FemtoJetマイクロインジェクターマイクロローダーチップ | VWR | 89009-310マイクロインジェクション針充填用VWR89009-310 | |
| ッシャーブランド吸収性アンダーパッドフィ | ッシャー | 14-206-62 | ベンチペーパー(準備用) |
| フィッシャーブランド鋳鉄リング | フィ | ッシャー14-050CQ | ベアマンOリング |
| フィッシャーブランド三角ポリプロピレンビーカー | フィ | ッシャー14-955-111F | プラスチックビーカー(混合用) |
| フィッシャーブランド三角ポリプロピレンビーカー | フィ | ッシャー14-955-111F | プラスチックビーカー(キャッチバケツ・水バケツ用) |
| フィッシャーブランドの三角ポリプロピレンビーカー | フィ | ッシャー14-955-111F | プラスチックビーカー(x2)(ホルダーを作るため) |
| シリンジのゴリラエポキシ | McMaster-Carr | 7541A51 | 接着剤(チューブを取り付けるため) |
| ハロカーボンオイル700 | シグマ-アルドリッチ | H8898-50ML | ハロカーボンオイル |
| 食品および飲料用高温シリコーンゴムチューブ、1/2 "ID、5/8 "OD | マクマスターカー | 3038K24 | チューブ(漏斗用) |
| KIMAX漏斗、ロングステム、60°;角度、キンブルチェイス | VWR | 89001-414 | ベアマン漏斗 |
| キンバリークラークプロフェッショナル Kimtechサイエンスベンチトッププロテクター | フィ | ッシャー15-235-101 | ベンチペーパー(準備用) |
| 蛍光付きライカ実体顕微鏡 | ライカ | M165 FC | GFP実体顕微鏡 トランスジェニックワームの識別と選別用 |
| マイクロインジェクター 真鍮製ストレートアームニードルホルダー | トライテック | MINJ-4 | マイクロインジェクションニードル |
| ホルダーmicroINJECTORシステム | Tritech | ミンJ-1 | マイクロインジェクションシステム |
| モンゴルのスナネズ | チャールズリバー研究所 | スナネズ | オス4-6週間 |
| のNasco Whirl-Pakの簡単な閉じる袋、18オン | VWR | 11216-776 | Whirl-Pakサンプル袋 |
| ナイロンチュール(メッシュ) | Jo-Ann Fabrics | zprd_14061949a | Baermannホルダー用ナイロンメッシュ |
| プラチナワイヤー、36ゲージ、1インチあたり | トーマスサイエンティフィック | 1233S72 | プラチナ/イリジウムワイヤー、ワームピックピ |
| ューリタン舌圧子、152 mm (L) x 17.5 mm (W) | VWR | 62505-007 | ウッドスティック (サンプルの混合用) |
| QIAprep スピン ミニプレップキット (250) | QIAGEN | 27106 | QIAGEN ミニプレップキット |
| Rats-Long Evans | Envigo | 140 HsdBlu:LE S | . rattiのメンテナンスのためのLE Long Evansラット、女性 4-6週間 |
| Rats-Sprague Dawley | Envigo | 002 Hsd:Sprague Dawley SD | ラット S. rattiのメンテナンス用、女性 4-6週間 |
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| 用プラスチックボックスシェパードテックボード、8 x 16.5インチ | Newco | 999589 | techboard |
| ステンレス鋼、隆起ワイヤーフロア | 、アンケア | R20SSRWF | ワイヤーケージボトム、 |
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| テンダーディッシュのパック、スタッキングタイプ、37 x 25 mm | カロライナ(科学) | 741012 | 時計メガネ(小、丸) |
| 実体顕微鏡 | Motic | K-400 LED | 解剖準備スコープ |
| 収納トート、カラー クリア/ホワイト、外高 4-7/8 インチ、外の長さ 13-5/8 インチ、Sterilite | グレインジャー | 53GN16 | 加湿チャンバー用プラスチックボックス |
| サッター P-30 マイクロピペット プーラー | サッター | P-30/P | プラチナ/イリジウム フィラメント付きニードル プラー |
| シラキュース ウォッチ グラス | フィッシャー | S34826 | 時計メガネ(大・丸型) |
| Thermo Scientific Castaloy 固定角クランプ | Fisher | 05-769-2Q | ファンネルクランプ (2x) |
| 3 軸吊り下げジョイスティック オイルハイドロリックマイクロマニピュレーター | Narishige | MM0-4 | ファインマイクロマニピュレーター |
| United Mohr ピンチコッククランプ | Fisher | S99422 | ピンチクランプ (2x) |
| ベント付きシャープエッジシャーレ (直径 60 mm) | Tritech研究 | T3308P | 6センチメートルのペトリ皿(小規模の糞便炭培養用) |
| VWR軽量ティッシュワイ | パーVWR | 82003-820 | 裏地Baermannホルダー |
| 時計ガラス、正方形、カ | ロライナ州1-5 | 742300 | メガネ(小、正方形) |
| Whatman定性的グレードのプレーンサークル、グレード1、直径5.5 | ッシャー09-805B | 濾紙(6センチメートルのペトリ用)皿) | |
| Whatman定性的グレードのプレーンサークル、グレード1、直径9 cm | フィ | ッシャー09-805D | 濾紙(10 cmシャーレ用) |
| World Precision Instrumentホウケイ酸ガラス毛細管、1.2 mm x 4 in | Fisher | 50-821-813 | マイクロインジェクション針用ガラス毛細血管 |
| X-Actoナイフ、No.11ブレード付きNo.1ナイフ | デポ | 238816 | ワームピックを保持するためのブレードなしX-Actoナイフ |
| ツァイス AxioObserver A1 | ツァイス | 倒 | 立顕微鏡 |
参考文献
- Krolewiecki, A. J., et al. A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).
- Buonfrate, D., et al.
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