Summary
本稿では、初代患者特異的なヒト大動脈平滑筋細胞および皮膚線維芽細胞を単離および培養するための外植培養ベースの方法について説明する。さらに、細胞収縮の測定およびその後の分析のための新規な方法が提示され、これはこれらの細胞における患者特異的な差異を研究するために使用することができる。
Abstract
平滑筋細胞(SMC)は、大動脈媒体における優勢な細胞型である。それらの収縮機構は、大動脈における力の伝達に重要であり、血管収縮および血管拡張を調節する。SMC収縮装置タンパク質をコードする遺伝子の変異は、胸部大動脈瘤などの大動脈疾患と関連している。SMC収縮を インビトロ で測定することは、特にハイスループット方式で困難であり、これは患者材料をスクリーニングするために不可欠である。現在利用可能な方法は、この目的には適していません。本稿では、電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)に基づく新しい方法を提示する。まず、大動脈瘤の研究のために、大動脈生検および患者特異的ヒト原発性皮膚線維芽細胞から患者特異的ヒト原発性SMCを単離するための外植プロトコルが記載されている。次に、これらの細胞の収縮応答を測定するための新しい収縮方法の詳細な説明が与えられ、その後の分析および異なるグループを比較するための提案を含む。この方法は、翻訳(心臓血管)研究および患者および薬物スクリーニング研究の文脈における接着細胞の収縮を研究するために使用することができる。
Introduction
平滑筋細胞(SMC)は、大動脈内側層、大動脈の最も厚い層における優勢な細胞型である。壁内では、それらは放射状に配向しており、他の機能の中でも特に、血管収縮および血管拡張に関与する1。このSMC収縮機構は、細胞外マトリックス2との機能的リンクを介して大動脈における力の伝達に関与している。平滑筋ミオシン重鎖(MYH11)および平滑筋アクチン(ACTA2)などのSMC収縮装置のタンパク質をコードする遺伝子の変異は、家族性胸部大動脈瘤の症例に関連しており、大動脈の構造的および機能的完全性の維持におけるSMC収縮の関連性を強調している1,2.さらに、TGFβシグナル伝達経路の変異は大動脈瘤とも関連しており、大動脈瘤の病態生理におけるそれらの効果も皮膚線維芽細胞3において研究することができる。
インビトロでのSMC収縮のハイスループット測定は困難です。SMCの収縮性はヒトのインビボでは測定できないため、ヒト細胞に対するインビトロアッセイは実現可能な代替手段を提示します。さらに、動物モデルにおける腹部大動脈瘤(AAA)の発生は、例えばエラスターゼ灌流によって化学的に誘導されるか、または特定の変異によって引き起こされる。したがって、動物データは、喫煙、年齢、および/またはアテローム性動脈硬化症などの多因子的原因を主に有するヒトにおけるAAA発症とは比較にならない。インビトロSMC収縮性は、これまで主に牽引力顕微鏡4、5、Fura−2蛍光細胞内カルシウムフラックス6の定量、およびコラーゲンしわアッセイ7によって測定されてきた。牽引力顕微鏡は、単一細胞によって生成される力に関する非常に貴重な数値的洞察を提供しますが、複雑な数学的データ処理と一度に1つの細胞の分析のためにハイスループットスクリーニングには適していません。Fura-2色素およびコラーゲンしわアッセイは、収縮の表面的な決定を可能にし、正確な数値出力を与えないため、患者固有の差異を区別するのにはり適していません。腹部大動脈瘤患者の大動脈由来の細胞におけるSMC収縮障害は、インビトロでSMC収縮を測定するための新規な方法を最適化することによって初めて実証された8。これは、電気セル基板インピーダンスセンシング(ECIS)法を再利用することによって行われました。ECISは、創傷治癒および遊走アッセイ12、13、14におけるSMC増殖および挙動などの付着性細胞挙動および収縮9、10、11の定量化のためのリアルタイム、中程度スループットアッセイである。正確な方法については、プロトコルのセクションで説明します。この最適化された方法で、ECISは、それらの類似したサイズおよび形態による線維芽細胞収縮を研究するためにも使用することができる。
この論文の目的は、ECIS8を使用してインビトロでSMC収縮を測定し、対照SMCと患者SMCとの間の収縮を比較する方法の段階的な説明を提供することである。まず、コントロールおよび患者の大動脈生検からの初代SMCの単離および培養について説明し、これは収縮測定に使用することができる。第2に、収縮の測定および分析について、SMCマーカー発現の検証とともに、説明する。さらに、本稿では、患者特異的皮膚線維芽細胞の単離方法についても、同様の手法を用いて収縮を測定することができる。これらの細胞は、大動脈瘤または他の心血管病理に焦点を当てた患者特異的研究15、または動脈瘤手術前の収縮測定を可能にする分化転換プロトコールを用いた予後研究16に使用することができる。
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Protocol
注:大動脈生検は、アムステルダム大学医療センター、VU大学医療センター、アムステルダム、ザーンメディッシュセントラム、ザーンダムおよびダイクランダー病院、ホールン、オランダで開腹動脈瘤修復中に得られた。コントロール大動脈組織は、腎臓移植のために採取した腎動脈に付着した大動脈の小片から得た。18歳以上の患者のみが含まれ、すべての患者が研究に参加するインフォームドコンセントを与えた。すべての資料は、ヘルシンキのWMA宣言の規制およびVU医療センターの医療倫理委員会の機関ガイドラインに従って収集されました。すべての実験および実験プロトコールは、施設のガイドラインに従って実施され、VU医療センターの医療倫理委員会によって承認された。使用される対照および患者細胞株に関する完全な情報については、 8を参照されたい。
1. 大動脈生検から原発性ヒトSMCを単離する
メモ: 滅菌組織培養層流フードの下で次の手順を実行します。手袋を着用し、ヒトの血液およびヒト組織サンプルを取り扱う際には、標準的な無菌技術を使用してください。SMCは、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、および SMC培地と呼ばれる平滑筋成長サプリメントを添加した231ヒト血管平滑筋細胞基礎培地で培養される。
- 2組の手術用鉗子とメスを70%エタノールに浸し、その後乾かして滅菌します。
- 組織解剖が行われるペトリ皿中のSMC培地のピペット2mL。
- 2.5 mLのSMC培地を2つのT25フラスコにピペットで入れる。少量の媒体が表面全体を覆うようにフラスコを旋回させる。
- 採取したヒト大動脈壁生検を、冷たく滅菌された滅菌組織転写溶液( 材料表を参照)または0.9%NaClと共に滅菌プラスチックチューブに入れた氷上の実験室に手術室から実験室に輸送する。
- 組織培養フードの内側の組織と一緒にチューブを開きます。滅菌した鉗子を使用して生検をチューブから取り出し、ペトリ皿に入れます(図1A)。
- 生検を目視検査して、3つの大動脈層、中膜内膜(内側)、中膜(中央)、および外膜(外層)を特定する。層を区別するために、内膜側のアテローム性動脈硬化プラークおよび外腹側のぬるぬるした結合組織(図1B)の存在を探します。
- SMCをメディアから分離するには、他の2つのレイヤーを削除します。最初に内膜プラーク側を上にした組織を置く(図1B)。鉗子で組織から引き離し、他の一対の鉗子で組織を押し下げて固形プラークを除去します。ピンク色の均一な内側層が見えるまで、プラークの後続の層を除去する。
- 組織を反転させます(図1C)。ステップ1.7と同じ手順を繰り返して、外来層を引き出します(図1D)。このレイヤーはメディアから簡単には取り外せないため、必要な回数だけ表示されている部分をすべて削除してください。
注:SMC集団をできるだけきれいにするためには、内膜層と外膜層を適切に除去することが不可欠です。 - 内側層が単離されたら、組織を約1mm x 1mm x 1mmの立方体に切断する。鉗子で培地を押し下げ、メスを使用して組織を一方向に切断する。前後にカットしないでください;損傷を最小限に抑えるために、クリーンで一方向の切断を行います。生検のサイズを考慮して、できるだけ多くの立方体を作成してみてください(図1E)。
- 鉗子を用いてT25フラスコの上四分の一に組織片を置く。材料の量が許せば、フラスコあたり10〜20個の立方体を置きます(図1F)。
注:滑らかな鉗子を使用して、鉗子の肋骨への組織の付着を最小限に抑え、組織をフラスコに簡単に剥離します。 - T25フラスコ内の組織立方体を、インキュベーター中で37°Cで5%CO2 で約10日間インキュベートする。
注:最初の細胞増殖は、その頃に予想される。最初に移動するセルは、通常の SMC よりも小さく見える場合があります。 - 細胞増殖が観察されたら、フラスコに2.5mLの培地を加え、組織片が剥離しないように組織片にピペットで留めないようにします。
- さらに約5日後、組織片の周囲に細胞のクラスターが観察されたら、培養液を交換する。ティッシュピースが剥がれた場合は、再付着しないので取り外してください。
- 細胞が80〜90%コンフルエントになったら、それらをT75フラスコに移し、このフォーマットで培養を続ける。
メモ: 1:2 または 1:3 の分割比率を推奨します。細胞のバックアップを早期継代で凍結する。細胞は一般に、継代10までその特性を維持する。後のパッセージは実験に使用しないでください。
2. 皮膚生検からの原発性皮膚線維芽細胞の単離
メモ: 滅菌組織培養層流フードの下で次の手順を実行します。手袋を着用し、ヒトの血液およびヒト組織サンプルを取り扱う際には、標準的な無菌技術を使用してください。線維芽細胞は、10%ウシ胎児血清、100U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシンを添加した基礎培地( 線維芽細胞培地と呼ばれる)で培養される。
- 2対の外科用鉗子とメスを70%エタノールに浸し、その後乾かして滅菌する。
- 組織解剖が行われるペトリ皿中の線維芽細胞培地のピペット2mL。
- 2.5 mLの線維芽細胞培地を2つのT25フラスコにピペットする。少量の媒体が表面全体を覆うようにフラスコを旋回させる。
- 採取した皮膚生検を手術室から実験室に輸送し、冷たい滅菌組織移送溶液( 材料表を参照)または滅菌プラスチックチューブ中の0.9%NaClで氷上で輸送する。
- 組織培養フードの内側の組織と一緒にチューブを開きます。滅菌した鉗子を使用して生検をチューブから取り出し、ペトリ皿に入れます(図2A)。
- 生検を目視で検査し、表皮、真皮、皮下脂肪の3つの皮膚層を特定します。表皮を識別するために、時には目に見える髪の毛を持つ認識可能な皮膚表面を探します。反対側では、しばしば黄色くてぬるぬるしている皮下脂肪を探してください。表皮と皮下脂肪の間の層を真皮 - 生存可能な線維芽細胞の供給源として特定する(図2B)。
- 真皮から線維芽細胞を単離するには、他の2つの層を除去し、3つの層すべてが見えるように組織をその側に置きます。
注:大動脈組織とは異なり、皮膚層は互いに引き離すことはできません。したがって、それらはカットされなければなりません。組織はまた、よりゴム状であり、切断をより困難にする。鋭いメスを使用してください。 - 鉗子で組織を押さえます。表皮と真皮の境界に平行に切断する。表皮全体を切り取ります。1本のきれいなラインで切断し、組織の損傷を避けるために前後に動かないでください。
- ティッシュをひっくり返します。手順 2.8 と同じ手順を繰り返します。今回は、皮下脂肪との境界に平行な真皮内で切断する。
- 真皮が単離されたら、組織を約1 x 1 x 1 mm 3の立方体に切断する。鉗子で組織を押し下げ、メスを使って組織を一方向に切断します。前後にカットしないでください;損傷を最小限に抑えるために、クリーンで一方向の切断を行います。生検のサイズを考慮して、できるだけ多くの立方体を作るようにしてください(図2C)。
- 鉗子を用いてT25フラスコの上四分の一に組織片を置く。材料の量が許せば、フラスコあたり10〜20個の立方体を置きます(図2D)。
注:滑らかな鉗子を使用して、鉗子の肋骨への組織の付着を最小限に抑え、組織をフラスコに簡単に剥離します。 - T25フラスコ内の組織立方体を、インキュベーター中で37°Cで5%CO2 で約10日間インキュベートする。
注:最初の細胞増殖は、その頃に予想されます。最初に遊走する細胞は、正常な線維芽細胞よりも小さく見えるかもしれない。 - 細胞増殖が観察されたら、フラスコに2.5mLの培地を加え、組織片が剥離しないように組織片にピペットで留めないようにします。
- さらに約5日後、組織片の周囲に細胞のクラスターが観察できたら、培養液を交換する。ティッシュピースが剥がれた場合は、再付着しないので取り外してください。
- 細胞が80〜90%コンフルエントになったら、それらをT75フラスコに移し、このフォーマットで培養を続ける。
メモ: 1:2 または 1:3 の分割比率を推奨します。細胞のバックアップを早期継代で凍結する。細胞は一般に、継代10までその特性を維持する。後のパッセージは実験に使用しないでください。
3. 収縮の測定(SMCの例)
- 96w10e ECISアレイを準備します(拡大電極と電極上に播種されたセルを備えたアレイの代表的な画像については 、図3A を参照してください)。
メモ: 滅菌組織培養層流フードの下で次の手順を実行します。- 滅菌96w10eアレイを1ウェルあたり200 μLの10 mM L-システインで室温で30分間コーティングします。
- プレートを滅菌水で2回洗う。蓋をわずかに開いた状態で組織培養フードでプレートを一晩乾燥させます。
注:プレートをL-システインでコーティングすることは、プレートを初めて使用する場合にのみ必要です。 - 翌日、プレートと蓋を30分間UV滅菌した。蓋を上向きに回して、内部が滅菌されるようにします。プレートを滅菌したら、フローフードの外側にプレートを開けないでください。
- ECIS アレイ上のセルのシード
- 1%滅菌ゼラチン溶液をウォーターバス中で30分間予温する。
注:溶液は冷蔵庫に保存され、固化してピペットが難しくなることがあります。 - 続いて、ウェルあたり100μLの1%ゼラチン溶液でウェルをコーティングし、プレートを37°Cで少なくとも1時間インキュベートする。
- 井戸からゼラチンを吸引する。
- 自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、200 μLのSMC培地に30,000細胞/ウェルの播種密度でSMCを3連で播種します。
- SMCの入ったプレートを細胞培養インキュベーター内のECIS 96ウェルホルダーに入れます。 ECIS 応用生物物理学ソフトウェア をダブルクリックしてプログラムを開き、[ セットアップ] ボタンを押します。
- すべての電極が、左下のパネルの「 ウェル構成」というラベルの付いたホルダー(緑色、接続されていない場合は赤色)に接触しているかどうかを確認します。電極が正しく接続されていない場合は、測定を開始する前にホルダー内のプレートを調整してください。
- 同じパネルでプレートタイプ(96ウェルアレイ)を選択するには、「 アレイタイプ」をクリックします。
- 右上のパネル の[データ収集のセットアップ]で、 単一周波数 をクリックし、インピーダンス値を 4000 Hz に、間隔を 8 sに変更します。
- 「スタート」ボタンをクリックして測定を開始します。ECIS ファイルを保存できる新しいパネルが開くのを待ちます。
- 細胞が単層を付着させ、48時間確立するのを許す。
メモ:電極上のセルの取り付けと拡散によって、ベースライン抵抗値が生成されます(図3B)。
- 1%滅菌ゼラチン溶液をウォーターバス中で30分間予温する。
- 収縮を誘導する細胞の刺激
- 10μg/mLのカルシウムイオノフォア、イオノマイシンで細胞を刺激することにより、SMC収縮を誘導する。
注:イオノマイシンは、細胞外Ca2 +の流入を誘導します, 収縮カスケードを活性化します;非刺激および刺激収縮細胞の代表的な画像については 図4A を参照されたい。 - 100 μLのジメチルスルホキシドで1 mgのイオノマイシン粉末を希釈して10 mg/mLの原液を作り、10 μLのアリコートを-20°Cで保存する。 使用前に、イオノマイシン溶液をSMC培地で1:10に希釈し、細胞に添加する作用溶液を調製した。
- アレイが細胞培養インキュベーター内のアレイホルダーにまだあり、電極がシステムに取り付けられている間に、細胞刺激を行います。
- 細胞を刺激するには、蓋を外してインキュベーター内の滅菌面に置きます。2 μL および 150 μL に設定した 2 つのピペットを準備します。
- 刺激を開始する前に、ソフトウェアで マーク を押してコメントを入れてください。
注:これにより、データを分析する際に刺激の正確なタイミングを見つけやすくなります。 - イオノマイシン作業溶液2 μLをできるだけ早く各ウェルにピペットで注入する。すべての細胞が刺激されたら、2番目のピペットを使用してウェル内の培地を混合します。
注:急速な効果のために、異なる細胞株および状態間で先端を交換する必要はない。イオノマイシンは急性効果があるため、刺激や混合をしながら素早く働きます。フルプレートを刺激する場合は、一度に最大3列まで刺激します。すべての刺激の後、次の刺激まで少なくとも30分間待って、細胞がインキュベーターのドアの開放によって引き起こされる温度およびCO2 変化から回復するようにする。 - 刺激が完了した直後に、もう一度 マーク を押して、刺激が完了したというコメントを追加します。
- 刺激実験を終える
- イオノマイシン刺激後約5分間インピーダンス値を記録します。[完了] を押して記録 を終了します。
- ECISアレイを最大3回再利用する:ウェルを滅菌水で2回洗浄し、プレートを37°Cでトリプシンまたは同様の試薬で2〜3時間インキュベートする。手順 3.1.2 と 3.1.3 を繰り返します。
- 10μg/mLのカルシウムイオノフォア、イオノマイシンで細胞を刺激することにより、SMC収縮を誘導する。
- データのエクスポート
- データをエクスポートするには、[ ファイル] |データ|のエクスポートエクセル (選択済み) へ。ファイルを保存するフォルダを選択します。
- プログラムがシートを結合または 分離 するように要求されたら、[分離] をクリックします。
- 収縮性アウトプットの分析
- 収縮応答を計算するには、以下の式(1)を使用し、ここでCは収縮(ベースラインと比較した変化%で表わされる)、刺激前(PrS)はイオノマイシン刺激直前の抵抗値(Ωで表される)を示し、刺激後(PoS)は刺激終了から2分後の抵抗値(Ωで表される)を示す。
(1)
注:式(1)に示すように、細胞が付着していない培養液で満たされたウェルのインピーダンス値(290 Ωの値)は、最終計算のすべての結果から差し引かれます。各実験で収縮応答を3連で測定し、同じ細胞株で3つの独立した実験を実行して、実験間および実験内の変動を考慮することをお勧めします。 - 3つの独立した実験が実行されたら、標準偏差(SD)を含む3つの測定値の平均を計算して、データをグループ化します。
- 収縮応答を計算するには、以下の式(1)を使用し、ここでCは収縮(ベースラインと比較した変化%で表わされる)、刺激前(PrS)はイオノマイシン刺激直前の抵抗値(Ωで表される)を示し、刺激後(PoS)は刺激終了から2分後の抵抗値(Ωで表される)を示す。
- 異なるグループの比較
- 正常な収縮の範囲を定義し、その後の特定の研究課題を調査するには、対照群を使用して「正常な収縮」を定義し、それを患者または治療群の収縮応答と比較する。
- ステップ3.5.2で説明されるように、対照群全体の平均およびSDを計算する、すなわち、すべての細胞株についての終了値を計算する。
- 平均±2SDの範囲を使用して、この範囲外にある他のグループの細胞を特定し、収縮応答が変化していることを示します。
注:変化した収縮性応答の背後にあるメカニズムは、特定の研究上の質問の対象であり、細胞および状態に依存しており、このプロトコルでは議論しない。
(1)4. SMC特異的マーカーの存在を検出する
- RNA 単離
- 収縮測定に用いたのと同じ患者特異的細胞株を6ウェルプレートに播種し、細胞株1株につき1ウェルずつ。自動セルカウンターを使用して細胞をカウントし、SMC培地に200,000細胞/ウェルの播種密度で細胞を播種し、一晩付着させます。
- 滅菌PBSで細胞を1回洗浄する。
- 細胞を溶解し、製造元の指示に従って細胞を単離する。
- cDNA合成
- 20 μLの逆転写反応混合物中でcDNA合成を行う。単離されたRNA全体の濃度を、製造業者から提供された指示に従って希釈する。
- ティッカー
- SMCマーカー遺伝子( ACTA2、CNN1、SMTN 、 TAGLN など)の遺伝子発現を測定して、単離された細胞が実際にSMCであることを確認し、SMCマーカーを検出します。結果と収縮性出力の相関関係を確認します。
- 少なくとも2つのハウスキーピング遺伝子を使用してデータを正規化します(例: YWHAZ および TBP)。
注: qPCR の実行と分析は、ラボで利用可能で最適化されているものに応じて、異なる PCR マシンと互換性のあるソフトウェアを使用して実行できます。プライマー配列については 補足表S1 を参照されたい。
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Representative Results
この方法の再現性をテストするために、この方法は最初に制御SMCのみを使用して検証されました。実験間測定再現性を決定するために、全ての含まれた対照細胞株および患者細胞株の2つの独立した測定値をBland-Altmanプロットとしてプロットした(図3B)。プロットは、この方法が1つの外れ値細胞株を除いて、信頼区間外の変動性を示さないことを実証した。さらに、これらの結果は、同じ実験内で播種し、同時に刺激された2つのウェルが実質的に同じ収縮応答曲線を示すことを実証した(図4C)。示された応答が収縮であり、イオノマイシン刺激による浸透圧ストレスではないかどうかを検証するために、刺激後に培地を交換し、細胞の挙動を記録した。これは、刺激された細胞が再び電極上に広がり始めたことを示している(図4D)。
この新規方法の最初の適用として、健康な非拡張大動脈(n = 6)および腹部大動脈瘤(AAA)患者(n = 21; 図5A))を測定し、先に8に示す。対照群の応答中央値は61%(46~77%)であったのに対し、患者群の奏効中央値は52%(15~75%)であった。値は有意差はなく、患者群においてより高い変動性が認められた。この方法の新規性のために、対照群は「正常な」収縮を決定するために使用された。 図5B は、対照群の平均および±2SD範囲と、この範囲を使用して「正常」値よりも低い収縮値を有する4人の患者を特定する方法を示す。収縮障害の原因を特定することは、別の機械論的研究の目的である。実験に使用したSMCがSMC収縮マーカーを発現しているかどうかを判断するために、西側のボット分析が行われました。ウェスタンブロット分析(図6A)とそれに続く定量(図6B)により、細胞がSMCマーカーを発現していることを確認しました。グループ全体のマーカー発現は可変であり、収縮性出力と相関しなかった。SMCの増殖能を決定するために、Ki67に対するqPCRが行われた(図6C)。Ki67発現は全ての細胞で検出可能であったが、収縮性アウトプットと相関しなかった。
図1:大動脈AAA組織からのSMC単離。 (A)大動脈組織からのSMC単離に必要な材料:ペトリ皿中の大動脈組織、SMC培地、SMC培地で満たされた2つのT25フラスコ、メス、および2対の外科用鉗子。(b)アテローム性動脈硬化性プラークを示す大動脈壁の内膜側。(c)大動脈壁の外側層。(D)鉗子で引っ張ることによる中膜中膜と中膜外膜の分離。(E)中膜培地を単離した後、鉗子とメスを用いて組織を小片に切断する。(f)T25フラスコに入れた組織片。略語: AAA = 腹部大動脈瘤 ;SMC = 平滑筋細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
(A)真皮組織からの線維芽細胞単離に必要な材料:シャーレ内の真皮組織、線維芽細胞培地、線維芽細胞培地、メス、および2対の外科用鉗子で満たされた2つのT25フラスコ。(b)上側に皮下脂肪を示す皮膚生検。(C)真皮を単離した後、鉗子とメスを使って組織を小片に切断する。(d)T25フラスコに入れた組織片。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ECISプレートのセットアップと大動脈SMC収縮のグラフィック表現。96ウェルECISプレート。中央;ECISプレートの1ウェルの倍率、ウェルの底部にある10個の電極を示す。そうですね。ECISプレート上に播種されたSMCの光学顕微鏡画像;(B)対照SMCsの播種後にECISによって測定された抵抗曲線を3連で示す。太い青い線は3連の平均を表し、点線は3連のSDを表します。播種後最初の4〜5時間で、SMCは全面に広がり、高抵抗(〜1000 Ω)が測定される。安定したSMC単分子膜が形成されると、抵抗は時間の経過とともに約500 Ωに減少します。この図は8から修正されています。略語: ECIS = 電気セル基板インピーダンスセンシング;SMC = 平滑筋細胞;SD = 標準偏差。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ECISを用いたSMC収縮の測定 (A)左;SMC単層の制御SMCsは、収縮のための刺激の前に。そうですね。収縮のための刺激後のSMCを制御する。倍率10倍(B)2つの別々の収縮測定間の実験間測定再現性を示す差分プロット。点線は95%信頼区間を表し、太い内側線は2回の実験間測定値の平均を表す。各データポイントは、対照および患者のデータセット全体の2つの独立した測定値の平均からの偏差を表す(紫色●;n=27)。(C)ECIS収縮測定の実験内再現性。2つのウェルに播種した対照SMCによって生成された抵抗曲線。縦の点線は刺激を示す。(d)収縮の刺激後の細胞回復。太い青い線は、無刺激制御SMCの抵抗値を表す。青色の点線は、同じコントロールSMC線の抵抗値を表し、刺激後は黒色の縦線で記されている。刺激から約1時間後(太い縦の点線の黒い線)で、両方の条件で培地をリフレッシュして刺激を除去し、細胞の回収をさらに3.5時間追跡した。抵抗値は、刺激前の値に正規化し、刺激後の細胞の挙動をモニターした。この図は8から修正 されています。略語: ECIS = 電気セル基板インピーダンスセンシング;SMC = 平滑筋細胞。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:イオノマイシン刺激時のコントロールおよびAAA患者のSMCにおけるSMC収縮。 (a)複数の実験から得られたイオノマイシン刺激に対する対照(青●;n=6)およびAAA患者(赤●;n=21)SMCsの平均収縮応答。(B)複数の実験から得られた対照(青●;n=6)、正常収縮(赤●;n=15)、および低収縮(赤●;n=6)AAA患者のSMCの平均収縮応答。収縮は、刺激前のベースライン値と比較して減少の割合で表される。黒い水平線は、対照SMCの平均収縮応答を表し、点線の水平線は、対照群の平均の上下2つのSDを示す。低収縮群は、対照群の平均より下の2つのSDよりも低い収縮として定義される。箱ひげ図は、範囲を持つ中央値として表示されます。この図は8から修正 されています。略語:AAA =腹部大動脈瘤;ECIS = 電気セル基板インピーダンス検出;SMC = 平滑筋細胞;SD = 標準偏差。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:SMCマーカーの発現 SMC収縮性および増殖性マーカーを、対照のSMCにおいて分析し(Δ;n=6)、正常収縮、(●;n=15)、および低収縮(○;n=6)した。(a)収縮実験に用いたSMCのウェスタンブロット解析。aSMA、カルポニン、およびSM22を定量し、チューブリンを負荷制御として使用した。(B)(A)に描かれたウェスタンブロットの定量化。(c)Ki67増殖マーカーのqPCR分析。この図は8から修正 されています。略語: SMC = 平滑筋細胞;aSMA = アルファ平滑筋アクチン;qPCR = 定量 PCR. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足表S1:プライマー配列。 解析したハウスキーピングおよびSMCマーカー遺伝子の順方向および逆方向qPCRプライマー配列。このテーブルは 8 から変更 されています。略語: SMC = 平滑筋細胞;qPCR = 定量 PCR. この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本稿では、インピーダンスと表面占有の変化に基づいて、 SMC収縮をin vitroで測定する方法を提示する。まず、患者固有の初代ヒトSMCおよび皮膚線維芽細胞の単離、培養、および拡大について説明し、続いて収縮測定にそれらを使用する方法を説明する。
この研究の限界は、外植プロトコルを介して細胞を得ることに関連している。生検から増殖する細胞は、 生体内の元の組織とは異なる特性を有する可能性がある。さらに、ここで提示された外植プロトコルは革新的ではありませんが、この場合、患者固有の大動脈瘤材料から収縮測定までの完全なワークフローを提示するために含まれています。 インビトロで 細胞を培養することは、全身因子の欠如および異なる基質剛性のためにそれらの特性のいくつかにも影響し得る。これは、SMCマーカー発現の変動性を説明する可能性がある。信頼できる線維芽細胞マーカーがないため、線維芽細胞は通常、他の細胞と比較してマーカーの不在に基づいて区別される。したがって、我々は、このプロトコールで単離された線維芽細胞を特徴付けていない。もう1つの制限は、表面の要因としての収縮の測定がやや間接的なままであることです。考えられる結果は、出力が何千もの細胞を含むウェル全体の応答を平均化することから来るということです。したがって、すべての細胞の収縮が少ないのか、平均を下げる細胞があるのかを判断することはできません。
SMCの収縮性は、以前はさまざまな手法を使用して研究されていました。牽引力顕微鏡4と比較して、ECISには複数の利点、主により高いスループットと時間効率があります。制限で述べたように、トレードオフは収縮測定値が間接的に得られることであり、ECISはより多くの細胞株および群をスクリーニングし、より詳細な単一細胞機構学的研究のための牽引力を測定するのにより適している。カルシウム勾配6は 、以前は収縮の指標として使用されていました。ECISは、細胞の移動を測定するため、より信頼性の高い収縮測定を提供します。ゲル5の内部に播種された細胞の収縮によって引き起こされるコラーゲンしわの画像の定量化は、ECIS と同様に、播種された細胞の全集団の平均を提供する。しかし、ECISを通じて得られた測定値ははるかに正確であり、観察の全過程にわたってリアルタイムのモニタリングを提供し、それらを著しく有益にします。
結論として、この論文は、SMCおよび線維芽細胞などの接着細胞の収縮を測定するために使用できるECISシステムの新規な用途を説明する。この方法は、複数の細胞株をタイムリーかつ効率的に研究するために使用でき、患者または薬物スクリーニングに適しています。大動脈瘤に関する研究に沿って、この方法は、解剖およびアテローム性動脈硬化症などの他の心血管障害を有する患者のSMCをスクリーニングするためにも使用することができる。
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Disclosures
著者は宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
Tara van Merrienboer、Albert van Wijk、Jolanda van der Velden、Jan D. Blankensteijn、Lan Tran、Peter L. Hordijk、PAREL-AAAチーム、およびアムステルダムUMC、Zaans Medisch Centrum、Dijklander病院のすべての血管外科医に、この研究のための材料と支援を提供してくれたことに感謝の意を表したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-well Array | Applied Biophysics | 96W10idf PET | Array used to measure contraction in the ECIS setup |
| Custodiol | Dr. Franz Höhler Chemie GmbH | RVG 12801 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | Solution used to dilute ionomycin |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 26140079 | Addition to cell culture medium |
| Ham's F-10 Nutrient Mix | Gibco | 11550043 | Medium used to culture skin fibroblasts |
| Human Vascular Smooth Muscle Cell Basal Medium (formerly ''Medium 231'') | Gibco | M231500 | Medium used to culture smooth muscle cells |
| Invitrogen countess II | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | Automated cell counter |
| Ionomycin calcium salt from Streptomyces conglobatus | Sigma-Aldrich | I0634-1MG | Compound used for contraction stimulation |
| NaCl 0.9% | Fresenius Kabi | B230561 | Solution used to transfer tissue in from surgery room to laboratorium |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotics used for cell culture medium |
| Phospathe buffered saline | Gibco | 10010023 | Used to wash cells |
| Quick-RNA Miniprep Kit | Zymo Research | R1055 | Kit used for RNA isolation |
| Smooth Muscle Growth Supplement (SMGS) | Gibco | S00725 | Supplement which is added to smooth muscle cell culture medium |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | Kit used for cDNA synthesis |
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4309155 | Reagent for qPCR |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | Used to trypsinize cells |
| ZTheta | Applied Biophysics | ZTheta | ECIS instrument used for contraction measurements |
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