Membros recombinantes são um poderoso modelo experimental que permite estudar o processo de diferenciação celular e a geração de padrões sob a influência de sinais embrionários. Este protocolo apresenta um método detalhado para a geração de membros recombinantes com células mesodérmicas de membros de frango, adaptáveis a outros tipos celulares obtidos de diferentes organismos.
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Artigo de método
Ensaio de membros recombinantes de frango para entender morfogênese, padronização e primeiros passos na diferenciação celular
Neste artigo
Resumo
Resumo
A diferenciação celular é o processo afinado de comprometimento celular que leva à formação de diferentes tipos de células especializadas durante o estabelecimento de tecidos e órgãos em desenvolvimento. Esse processo é mantido ativamente na idade adulta. A diferenciação celular é um processo contínuo durante o desenvolvimento e homeostase dos órgãos. Entender os primeiros passos da diferenciação celular é essencial para conhecer outros processos complexos, como a morfogênese. Assim, os membros de frango recombinantes são um modelo experimental que permite o estudo da diferenciação celular e geração de padrões sob sinais de padronização embrionária. Este modelo experimental imita um ambiente in vivo ; ele monta células reaggregadas em uma cobertura ectodérmica obtida a partir de um broto de membro inicial. Posteriormente, os ectodermes são transferidos e implantados em um receptor de embrião de filhotes para permitir seu desenvolvimento. Este ensaio foi usado principalmente para avaliar células mesodérmicas de botões de membros; no entanto, pode ser aplicado a outras células-tronco ou progenitoras de outros organismos.
Introdução
O membro vertebrado é um modelo formidável para estudar diferenciação celular, proliferação celular, morte celular, formação de padrões e morfogênese 1,2. Durante o desenvolvimento, os membros emergem como protuberâncias das células derivadas do mesoderme de placa lateral1. Os botões de membros consistem em um núcleo central de células mesodérmicas cobertas por um ectoderme. A partir desta estrutura inicial, um membro inteiro e bem formado emerge. Após a êxito do membro, três eixos são reconhecidos: (1) o eixo proximo-distal ([PD] ombro a dedos), (2) o eixo dorso-ventral ([DV] da parte ....
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Protocolo
Esta pesquisa foi revisada e aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional para o Cuidado e Uso de Animais laboratoriais do Instituto de Investigaciones Biomédicas da Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM, Cidade do México, México). Um fluxograma esquemático das etapas gerais deste protocolo é mostrado na Figura 1A.
1. Incubação de embriões e determinação da viabilidade
- Incubar ovos de galinha fertilizados a 38 °C e 60% de umidade relativa por cerca de três dias e meio até atingirem a etapa de 22 HH (de acordo com Hamilton e Hamburger, 1951)16.
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Resultados
Reconhecendo um membro recombinante bem executado
Após o enxerto, os embriões manipulados foram devolvidos à incubadora para permitir que a RL se desenvolvesse. O tempo de incubação correlaciona-se com os requisitos do experimento. No entanto, a RL pode ser facilmente distinguida após 12 horas de implantação. Para determinar se a implantação era adequada, a RL foi observada como uma protuberância que estava firmemente presa à parede mesodérmica do embrião doador (Figura 2A
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Discussão
Em geral, o protocolo RL pode ser dividido em cinco etapas: (1) incubação de embriões, (2) obtenção de células mesodérmicas de membros para preencher os ectodermes, (3) obtenção dos ectodermes, (4) a montagem de células mesodérmicas dentro das capas ectodérmicas e (5) transplantes dos ectoderms preenchidos nos embriões hospedeiros. A maior limitação da técnica RL é o protocolo longo e detalhado, que tem muitos pontos críticos que requerem paciência para executar adequadamente. Para completar com sucesso o protocolo, mome.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Agradecemos a Estefania Garay-Pacheco pelas imagens da Figura 2 e de Maria Valeria Chimal-Montes de Oca pela obra de arte. Este trabalho foi apoiado pela Dirección General de Asuntos del Personal Académico (DGAPA)-Universidad Nacional Autónoma de México [números de subvenção IN211117 e IN213314] e Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) [concessão número 1887 CONACyT-Fronteras de la Ciencia] concedida ao JC-M. JC M-L foi o beneficiário de uma bolsa de pós-doutorado do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-Fronteras de la Ciencia-1887).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Alcian Blue 8GX | Sigma | A5268 | |
| Faca de fenda angular | Alcon | 2,75 mm DB | |
| Pinça sem corte | Ferramentas de Belas Ciências | 11052-10 | |
| Colagenase tipo IV | Gibco | 1704-019 | |
| DMEM-HG | Sigma | D5796 | |
| Incubadora | de ovos Incumatic de México | Incumatic 1000 | |
| Fetal bovino | gibco | 16000069 | |
| fino fórceps cirúrgico | fine science tools | 9115-10 | |
| hanks equilibrado solução salina | sigma | h6648 | |
| microcentrífuga | eppendorf | 5417r | |
| micropipeta | na na | ||
| na fio de paládio | goodfellow | 7440 05-3 | |
| Placa de Petri | Nest | 705001 | |
| Pippette | crmglobe | PF1016 | |
| Estereomicroscópio | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Fita | NA | NA | |
| Tripsina suína | Merck | 9002-7 | |
| Agulha de tungstênio | GoodFellow | E74-15096/01 |
Referências
- Malashichev, Y., Christ, B., Pröls, F. Avian pelvis originates from lateral plate mesoderm and its development requires signals from both ectoderm and paraxial mesoderm. Cell and Tissue Research. 331 (3), 595-604 (2008).
- Mahmood, R., et al.
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Reimpressões e permissões
