Summary
Une méthode pour réactiver les cellules souches neurales quiescentes dans les explants cérébraux de drosophiles en culture a été établie. En utilisant cette méthode, le rôle des signaux systémiques peut être découplé des signaux intrinsèques des tissus dans la régulation de la quiescence, de l’entrée et de la sortie des cellules souches neurales.
Abstract
Les cellules souches neurales (CSN) ont la capacité de proliférer, de se différencier, de subir une apoptose et même d’entrer et de sortir de la quiescence. Bon nombre de ces processus sont contrôlés par l’interaction complexe entre les programmes génétiques intrinsèques du NSC et les facteurs extrinsèques du NSC, locaux et systémiques. Dans l’organisme modèle génétique, Drosophila melanogaster, NSC, connus sous le nom de neuroblastes (NB), passent de la quiescence à la prolifération pendant la transition embryonnaire à larvaire. Pendant ce temps, les larves émergent de leurs coquilles d’œufs et commencent à ramper, à la recherche de nutriments alimentaires. En réponse à l’alimentation animale, le corps gras, un organe endocrinien avec une capacité de stockage des lipides, produit un signal, qui est libéré par voie systémique dans l’hémolymphe circulante. En réponse au signal dérivé du corps gras (FBDS), les peptides analogues à l’insuline de la drosophile (Dilps) sont produits et libérés par les neurones neurosécrétoires cérébraux et la glie, conduisant à l’activation en aval de la signalisation de croissance PI3-kinase dans les NB et leur niche gliale et trachéale. Bien qu’il s’agisse du modèle actuel de la façon dont les NB passent de la quiescence à la prolifération, la nature du signal extrinsèque FBDS reste insaisissable. Pour mieux comprendre comment les signaux systémiques extrinsèques du NB régulent la sortie de la quiescence, une méthode a été mise au point pour cultiver les premiers cerveaux larvaires in vitro avant l’alimentation des animaux. Avec cette méthode, des facteurs exogènes peuvent être fournis au milieu de culture et nb sortir de la quiescence testée. Nous avons constaté que l’insuline exogène est suffisante pour réactiver les NB de la quiescence dans les explants du cerveau entier. Parce que cette méthode est bien adaptée aux écrans à grande échelle, nous visons à identifier des indices extrinsèques supplémentaires qui régulent les décisions de quiescence nb par rapport aux décisions de prolifération. Étant donné que les gènes et les voies qui régulent les décisions de prolifération du NSC sont conservés de manière évolutive, les résultats de ce test pourraient fournir un aperçu de l’amélioration des thérapies régénératives en clinique.
Introduction
Les cellules souches sont d’un grand intérêt en raison de leur potentiel d’utilisation en médecine régénérative 1,2. De nombreux animaux, en particulier ceux qui ont une longue durée de vie, maintiennent des cellules souches dans leurs tissus adultes. Ces cellules souches résidentes fonctionnent pour maintenir l’homéostasie tissulaire et sont utilisées pour la réparation après une blessure physique ou une maladie 3,4. La plupart des cellules souches chez les animaux adultes sont quiescentes, un état relativement dormant caractérisé par l’arrêt du cycle cellulaire et l’inactivation de la signalisation de croissance5. En réponse aux signaux extrinsèques, les cellules souches sortent de la quiescence, entrent dans le cycle cellulaire et commencent à générer une progéniture fille spécifique à leur type de tissu. Par exemple, afin de monter une réponse immunitaire efficace, les cellules présentatrices d’antigènes induisent des lymphocytes T naïfs quiescents à entrer dans le cycle cellulaire et à se dilater clonalement6. En réponse aux lésions musculaires squelettiques, les cellules souches satellites musculaires entrent dans le cycle cellulaire et génèrent des myoblastes filles pour remplacer les myofibrilles endommagées 5,7. Bien qu’il soit clair que les cellules souches quiescentes répondent aux signaux extrinsèques, dans de nombreux cas, la nature du signal extrinsèque reste incertaine ainsi que le mécanisme d’activation des cellules souches induite par le signal. Mieux comprendre comment les cellules souches quiescentes réagissent aux signaux extrinsèques et entrent dans le cycle cellulaire aidera au développement de meilleures thérapies à base de cellules souches en clinique et augmentera les connaissances scientifiques.
Depuis des décennies, des organismes modèles sont utilisés pour découvrir les gènes et les voies de signalisation cellulaire qui régulent la prolifération des cellules souches au cours du développement et à l’âge adulte. Chez la drosophile, les cellules souches neurales (CSN), connues sous le nom de neuroblastes (NB), se divisent tout au long du développement pour générer tous les neurones et la glie qui s’intègrent finalement, formant le circuit neuronal nécessaire au fonctionnement du cerveau 8,9. Comme les autres cellules souches, les NB se divisent de manière asymétrique pour s’auto-renouveler et, dans certains cas, symétriquement pour élargir le pool de cellules souches. Les NB sont spécifiés pendant l’embryogenèse et la plupart entrent en quiescence vers la fin, coïncidant avec la diminution des réserves de nutriments maternels (Figure 1). Une fois l’embryogenèse terminée, les larves éclosent et commencent à se nourrir. En réponse à l’alimentation animale, les NB se réactivent de la quiescence et reprennent les divisions cellulaires 10,11,12,13,14,15,16. Parce que le SNC de la drosophile est relativement simple et parce que les NB entrent et sortent de la quiescence à des moments définis, l’utilisation de la drosophile pour étudier la régulation de la quiescence, de l’entrée et de la sortie s’avère idéale.
Figure 1 : Prolifération relative des NB CB (neuroblastes cérébraux centraux, rouges) et des NB MB (neuroblastes du corps champignon, bleu) au cours du développement. À la fin de l’embryogenèse, la plupart des NB (ligne rouge) cessent de proliférer et entrent en quiescence. La quiescence se poursuit jusqu’à ce que les larves fraîchement écloses consomment leur premier repas complet. Les points de focalisation temporels de cette méthodologie sont indiqués en cercles rouges (1, quiescence et 2, réactivation). Les NB MB (bleu) sont un sous-ensemble des NB du cerveau central qui se divisent continuellement tout au long du développement (4 par hémisphère cérébral). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
En réponse à l’alimentation animale, les voies de signalisation de croissance PI3-kinase et TOR deviennent actives dans les NB et dans leur niche gliale et trachéale 10,11,15,16. Lorsque les nutriments alimentaires sont retirés ou lorsque les niveaux de PI3-kinase sont réduits, les NB ne parviennent pas à se réactiver et la croissance de la glie et de la trachée est également réduite 10,11,15,16. Le modèle actuel postule que la réactivation du NB est couplée à la croissance larvaire par le corps gras, qui libère un signal systémique en réponse à l’alimentation animale 12,17,18. Ce signal, qui reste insaisissable, favorise probablement l’expression et la libération du peptide analogue à l’insuline de la drosophile (Dilps) dans le cerveau, ce qui conduit à l’activation en aval de la PI3-kinase dans les NB et leur niche gliale et trachéale. Pour mieux comprendre la nature du ou des signaux systémiques, nous avons mis au point une méthode pour réactiver les NB quiescents dans les explants cérébraux cultivés. Avec cette méthode, la réactivation des NB peut être testée en l’absence d’indices systémiques d’animaux entiers. Les facteurs exogènes peuvent être réapprovisionnés dans le milieu de culture et la réactivation du NB peut être testée en fonction de l’incorporation de l’analogue de la thymidine, l’EdU. En utilisant cette méthode, nous avons déterminé que l’insuline exogène est suffisante pour réactiver les NB quiescents dans les explants cérébraux. Les travaux futurs viseront à identifier d’autres facteurs qui, lorsqu’ils sont rajoutés, régulent positivement ou négativement la quiescence nb dans les explants cérébraux.
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Protocol
1. Collecte de larves de drosophiles
REMARQUE: Préparez l’assiette de levure, la pâte de raisin et le condo Fly avant de commencer:
- Pâte de levure: Dans un petit récipient, mélanger 5 g de levure sèche active avec 10 mL d’eau pour former une pâte qui a la consistance du beurre d’arachide. Couvrez la pâte de levure avec une pellicule de plastique et utilisez un élastique pour la fixer fermement au récipient.
REMARQUE: La pâte de levure fraîche se dilatera dans son récipient et se détachera du couvercle à moins d’être fermement attachée. La pâte de levure durera plusieurs jours à température ambiante (RT). - Assiettes de raisin: Suivez la recette pour faire des assiettes de raisin (tableau 1). Si vous utilisez des plaques stockées à 4 °C, assurez-vous de préchauffer les plaques avant utilisation en les plaçant à RT pendant 1 h.
- Mélanger l’eau (750 mL) et la gélose (18,75 g) dans une fiole de 4 L, tourbillonner et autoclave pendant 20 min (cycle liquide).
- Mélanger le jus de raisin (250 ml) et le saccharose (25 g) dans une fiole de 1 L avec une grande barre d’agitation sur une plaque chauffée (feu doux). Lorsque le saccharose est dissous, éteignez le feu, attendez que la fiole puisse être touchée avant d’ajouter du Tegosept (10%, 4 mL) et de l’acide propionique (5 mL). Gardez la barre de remuage allumée.
- Lorsque l’autoclavage est terminé, laissez refroidir jusqu’à ce que la fiole puisse être touchée (~60 °C), puis mélangez le mélange de jus de raisin.
- Mélanger toutes les solutions dans une fiole et laisser remuer sur la plaque.
- Pipeter la solution dans des couvercles de boîtes de Petri de petite taille (35 mm). Pipette environ 9 mL par couvercle ou jusqu’à l’obtention d’un dôme convexe.
- FACULTATIF: Allumez les couvercles pour vous débarrasser des bulles.
- Lorsque les assiettes se solidifient, empilez les assiettes de raisin dans une boîte avec un couvercle hermétique et placez la boîte à 4 °C. Les assiettes peuvent être conservées jusqu’à 1 mois.
- Fly condo: Percez ~ 20 trous dans une bouteille de drosophile en polypropylène à fond carré de 6 onces à l’aide d’une aiguille de 18 G.
- Transférez les mouches adultes (~ 100 OregonR ou tout génotype) dans un condo à mouches et coiffez le condo avec une assiette de gélose au raisin surmontée d’une noisette de pâte de levure. Placez le tampon vers le centre de la plaque et fixez la plaque sur le condo avec du ruban adhésif de laboratoire.
- Inverser le récipient de manière à ce que la plaque de gélose au raisin soit sur le fond et placer dans un incubateur à 25 °C pendant 24 h (Figure 2).
Figure 2 : Représentation visuelle d’une bouteille de mouche inversée (condo) avec des adultes drosophiles mâles et femelles. La bouteille en plastique a de petites perforations, générées avec une aiguille de 18 G, pour l’échange d’oxygène. La bouche de la bouteille est scellée avec un bouchon de jus de raisin agar et est inversée et stockée dans un incubateur à 25 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Après 24 h, changez la plaque de gélose au raisin et remplacez-la par une nouvelle assiette garnie de pâte de levure. Changez rapidement les deux plaques tout en tapotant légèrement le condo sur le banc afin que les mouches adultes ne s’échappent pas.
- Examinez la plaque à l’œil et évaluez le nombre d’embryons sur la plaque. Les embryons de drosophiles sont oblongs et blancs avec deux appendices en forme de ficelle.
- S’il y a très peu d’embryons sur la plaque (moins de 100), jetez la plaque (grattez la gélose dans la poubelle à mouches et conservez le couvercle en plastique pour la réutiliser). Dans de nombreux cas, les femelles adultes ne pondront pas beaucoup d’embryons la première nuit dans un nouveau condo. Si tel est le cas, donnez aux mouches adultes 24 heures supplémentaires pour s’acclimater.
- S’il y a un grand nombre d’embryons sur la plaque (au moins 100), conservez-la et retirez soigneusement la pâte de levure à l’aide d’une spatule à fond plat.
- Une fois la pâte de levure retirée, utilisez un pic en métal pour retirer manuellement toutes les larves de la plaque de raisin sous un microscope à dissection. Lorsque vous regardez la plaque sous un microscope à dissection, des larves rampantes doivent être observées ainsi que des embryons.
- Enlevez toutes les larves en brossant le pic métallique vers le côté d’une larve. Les larves sont collantes et colleront au pic. Une fois qu’une larve est sur le pic, des larves supplémentaires peuvent être facilement ramassées en utilisant la larve sur l’outil pour en attacher plus.
REMARQUE: Les larves aiment se coller les unes aux autres. À ce stade, peu importe si les larves sont endommagées. Ces larves seront jetées. - Après avoir cueilli et retiré toutes les larves, replacez la plaque dans l’incubateur à 25 °C. Assurez-vous de placer la plaque dans un récipient plus grand qui peut être scellé. Placez des serviettes en papier humides dans le fond du plus grand récipient pour garder l’humidité.
- Après 30-60 min, ramenez la plaque au microscope à dissection et maintenant, cueillez soigneusement ~ 20-25 larves de la même plaque de gélose de raisin pour vous assurer que les larves cueillies sont fraîchement écloses dans une fenêtre de temps de 30-60 minutes.
- Immergez la pointe de l’outil avec les 20-25 larves fraîchement écloses dans une boîte de Petri (60 mm) remplie de 1-2 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 2 min.
- Après 2 min, basculez le plat à un angle pour mettre le liquide en commun au fond. À l’aide d’un petit pinceau, brossez les larves hors du liquide au fond de la boîte de Pétri.
- Recueillir toutes les larves sur le pinceau et transférer les larves dans une nouvelle boîte de Petri (60 mm) contenant 1-2 mL d’éthanol à 70%. Répétez les étapes 1.15 pour recueillir les larves avec un pinceau et les transférer dans une nouvelle boîte de Petri avec 1-2 mL de 1x PBS.
2. Milieux de culture et préparation des outils
- Vaporiser le banc et la zone de travail avec 70% d’éthanol et laisser sécher.
- Vaporisez les outils de dissection, les pinces et deux plats de montre en verre avec 70% d’éthanol et laissez-les sécher sur le banc.
- Faites le support de Schneider complété (SSM, Tableau 2) et placez-le sur la glace.
- Pipette 1 mL de SSM dans chacun des plats de montre en verre.
- À l’aide d’une micropipette avec une pointe stérile, transférez les larves fraîchement écloses de la plaque de PBS au SSM dans le premier plat de montre en verre. À l’aide d’une micropipette avec une pointe stérile, transférez les larves fraîchement écloses au MSU dans le deuxième plat de montre en verre.
3. Dissections et cultures cérébrales
- Une fois que les larves sont dans le deuxième plat de montre en verre avec SSM, disséquez le cerveau des larves à l’aide d’une pince et d’un microscope à disséquer. Ajustez le grossissement si nécessaire.
- Utilisez une pince pour saisir les crochets buccaux et avec l’autre, attrapez doucement le corps à mi-chemin et tirez dans la direction opposée (Figure 3) pour diviser la larve en deux morceaux.
REMARQUE: Le cerveau sera situé juste derrière les crochets buccaux. Notez qu’il peut y avoir d’autres tissus entourant le cerveau. Soyez très prudent lorsque vous enlevez ces tissus, car cela peut endommager le cerveau
Figure 3 : Larves de drosophiles dans un plat de montre en verre avec SSM. Les forceps sont correctement positionnés pour la dissection. L’emplacement du cerveau larvaire (gris foncé) est postérieur aux crochets buccaux (noir), et les deux sont montrés à l’intérieur de la larve. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Une fois que 15 à 20 cerveaux ont été disséqués, ajoutez 1 mL de MSU dans un puits d’un plateau de culture stérile à 12 puits. Transférer les cerveaux fraîchement disséqués dans le MSU à l’aide d’une micropipette et d’une pointe stérile (Figure 4A).
- Placer les cerveaux dans le milieu SSM dans le plateau de culture à 12 puits dans un incubateur à 25 °C pendant 24 h (Figure 4A).
Figure 4 : Culture cérébrale et immunocoloration. (A) Cerveaux entiers dans une boîte de culture de 12 puits contenant 1 mL de MSU. Le plat de culture est ensuite placé dans un incubateur à 25 °C pendant 24 h. (B) Mini plateau de 72 puits qui contient les explants cérébraux pendant l’immunocoloration. Les cerveaux sont lavés et les solutions transférées à l’aide d’une micropipette P20 réglée sur 10 μL. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Test de prolifération, fixation cérébrale et coloration des anticorps
- Le lendemain, faites 1 mL de solution EdU SSM. Pipette 10 μL d’un stock de 10 mM de 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) avec 990 μL de SSM (la concentration finale d’EdU est égale à 0,1 mM) dans un tube de microcentrifugeuse stérile et mélange. Une fois l’incubation terminée pendant 24 heures, pipeter les 1 mL de MSU EdU dans un puits du plateau de culture stérile à 12 puits.
- Transférer les cerveaux à l’aide d’une micropipette avec une pointe stérile du puits contenant du MSU uniquement au nouveau puits contenant la solution de MSU EdU. Incuber pendant 1 h à 25 °C.
- Ensuite, transférer les cerveaux marqués EdU dans un autre puits dans le même plateau de culture contenant 1 mL de fixateur (4% de paraformaldéhyde, voir tableau 3 pour la recette) pendant 20 min.
ATTENTION : Le paraformaldéhyde présente un danger biologique et doit être éliminé correctement. - Après la fixation, transférez rapidement les cerveaux dans les puits d’un mini plateau de 72 puits à l’aide d’une micropipette. Chaque puits peut contenir 10 cerveaux et 10 à 15 μL de liquide (figure 4B). Une fois que les cerveaux sont transférés dans le mini plateau (pas plus de 10 cerveaux par puits), retirez la solution et rincez les cerveaux 3 fois dans 10 μL de 1x PBT (tampon phosphate, pH 7,4 contenant 0,1% Triton-X 100).
REMARQUE: Le rinçage consiste à pipeter 10 μL de 1x PBT sur le cerveau, à retirer et à répéter 3 fois. - Ensuite, lavez le cerveau 3 fois pendant 10 minutes chacun, encore une fois dans 10 μL 1x PBT. Assurez-vous que le cerveau est recouvert de liquide en tout temps.
- Une fois les lavages terminés, pipeter 10 μL de solution bloquante (1x PBT avec 10% de sérum de chèvre normal) sur le cerveau. Couvrez le plateau et scellez-le à l’aide d’une bande de parafilm autour du bord.
- Une fois scellé, placez le mini plateau dans une boîte scellée avec des serviettes humides pour fournir un environnement humide afin d’éviter l’évaporation. Placez la boîte contenant le plateau à 4 °C pendant la nuit.
- Le lendemain, préparez une solution d’anticorps primaire.
REMARQUE: Dans ce protocole, l’anti-gribouillage de lapin a été utilisé pour marquer les membranes cellulaires et l’anti-deadpan de rat pour marquer les neuroblastes, bien qu’un certain nombre d’autres anticorps primaires puissent être utilisés.- Pour fabriquer la solution d’anticorps primaire, commencez par diluer les anticorps primaires dans la solution bloquante. Par exemple, l’anti-gribouillage de lapin est utilisé à une concentration finale de 1:1000. Par conséquent, diluez d’abord l’anticorps anti-gribouillage du lapin à 1:100 (1 μL d’anticorps plus 99 μL de solution bloquante). Rat-deadpan est utilisé à une concentration finale de 1:100. Par conséquent, diluez d’abord l’anticorps rat-deadpan à 1:10 (1 μL d’anticorps plus 9 μL de solution bloquante).
REMARQUE: Ces dilutions peuvent être stockées à long terme à 4 ° C si l’azoture de sodium (0,05%) est également ajouté pour inhiber la croissance bactérienne. - Ensuite, comptez le nombre de puits qui contiennent des cerveaux. Le nombre de puits détermine le volume de solution d’anticorps primaires à fabriquer. Par exemple, s’il y a 2 puits de cerveau, préparez 20 μL de solution d’anticorps primaire (pour 10 puits, 100 μL, etc.). Pour obtenir une solution d’anticorps primaire de 20 μL, ajouter 2 μL de chaque dilution d’anticorps primaire et 16 μL de la solution bloquante.
REMARQUE: La concentration finale de chacun des anticorps primaires est de 1:1000 et 1:100, respectivement. En bref, faites la première dilution des anticorps primaires à une concentration de sorte que la deuxième dilution soit toujours de 1:10 pour arriver aux concentrations finales respectives. Dans ce cas, 1:1000 pour le lapin anti-gribouillage et 1:100 pour le rat anti-deadpan.
- Pour fabriquer la solution d’anticorps primaire, commencez par diluer les anticorps primaires dans la solution bloquante. Par exemple, l’anti-gribouillage de lapin est utilisé à une concentration finale de 1:1000. Par conséquent, diluez d’abord l’anticorps anti-gribouillage du lapin à 1:100 (1 μL d’anticorps plus 99 μL de solution bloquante). Rat-deadpan est utilisé à une concentration finale de 1:100. Par conséquent, diluez d’abord l’anticorps rat-deadpan à 1:10 (1 μL d’anticorps plus 9 μL de solution bloquante).
- Retirer la solution bloquante avec la micropipette réglée sur 10 μL et pipeter 10 μL de solution d’anticorps primaire dans chaque puits.
- Couvrez et scellez le plateau à l’aide d’un parafilm et replacez-le dans la boîte scellée avec des serviettes humides. Incuber toute la nuit à 4 °C.
REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de secouer et est fortement déconseillé. Les anticorps pénètrent dans le cerveau sans trembler ni mélanger. - Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaire à l’aide d’une micropipette et rincez le cerveau 3 fois avec 10 μL de 1x PBT. Ensuite, lavez le cerveau 4 fois avec 10 μL de 1x PBT pendant 10 minutes chacun. Pendant les 10 minutes de lavage, préparez la solution d’anticorps secondaire.
- Pour fabriquer la solution d’anticorps secondaires, choisissez des anticorps secondaires qui reconnaissent les anticorps primaires. Dans ce protocole, Alexa Fluor 488 anti-lapin chèvre et Alexa 555 anti-rat chèvre ont été utilisés.
- Pipeter 1 μL de chacun des anticorps secondaires dans un tube de microcentrifugation avec 298 μL de la solution bloquante pour obtenir la concentration finale de 1:300 pour chaque anticorps secondaire.
- Après les 10 dernières minutes de lavage, retirer le 1x PBT et pipeter 10 μL de la solution d’anticorps secondaire dans chaque puits. Scellez le plateau à l’aide d’un parafilm et replacez-le dans la boîte avec des serviettes humides. Incuber toute la nuit à 4 °C.
REMARQUE: Ne vous inquiétez pas de retirer chaque μL dans les puits entre les rinçages, les lavages ou lors de l’ajout de solutions d’anticorps primaires et secondaires. Les cerveaux resteront toujours immergés dans quelques μL de liquide, ce qui est très bien. - Le lendemain, retirez la solution d’anticorps secondaire à l’aide d’une micropipette et rincez le cerveau 3 fois avec 10 μL chacun de 1x PBT. Ensuite, lavez le cerveau 4 fois avec 10 μL chacun de 1x PBT pendant 10 minutes chacun.
- Pendant les lavages de 10 minutes, préparez le mélange de réaction EdU pour détecter l’incorporation d’EdU. Préparez le mélange de réaction EdU conformément aux directives du fabricant.
- Après le lavage final, retirez le 1x PBT et pipette 10 μL du mélange de réaction EdU dans chaque puits avec des cerveaux. Scellez la plaque de micropuit avec un parafilm et recouvrez-la d’une feuille d’aluminium. Laisser la plaque sur le banc pendant 30 min.
- Après 30 min, rincez le cerveau 3 fois avec 10 μL chacun de 1x PBT et lavez le cerveau 3 fois avec 10 μL chacun de 1x PBT pendant 5 min chacun.
- Après le dernier lavage, retirez le 1x PBT et pipette 10 μL d’une solution de support de montage à base de glycérol. Sceller la plaque et la placer à 4 °C pendant la nuit.
5. Montage et imagerie du cerveau
- Le lendemain, préparez des lames de microscope (25 mm x 75 mm x 1 mm) : Collez (p. ex. supercolle) un verre de couverture carré de 22 mm x 22 mm x 1 mm à chaque extrémité de la lame de microscope pour créer un « pont » sur lequel le plus grand couvercle de 22 mm x 50 mm x 1 mm sera placé pour créer un espace entre la lame et le plus grand couvercle (Figure 5A). Cet espace permettra au cerveau d’orienter correctement le mouvement juste assez tout en l’empêchant d’être écrasé.
Figure 5 : Schéma montrant la lame de microscope, l’orientation et les types de cellules dans le cerveau larvaire. (A) Représentation visuelle de la lame de microscope sur laquelle un cerveau larvaire est monté et prêt à être imagé. (B) Il est également démontré qu’une ligne directrice est utilisée pour l’orientation des tissus. (C) Lame de microscope prête pour l’imagerie sur un microscope confocal. (D) Caricature montrant certains des types de cellules dans le cerveau larvaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Après avoir collé les verres de couverture de 22 mm x 22 mm x 1 mm sur la lame du microscope, pipettez 9,3 μL de la solution de support de montage à base de glycérol contenant un cerveau provenant d’un puits de la plaque de micropuit et placez-la au centre de la lame (Figure 5A).
REMARQUE: Les cerveaux larvaires peuvent adhérer à la pointe de la pipette, alors soyez prudent. Pour éviter l’adhérence, commencez par aspirer l’antifade, puis aspirez le cerveau unique vers la fin du volume de 9,3 μL. - Une fois que le cerveau est sur la glissière, placez doucement le couvercle de 22 mm x 50 mm x 1 mm sur le dessus. Positionnez le cerveau comme on le voit à la figure 5B. Déplacez doucement le couvercle pour orienter le cerveau. L’échantillon est alors prêt pour l’imagerie.
- Utilisez un microscope confocal équipé d’un grossissement élevé et d’un objectif à grande ouverture numérique (Figure 5C) pour acquérir les meilleures images. Par exemple : lentille à immersion dans l’huile 60x ou 63x, 1,4 NA.
- Imagez les cerveaux avec la surface dorsale la plus proche de la lèvre de couverture (et objective). Acquérir les piles Z à travers tout l’hémisphère cérébral en commençant par la surface ventrale (la plus éloignée de l’objectif) à des intervalles de 1 μm ou à la taille d’un pas Z.
REMARQUE: Les lasers utilisés dépendent des anticorps secondaires. Dans ce protocole, les lignes laser utilisées étaient de 488 nm pour détecter la coloration Scribble, 555 nm pour détecter Deadpan et 633 nm pour détecter EdU.
- Imagez les cerveaux avec la surface dorsale la plus proche de la lèvre de couverture (et objective). Acquérir les piles Z à travers tout l’hémisphère cérébral en commençant par la surface ventrale (la plus éloignée de l’objectif) à des intervalles de 1 μm ou à la taille d’un pas Z.
6. Analyse des données
- Utilisez le logiciel open source Fidji pour analyser les hémisphères cérébraux et utilisez le plugin de compteur de cellules Fidji pour compter les cellules.
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Representative Results
Des cerveaux de type sauvage de l’OregonR fraîchement éclos ont été disséqués et cultivés pendant 24 heures dans des milieux de Schneider supplémentés (SSM) avec de l’insuline. Les tissus ont été fixés et colorés conformément au protocole. Des anticorps primaires générés contre Deadpan (Dpn) pour détecter les NB et Scribble pour marquer les membranes cellulaires ont été utilisés. L’analogue de la thymidine 5-Ethynyl-2′-désoxyuridine (Edu) a été ajouté pour détecter l’entrée en phase S et la réactivation du NB. Nous avons trouvé des NB Edu positifs et Dpn positifs de grande taille après 24 h en culture (Figure 6A-C). Ensuite, des cerveaux de type sauvage OregonR fraîchement éclos ont été cultivés pendant 24 heures dans des milieux Schneiders supplémentés sans insuline. Après 24 h en culture, nous n’avons trouvé aucun NB Edu positif et Dpn positif de grande taille autre que les quatre NB du corps du champignon et un NB ventrolatéral (Figure 6D-F). Le corps du champignon et les neuroblastes ventrolatéraux sont un sous-ensemble des neuroblastes cérébraux centraux qui se divisent continuellement pendant la transition embryonnaire-larvaire. Nous concluons que l’insuline exogène est suffisante pour réactiver les neuroblastes de la quiescence dans les explants cérébraux cultivés dans les milieux de Schneider.
Au cours de l’imagerie confocale, certains hémisphères cérébraux présentant des dommages ont parfois été observés. Les dommages que nous avons trouvés consistaient en des trous de petite à grande taille dans le tissu cérébral explanté (Figure 6G, H). Ces tissus ont été exclus de l’analyse. En plus du point de temps de 24 heures, les cerveaux ont également été cultivés avec succès pendant 48 heures (données non présentées). Après 48 h en culture, nous avons constaté une nouvelle augmentation du nombre de CB Dpn positifs à l’EdU et une augmentation du nombre de cerveaux présentant des lésions tissulaires. Cela suggère que la culture du cerveau à long terme est probablement faisable; cependant, il faut prendre grand soin d’éviter les dommages tissulaires.
Figure 6 : Imagerie confocale. (A-C) L’insuline exogène est suffisante pour réactiver les NB quiescents. (A) Projection d’intensité maximale d’un hémisphère cérébral montrant des NB Positifs de Deadpan (Dpn) et Edu après 24 h de culture en présence d’insuline. (B) Une seule image en tranche Z du même hémisphère cérébral avec des membranes cellulaires de marquage immunocolorant Scribble (Scrib) marquantes. (C) Grossissement élevé de NB dans l’encart du panneau B. Images en niveaux de gris monocanal avec fusion des couleurs en bas à droite. (D-F) Les NB restent calmes en l’absence d’insuline exogène. (D) Une projection d’intensité maximale d’un hémisphère cérébral montrant des NB Dpn et Edu positifs après 24 h de culture en l’absence d’insuline. (E) Une seule pile Z du même hémisphère cérébral avec immunocoloration Scrib. (F) Grossissement élevé de NB dans l’encart du panneau E. Images en niveaux de gris monocanal avec fusion des couleurs en bas à droite. Arrowhead désigne l’un des 4 Mo de nb, qui se divisent en continu et n’entrent pas et ne sortent pas de quiescence (voir Figure 1). (G,H) Exemples d’explants cérébraux endommagés, non utilisés dans l’analyse. (G) Une seule tranche Z d’un hémisphère cérébral avec de grands trous dans le tissu. (H) Une seule tranche Z d’un hémisphère cérébral montre de petits trous dans le tissu. Barre d’échelle: 10 μm. La ligne pointillée blanche indique la ligne médiane. L’antérieur est vers le haut et le postérieur est vers le bas. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Ingrédient/Quantité | 1 L (~125 assiettes de raisins) |
| Jus de raisin | 250 mL |
| Saccharose | 25 g |
| Eau | 750 mL |
| Gélose Bacto | 18,75 g |
| Tegosept (10 %) | 4 mL |
| Acide propionique | 5 mL |
Tableau 1 : Recette pour faire des assiettes de raisin. Suivez les étapes décrites à la section 1.2.
| Ingrédient (concentration initiale) | Pour faire 5 mL | Concentration finale |
| Les médias de la drosophile de Schneider | 3,89 mL | |
| Sérum fœtal bovin (100%) | 500 μL | 10% |
| Glutamine (200 mM) | 500 μL | 20 mM |
| Pénicilline (5000 unités/mL), streptomycine (50 000 μg/mL) | 100 μL | Stylo 1000 U/mL, 1 mg/mL Strep |
| Insuline (10 mg/mL) | 10 μL | 0,02 mg/mL |
| glutathion (50 mg/mL) | 5 μL | 0,05 mg/mL |
| Dans une hotte stérile, en utilisant la technique stérile, ajouter tous les ingrédients ensemble dans un tube conique de 14 mL. Placez-le sur de la glace jusqu’à utilisation. | ||
Tableau 2 : Recette de fabrication des supports de Schneider (SSM) complétés. Le tableau indique le volume de tous les ingrédients nécessaires à la préparation de 5 mL de MSU.
| Recette pour faire fixative | ||
| Ingrédient (concentration initiale) | Pour faire 40 mL | Concentration finale |
| Formaldéhyde de qualité EM 16% | 10 mL | 4% |
| Tampon PEM pH 7.0 | 29,96 mL | |
| Triton X-100 | 40 mL | 0.10% |
| Mélangez tous les ingrédients ensemble. Aliquote 1 mL dans des tubes de microcentrifugation et conserver à -20 °C. Ne pas recongeler les aliquotes après la décongélation. | ||
| Recette pour le tampon PEM | ||
| Ingrédient (concentration initiale) | Pour faire 100 mL | Concentration finale |
| TUYAUX pH 6,8 (500 mM) | 20 mL | 100 mM |
| EGTA (500 mM) | 2 mL | 10 mM |
| MgSO4 (1 m) | 100 mL | 1 mM |
| Eau | 77,9 mL | |
Tableau 3 : Recette pour créer un fixateur et un tampon PEM. Le tableau répertorie les produits chimiques et leurs concentrations respectives pour la préparation du fixateur et du tampon PEM.
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Discussion
La méthode décrite ici pour cultiver des explants cérébraux peut être réalisée dans la plupart des environnements de laboratoire. Les outils nécessaires, ainsi que la procédure et la collecte de données, sont simples et directs. Avec cette méthode, on peut tester une variété d’hypothèses, y compris celles liées aux cascades de signalisation cellulaire et aux facteurs extrinsèques qui régulent la réactivation et la prolifération du NB. Ici, en utilisant des animaux OregonR de type sauvage, nous avons constaté que l’insuline exogène était suffisante pour réactiver les NB de la quiescence indépendamment d’autres signaux systémiques spécifiques à l’animal. En utilisant le système GAL4 / UAS, on pourrait également renverser ou surexprimer les composants de la voie de l’insuline d’une manière spécifique au type de cellule pour mieux comprendre le rôle de la signalisation PI3-kinase dans la réactivation du NB. En plus d’utiliser la génétique, les composants dans les médias pourraient également être manipulés pour tester davantage les signaux extrinsèques ou les signaux qui favorisent la réactivation et la prolifération du NB. Par exemple, on pourrait tester l’hypothèse selon laquelle l’ajout de l’hormone stéroïde ecdysone augmenterait le pourcentage de réactivation et de prolifération du NB en culture.
Bien que cette méthode soit simple, nous avons rencontré plusieurs difficultés techniques dès le début. La première difficulté technique était l’endommagement des cerveaux disséqués et non fixés lors de changements de médias. Nous avons constaté que le transfert des cerveaux vers un nouveau puits de la boîte de culture au lieu de changer le milieu à l’intérieur du puits entraînait moins de dommages tissulaires parce que des trous dans le cerveau apparaissaient lorsque le milieu était retiré du puits et que les explantations étaient collées au fond du puits. Pour résoudre ce problème, les cerveaux ont été transférés en solution à l’aide d’une pipette et, par conséquent, sont restés continuellement submergés. Un autre aspect technique qui a été modifié a été la stérilisation des outils de dissection. Un masque et des gants étaient portés en tout temps. L’éthanol (70 %) a été utilisé pour pulvériser les outils de dissection et les plateaux de dissection. Cela a permis de réduire au minimum la charge bactérienne. Les étapes avant la fixation doivent être effectuées dans un environnement aussi stérile que possible, de préférence une capuche stérile, et avec des mouvements précis et extrêmement doux. La dernière difficulté que nous avons rencontrée était que les cerveaux étaient collants. Souvent, les cerveaux adhéraient aux parois internes de la pointe de la pipette lorsque nous essayions de les placer sur la lame du microscope pour l’imagerie. Pour résoudre ce problème, nous avons modifié la méthode de transfert du cerveau entre le mini plateau de micropuit et la lame de microscope comme décrit ci-dessus, en remplissant la pointe de la pipette avec un support de montage avant d’aspirer le cerveau dans la pointe de la pipette. Cette méthode a lubrifié l’embout de la pipette avec le support de montage à base de glycérol et a considérablement réduit le collage.
Méthodes de culture des explants cérébraux de drosophiles ont été publiées précédemment 12,19,20,21,22. Une méthode publiée par Prithviraj et al. rapporte la culture de cerveaux larvaires tardifs et nymphaux précoces. Dans ce cas, l’hormone stéroïde ecdysone a été ajoutée au milieu de culture et les cerveaux ont été maintenus en culture jusqu’à 10 h20. Bobstock et al. rapportent la culture de cerveaux d’animaux L1 tardifs / L2 précoces et l’imagerie vivante des NB pendant plusieurs heures dans le cordon nerveux ventral. Ils signalent également des difficultés à manipuler les cerveaux des jeunes larves21. Siller et coll. rapportent cultiver des cerveaux larvaires et utiliser l’imagerie de cellules vivantes pour tester la dynamique du fuseau pendant les divisions de neuroblastes aux stades larvaires moyens à tardifs19. Toutes les méthodes publiées précédemment se concentrent sur les points temporels après le stade larvaire fraîchement éclos avant l’alimentation animale, à une exception près. Dans Britton et al., il est rapporté que les NB se réactivent de la quiescence lorsque les explants cérébraux sont co-cultivés avec le corps gras12. Étonnamment, Britton et al. rapportent également que l’insuline exogène n’était pas suffisante pour réactiver les NB quiescents, contrairement à ce qui est rapporté ici. Par conséquent, jeter les bases de l’idée qu’un FBDS est nécessaire pour la réactivation du NB. Au moment de l’article de Britton, les marqueurs moléculaires spécifiques au NB n’étaient pas encore disponibles et il est clair que la morphologie du cerveau est compromise après 3 jours en culture. Ici, nous fournissons une méthode simple pour réactiver les NB dans les explants cérébraux en ajoutant simplement de l’insuline exogène au milieu de culture. Une note importante de prudence est que la quantité d’insuline ajoutée à la culture dépasse de loin les conditions physiologiques. Des niveaux élevés d’insuline pourraient conduire à des niveaux plus élevés d’activité de la voie PI3-kinase dans les types de cellules cérébrales in vitro par rapport aux conditions in vivo.
Parce que les milieux de culture peuvent être facilement manipulés en ajoutant différents facteurs, cette technique peut être utilisée pour répondre aux hypothèses futures concernant la signalisation extrinsèque et la quiescence NB, l’entrée et la sortie. Cette méthode pourrait également être utilisée pour le dépistage à grande échelle, soit à base d’ARNi, soit à base de drogue. Pour le dépistage à grande échelle, il serait préférable d’utiliser des animaux transgéniques qui expriment des rapporteurs fluorescents. Cela pourrait permettre de contourner la coloration des anticorps, ce qui prend beaucoup de temps. En général, après la pratique, on pouvait mettre en place 10 cultures de 3 cerveaux chacune en 30 min. En une semaine, il peut être raisonnable de dépister 150 conditions différentes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le programme de financement LSAMP Bridges to Doctorate (CNK) ainsi que niH / NIGMS (R01-GM120421 et R35-GM141886). Nous sommes reconnaissants au Dr Conor Sipe pour la figure 1. Nous remercions également tous les membres du laboratoire Siegrist pour leur soutien et leur mentorat continus. Nous remercions tout particulièrement Chhavi Sood et Gary Teeters pour leur lecture attentive du manuscrit et pour leurs commentaires.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 µL Pipette tips | Denville Sci | P2102 | |
| 1000 µL Pipette tips | Denville Sci | P2103-N | |
| 1000 µL Pipettor | Gilson | P1000 | |
| 16% paraformaldehyde (10 x 10 mL) | Electron Microscopy Sciences | 2912.60.0000 | Used for Fixation of Larval Brains |
| 20 µL Pipette | Gilson | P20 | |
| 200 µL Pipette tips | Denville Sci | 1158U56 | |
| 24-well multiwell culture plates | Fisher Scientific | 50-197-4477 | |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-100A | Grape Plate Ingredients |
| 4 °C refrigerator | Fisher Scientific | Provides an ideal temperature for >24 h incubations in antibody solution | |
| 63x Objective | Lecia | ||
| Active dry yeast | Most supermarkets | ||
| Agarose | Fisher Scientific | 214010 | Grape Plate Ingredients |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye | Thermo Fisher Scientific | C10340 | to label proliferating cells |
| Confocal Microscope | Leica | SP8 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm x 1 mm , 10 pack of 4 oz | Fisher Scientific | 12-544-10 | Two Coverslips are super glued to the ends of the microscope slide. This creates a space that allows for the brains to float in antifade while being imaged. |
| Coverslips, 22 mm x 50 mm x 1 mm | Fisher Scientific | 12-545E | The coverslip is placed on two square coverslips on the microscope slide ensuring that the brain in the antifade does not move while imaging. |
| Dissecting microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Ethanol 200 proof (100%), Decon Labs, 1 gallon bottle | Fisher Scientific | 2701 | Used to wash off the larvae before the 24 hr hold in culture medium |
| Fetal Bovine Serum (10%) | Sigma | F4135-100ML | Supplement for cell culture media. |
| Fine forceps for dissection | Fine Science Tools | 11295-20 | Forcepts used in disections. They work best when sharpened. |
| Fly Bottles for Crossing | Genessee Scientific | 32-130 | This bottle is used as a container that lets the flies lay eggs on the grape plate. |
| Glass Dissection Dish (3 well) | These are no longer available | ||
| Glutathione | Sigma | G6013 | Provides oxidative protection during cell culture. |
| Goat Serum | Sigma | G9023- 10ML | Blocking Agent |
| Grape Plates | Made in house | Made in house | Grape juice/agarose plates for collecting freshly hatched eggs |
| Image J | Imagej.net/fiji/downloads | Free Download: https://fiji.sc | Imaging platform that is used to count cells and Edu reactivation |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Ensures that the temperature, humidity, and light exposure is exactly the same throughout experiment. | |
| Insulin | Sigma | I0516 | Independant variable of the experiment |
| Laminar flow hood | For aliquoting culture media | ||
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | Provides support during cell culture |
| Nunc 72-well Microwell Mini Trays | Fisher Scientific | 12-565-154 | Immunostaining steps are performed in this tray |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | Film used to seal plates in order to prevent evaporation |
| Pen-Strep | Sigma | P4458-100ml | Antibiodics used to prevent bacterial contamination of cells during culture. |
| Phosphate Buffer, pH7.4 | Made in house | Made in house | Solvent used to wash the brains after fixing and staining steps |
| Pick | Fine Science Tools | 10140-01 | Used to pick larvae off of the grape plate |
| Propionic acid | Fisher Scientific | A-258 | Grape Plate Ingredients |
| Rabbit 405 | Abcam | ab175653 | Antibodies used for immunostaining |
| Rat 555 | Abcam | ab150166 | Antibodies used for immunostaining |
| Rb Scribble | A Gift from Chris Doe | Antibodies used for immunostaining | |
| Rt Deadpan | Abcam | ab195173 | Antibodies used for immunostaining |
| Schneiders Culture Medium | Life Tech | 21720024 | Contains nutrients that help the cells grow and proliferate |
| SlowFade Diamond Antifade (5 x 2 mL) | Life Tech | S36963 | Reagent that provides protection against fading fluorophores |
| Sterile Water | Autoclave Milli-Q water made in house | Needed for Solutions | |
| Sucrose | Fisher | S2-12 | Grape Plate Ingredients |
| Superfrost Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Superglue | Most supermarkets | ||
| Tegosept | Genesee Scientific | 20-259 | Grape Plate Ingredients |
| Triton-X 100 | Sigma | T9284-100ML | PBT |
| Welch's 100% grape grape juice | Most supermarkets | Grape Plate Ingredients |
References
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