Encapsulamento rápido do Citoesqueleto Reconstituído Dentro de Vesículos Unilamellar Gigantes

Yashar Bashirzadeh; Nadab Wubshet; Thomas Litschel; Petra Schwille; Allen P. Liu

doi:10.3791/63332

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Artigo de método

Encapsulamento rápido do Citoesqueleto Reconstituído Dentro de Vesículos Unilamellar Gigantes

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DOI:

10.3791/63332

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10 de novembro de 2021

Yashar Bashirzadeh^*¹ , Nadab Wubshet^*¹ , Thomas Litschel² , Petra Schwille³ , Allen P. Liu¹^,⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, ²John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences, Harvard University, ³Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry, ⁴Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, Ann Arbor, ⁵Department of Biophysics, University of Michigan, Ann Arbor, ⁶Cellular and Molecular Biology Program, University of Michigan, Ann Arbor

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este artigo introduz um método simples para a produção rápida de vesículas unilamellar gigantes com proteínas citoesqueletal encapsuladas. O método se mostra útil para a reconstituição de estruturas citoesqueletal em interações de confinamento e citoesqueleto-membrana.

Resumo

Vesículas unilamellar gigantes (GUVs) são frequentemente usadas como modelos de membranas biológicas e, portanto, são uma ótima ferramenta para estudar processos celulares relacionados à membrana in vitro. Nos últimos anos, o encapsulamento dentro dos GUVs provou ser uma abordagem útil para experimentos de reconstituição em biologia celular e campos relacionados. Ele imita melhor as condições de confinamento dentro das células vivas, em oposição à reconstituição bioquímica convencional. Métodos de encapsulamento dentro de GUVs muitas vezes não são fáceis de implementar, e as taxas de sucesso podem diferir significativamente de laboratório para laboratório. Uma técnica que tem sido bem sucedida para encapsular sistemas proteicos mais complexos é chamada de encapsulamento contínuo de cruzamento de interface de gotícula (cDICE). Aqui, um método baseado em cDICE é apresentado para encapsular rapidamente proteínas citoesqueletal em GUVs com alta eficiência de encapsulamento. Neste método, primeiro, gotículas lipídicas-monocamadas são geradas pela emulsificação de uma solução proteica de interesse em uma mistura lipídica/óleo. Depois de serem adicionados em uma câmara impressa em 3D rotativa, essas gotículas lipídicas-monocamadas passam por uma segunda monocamada lipídica em uma interface água/óleo dentro da câmara para formar GUVs que contêm o sistema de proteínas. Este método simplifica o procedimento global de encapsulamento dentro dos GUVs e acelera o processo, e assim nos permite limitar e observar a evolução dinâmica do conjunto de rede dentro de vesículas lipídicas bicamadas. Esta plataforma é útil para estudar a mecânica das interações citoesqueleto-membrana no confinamento.

Introdução

Os compartimentos de bicamadas lipídicas são usados como modelo de células sintéticas para estudar reações orgânicas fechadas e processos baseados em membrana ou como módulos portadores em aplicações de entrega de medicamentos ^1,2. A biologia de baixo para cima com componentes purificados requer sistemas experimentais mínimos para explorar propriedades e interações entre biomoléculas, como proteínas e lipídios ^3,4. No entanto, com o avanço do campo, há uma necessidade aumentada de sistemas experimentais mais complexos que imitem melhor as condições nas....