RNA 편집의 신속한 검출을 위한 비시퀀싱 접근법

Ruchika; Toshifumi Tshukahara; Manish Biyani

doi:10.3791/63591

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방법 논문

RNA 편집의 신속한 검출을 위한 비시퀀싱 접근법

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DOI:

10.3791/63591

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2022년 4월 21일

Ruchika ¹ , Toshifumi Tshukahara¹ , Manish Biyani¹^,²

¹Department of Bioscience and Biotechnology, Japan Advanced Institute of Science and Technology, ²BioSeeds Corporation, JAIST Venture Business Laboratory, Ishikawa Create Labo

이 논문에서

요약

게놈 규모에서 RNA 편집 이벤트의 신속한 탐지와 신뢰할 수 있는 정량화는 여전히 어려운 과제이며 현재 직접 RNA 시퀀싱 방법에 의존하고 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 RNA 편집을 감지하는 간단하고 빠르며 휴대용 방법으로 미세 온도 구배 겔 전기 영동 (μTGGE)을 사용합니다.

초록

RNA 편집은 RNA의 전사 후 서열 변경으로 이어지는 과정입니다. RNA 편집의 검출 및 정량화는 주로 Sanger 시퀀싱 및 RNA 시퀀싱 기술에 의존합니다. 그러나 이러한 방법은 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸릴 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 휴대용 마이크로온도 구배 겔 전기영동(μTGGE) 시스템은 RNA 편집의 신속한 검출을 위한 비시퀀싱 접근법으로서 사용된다. 이 과정은 고온을 사용하여 핵산 샘플이 폴리아크릴아미드 겔을 가로 질러 이동할 때 변성시키는 전기 영동 원리에 기반합니다. 다양한 온도에 걸쳐, DNA 단편은 완전히 이중 가닥 DNA의 구배를 형성하여 부분적으로 분리 된 가닥을 형성 한 다음 완전히 분리 된 단일 가닥 DNA로 구배를 형성합니다. 뚜렷한 뉴클레오티드 염기를 갖는 RNA 편집 부위는 μTGGE 분석에서 상이한 용융 프로파일을 생성한다. 우리는 μTGGE 기반 접근법을 사용하여 네 개의 편집된 RNA 단편의 용융 프로파일과 그에 상응하는 편집되지 않은(야생형) 단편 사이의 차이를 특성화했습니다. 패턴 유사성 점수(PaSSs)는 편집된 RNA와 편집되지 않은 RNA에 의해 생성된 밴드 패턴을 비교하여 계산되었고, 방법의 재현성을 평가하기 위해 사용되었다. 전반적으로, 여기에 설명된 플랫폼은 RNA에서 심지어 단일 염기 돌연변이의 검출을 간단하고, 간단하고, 비용 효율적인 방식으로 가능하게 한다. 이 분석 도구는 새로운 분자 생물학 발견에 도움이 될 것으로 예상됩니다.

서론

A-to-I, C-to-U 및 U-to-C 변이체를 포함하는 게놈 RNA의 단일 뉴클레오티드 변이체 (SNV)는 RNA 편집 이벤트를 나타낼 수 있다. 그러나 RNA에서 SNV를 탐지하는 것은 기술적으로 어려운 과제로 남아 있습니다. 종래, 편집된 RNA와 편집되지 않은 RNA의 비율은 직접 시퀀싱, 대립유전자 특이적 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR) 또는 변성 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 접근법 1,2,3,4,5,6에 의해 결정된다. 그러나, 이러한 접근법들은 특별히 시간- 또는 비용-효과적이지 않으며, 높은 수준의 잡음에 의해 야기되는 이들의 낮은 정확도는 RNA 기반 SNV 검출⁽^7,8)에 대한 기술적 병목 현상을 야기한다. 여기에서는 RNA 편집 분석에 대한 직접 RNA 시퀀싱 접근법의 필요성을 제거하는 대안 방법으로 단....