Un approccio non sequenziale per il rilevamento rapido dell'editing dell'RNA

Ruchika; Toshifumi Tshukahara; Manish Biyani

doi:10.3791/63591

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Articolo metodologico

Un approccio non sequenziale per il rilevamento rapido dell'editing dell'RNA

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DOI:

10.3791/63591

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21 aprile 2022

Ruchika ¹ , Toshifumi Tshukahara¹ , Manish Biyani¹^,²

¹Department of Bioscience and Biotechnology, Japan Advanced Institute of Science and Technology, ²BioSeeds Corporation, JAIST Venture Business Laboratory, Ishikawa Create Labo

In questo articolo

Sommario

Il rilevamento rapido e la quantificazione affidabile degli eventi di modifica dell'RNA su scala genomica rimangono impegnativi e attualmente si basano su metodi di sequenziamento diretto dell'RNA. Il protocollo qui descritto utilizza l'elettroforesi su gel a gradiente di microtemperatura (μTGGE) come metodo semplice, rapido e portatile per rilevare l'editing dell'RNA.

Abstract

L'editing dell'RNA è un processo che porta ad alterazioni della sequenza posttrascrittiva negli RNA. Il rilevamento e la quantificazione dell'editing dell'RNA si basano principalmente sulle tecniche di sequenziamento Sanger e di sequenziamento dell'RNA. Tuttavia, questi metodi possono essere costosi e dispendiosi in termini di tempo. In questo protocollo, un sistema portatile di elettroforesi su gel a gradiente di microtemperatura (μTGGE) viene utilizzato come approccio non sequenziale per il rilevamento rapido dell'editing dell'RNA. Il processo si basa sul principio dell'elettroforesi, che utilizza alte temperature per denaturare i campioni di acido nucleico mentre si muovono attraverso un gel di poliacrilammide. Attraverso una gamma di temperature, un frammento di DNA forma un gradiente di DNA completamente a doppio filamento in filamenti parzialmente separati e quindi in DNA a singolo filamento completamente separato. I siti modificati con RNA con basi nucleotidiche distinte producono diversi profili di fusione nelle analisi μTGGE. Abbiamo usato l'approccio basato su μTGGE per caratterizzare le differenze tra i profili di fusione di quattro frammenti di RNA modificati e i loro corrispondenti frammenti non modificati (wild-type). I Pattern Similarity Score (PaSS) sono stati calcolati confrontando i pattern di banda prodotti dagli RNA modificati e non modificati e sono stati utilizzati per valutare la riproducibilità del metodo. Nel complesso, la piattaforma qui descritta consente il rilevamento anche di singole mutazioni di base negli RNA in modo diretto, semplice ed economico. Si prevede che questo strumento di analisi aiuterà i nuovi risultati della biologia molecolare.

Introduzione

Le varianti a singolo nucleotide (SNV) nell'RNA genomico, comprese le varianti A-to-I, C-to-U e U-to-C, possono indicare eventi di modifica dell'RNA. Tuttavia, il rilevamento di SNV nell'RNA rimane un compito tecnicamente impegnativo. Convenzionalmente, il rapporto tra RNA modificato e non modificato è determinato dal sequenziamento diretto, dalla reazione a catena della polimerasi in tempo reale (PCR) specifica per l'allele o dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) che si avvicina^a 1,2,3,4,5,6.