중성자 후방 산란 분광법은 단백질과 단백질의 수화수의 ps-ns 역학에 대한 비파괴적이고 표지 없는 접근을 제공합니다. 워크플로우는 아밀로이드 단백질에 대한 두 가지 연구, 즉 응집 중 리소자임의 시간 분해 역학과 섬유 형성 시 타우의 수화 물 역학에 대한 연구로 제공됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
중성자 산란은 중수소 이외의 표지 없이 비파괴적인 방식으로 광범위한 에너지에 대한 샘플 내 역학을 조사할 수 있는 가능성을 제공합니다. 특히, 중성자 후방 산란 분광법은 여러 산란 각도에서 산란 신호를 동시에 기록하며 ps-ns 시간 척도에서 생물학적 시스템의 역학을 연구하는 데 매우 적합합니다. D2O및 중수소화 완충액 성분을 사용함으로써, 이 방법은 액체 상태에서 단백질의 질량 중심 확산 및 골격 및 측쇄 운동(내부 역학)을 모두 모니터링할 수 있습니다.
또한, 수화수 역학은 H2O로 수화된 과중수소화 단백질 분말을 사용하여 연구할 수 있습니다. 이 논문은 단백질 및 수화수 역학을 조사하기 위해 Institut Laue-Langevin(ILL)의 IN16B 기기에 사용된 워크플로를 제시합니다. 증기 교환을 이용한 용액 시료 및 수화된 단백질 분말 시료의 제조에 대해 설명합니다. 단백질 및 수화수 역학에 대한 데이터 분석 절차는 중성자 후방 산란 분광계에서 얻을 수 있는 다양한 유형의 데이터 세트(준탄성 스펙트럼 또는 고정 창 스캔)에 대해 설명됩니다.
이 방법은 아밀로이드 단백질과 관련된 두 가지 연구로 설명됩니다. 리소자임이 μm 크기의 구형 응집체(미립자로 표시됨)로 응집되는 것은 IN16B에서 조사된 공간 및 시간 범위에서 1단계 공정으로 발생하는 것으로 나타났지만 내부 역학은 변하지 않았습니다. 또한, 타우의 수화수의 역학은 과중수소화 단백질의 수화된 분말에 대해 연구되었다. 물의 병진 운동은 아밀로이드 섬유의 형성시 활성화되는 것으로 나타났습니다. 마지막으로, 프로토콜의 중요한 단계는 다른 실험적 생물물리학적 방법과 관련하여 역학 연구와 관련하여 중성자 산란이 어떻게 위치하는지에 대해 논의됩니다.
서론
중성자는 기초 물리학에서 생물학에 이르기까지 다양한 분야의 샘플을 탐사하는 데 수년에 걸쳐 성공적으로 사용되어 온 전하가 없는 거대한 입자입니다1. 생물학적 응용을 위해, 소각 중성자 산란, 비탄성 중성자 산란, 중성자 결정학 및 반사 측정법이 광범위하게 사용된다 2,3,4. 비탄성 중성자 산란은 특정 표지 그 자체를 필요로 하지 않고 역학의 앙상블 평균 측정을 제공하며, 크기 또는 단백질에 의존하지 않는 신호 품질을 제공한다5. 측정은 중수소화 박테리아 용해물 또는 생체 내 3,6,7과 같은 세포내 배지를 모방하는 연구 중인 단백질에 대해 매우 복잡한 환경을 사용하여 수행할 수 있습니다. 역학을 연구하기 위해 다양한 실험 설정, 즉 i) sub-ps-ps 역학에 대한 비행 시간 액세스 제공, ii) ps-ns 역학에 대한 후방 산란 제공 액세....
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프로토콜
1. 액체 상태의 단백질에 대한 중수소화 완충액 준비
- 완충액의 모든 성분을 순수한D2O에 용해시킨다.
- pH 전극을H2O로 보정한 경우, NaOD 또는DCl34를 사용하여 pD = pH + 0.4 공식에 따라 pD를 조정하였다.
참고: H2O대신 D2O를 사용하면 단백질 용해도에 영향을 미칠 수 있으며 완충액 조건을 조정해야 할 수도 있습니다(예: 염 농도의 약간의 변화).
2. 과중수소화 단백질의H2O-수화 분말을 준비합니다
- 샘플 홀더를 준비합니다.
- 인듐 와이어 씰과 나사로 평평한 알루미늄 샘플 홀더를 물과 에탄올로 철저히 청소하고 건조시킵니다.
알림: 평평한 샘플 홀더는 분말이 표면에 균일하게 분포될 수 있도록 사용됩니다. 분말의 양은 벽 사이에 유지될 수 있고 샘플 홀더를 수직으로 놓을 때 떨어지지 않도록 충분해야 합니다. - 샘플 홀더의 다른 부분(바닥, 뚜껑 및 인듐 와이어)을 정밀 저울에서 개별적으로 칭량합니다.
- ....
- 인듐 와이어 씰과 나사로 평평한 알루미늄 샘플 홀더를 물과 에탄올로 철저히 청소하고 건조시킵니다.
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결과
리소자임의 미립자 응집은 중수소화 완충액(pD 10.5에서 0.1M NaCl)에서 50mg/mL의 단백질 농도로 90°C에서 수행되었습니다. 미립자의 형성은 90°C로의 온도 상승에 의해 촉발되고 6시간 이내에 발생합니다(보충 그림 S8). 데이터 수집은 위의 프로토콜에 설명된 대로 IN16B에서 수행되었습니다(데이터는 ILL에 의해 영구적으로 큐레이팅되고 http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 에서 액세스할 수 있음).
초기 상태를 완전히 특성화하기 위해 7°C에서 QENS 스펙트럼을 획득했습니다. 이어서, 응집 과정을 트리거하기 위해 온도를 90°C(일반적으로 IN16B에서 ~30분 소요, 보충 그림 S9)로 증가시켰습니다. QENS 스펙트럼의 슬라이딩 평균을 사용하여 동역학을 따를 수 있으므로 전체 범위의 에너지 전달에 액세스할 수 있지만 시간 분해능은 제한적입니다. 시간 분.......
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토론
중성자 분광법(neutron spectroscopy)은 중수소를 사용할 때 단백질의 크기나 용액의 복잡성에 관계없이 단백질 샘플의 앙상블 평균 ps-ns 역학을 조사할 수 있는 유일한 방법이다6. 구체적으로, 용액에서 단백질 어셈블리의 자체 확산을 조사함으로써, 이러한 어셈블리의 유체역학적 크기를 명확하게 결정할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이 방법은 일반적으로 낮은 중성자 플럭스에 의해 제한되며, 이는 긴 획득 시간과 할당된 빔 시간 내에 양호한 신호 대 잡음비를 얻기 위해 많은 양의 샘플(일반적으로 100mg의 단백질)이 필요함을 의미합니다.
시료 전처리(프로토콜 단계 1 및 2). 액체 상태 샘플의 경우 사용할 수 있는 최소 농도는 ~50mg/mL입니다(더 낮은 농도는 수집 시간이 길어지는 대신 사용할 수 있음). 높은 단백질 농도는 더 빠른 세동 속도와 관련이 있으며, 이는 할당된 빔 시간에 측.......
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공개 사항
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 SPHERES 장비에서 수행된 중성자 산란 실험의 일부에 대해 독일 가르힝의 Heinz Maier-Leibnitz Zentrum에 있는 Jülich 중성자 과학 센터의 Michaela Zamponi에게 감사를 표합니다. 이 작업은 HPRI-2001-50065 및 RII3-CT-2003-505925 계약에 따라 유럽 연합이 자금을 지원하는 DLAB(Deuteration Laboratory) 컨소시엄의 활동과 보조금 GR/R99393/01 및 EP/C015452/1에 따라 Institut Laue Langevin EMBL DLAB 내에서 영국 공학 및 물리 과학 연구 위원회(EPSRC)가 자금을 지원하는 활동의 혜택을 받았습니다. 제7차 프레임워크 프로그램에 따른 유럽연합 집행위원회(European Commission)의 주요 조치: 유럽 연구 영역 강화, 연구 인프라 강화(Key Action: Strengthening the European Research Area, Research Infrastructures)를 통해 [계약 226507(NMI3)]을 인정합니다. 케빈 푸노 (Kevin Pounot)와 크리스티안 벡 (Christian Beck)은 박사후 연구원 기금에 대해 연방 교육 연구부 (BMBF, 보조금 번호 05K19VTB)에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 알루미늄 샘플 홀더 | 시판되지 않습니다. 기기의 현지 담당자가 제공하거나 현지 담당자가 제공할 수 있는 기술 도면을 기반으로 제조할 수 있습니다. | ||
| 염화 중수소, 35 wt. D2O, ≥ 원자 99% D | 시그마-알드리치 | 543047 | |
| 중수소산화물(D, 99.9%) | 유리소톱 | DLM-4DR-PK | |
| 다우코닝 고진공 실리콘 그리스 | 시그마-알드리치 | Z273554-1EA | |
| 에탄올 96%, EMSURE Reag. Ph Eur | Sigma-Aldrich | 1.5901 | |
| 유리 건조제 | VWR | 75871-660 | |
| 유리 건조제 플레이트, 140mm | VWR | 89038-068 | |
| 인듐 와이어, 1.0mm(0.04인치) 직경, Puratronic, 99.999% | Alfa Aesar | 00470.G1 | |
| 닭 달걀 흰자위에서 추출한 라이소자임 투석, 동결건조, 분말, ~100,000 U/mg | Sigma-Aldrich | 62970 | |
| nPDyn | v3.x | github.com/kpounot/nPDyn 참조, 소프트웨어 | |
| OHAUS AX324 Adventurer 저울, 내부 보정 | Dutscher | 92641 | |
| Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% | Sigma-Aldrich | 214701 | |
| Pipette ErgoOne 0.5-10 μ L | Starlab | S7100-0510 | |
| 피펫 ErgoOne 100-1,000 μ L | Starlab | S7100-1000 | |
| 피펫 ErgoOne 20-200 μ L | Starlab | S7100-2200 | |
| 피펫 팁 TipOne 1,000 μ L | Starlab | S1111-6001 | |
| 피펫 팁 TipOne 10 μ L | Starlab | S1111-3200 | |
| 피펫 팁 TipOne 200 μ L | Starlab | S1111-0206 | |
| 소듐 듀테로옥사이드 용액, 40 wt. D2O, 99.5 원자 % D | 시그마-알드리치 | 372072 |
참고문헌
- Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
- Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. A....
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재인쇄 및 허가
