Summary
Le protocole présente une méthode permettant de dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de tissus pulmonaires primaires, d’élargir les organoïdes pulmonaires et d’induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D qui phénopient fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines.
Abstract
L’absence d’un modèle in vitro robuste de l’épithélium respiratoire humain entrave la compréhension de la biologie et de la pathologie du système respiratoire. Nous décrivons un protocole défini pour dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de cellules souches adultes dans le tissu pulmonaire et induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires. Les organoïdes pulmonaires sont ensuite étendus consécutivement pendant plus de 1 an avec une grande stabilité, tandis que les organoïdes différenciés des voies respiratoires sont utilisés pour simuler morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires humaines à un niveau quasi physiologique. Ainsi, nous établissons un modèle organoïde robuste de l’épithélium des voies respiratoires humaines. L’expansion à long terme des organoïdes pulmonaires et des organoïdes différenciés des voies respiratoires génère une source stable et renouvelable, permettant aux scientifiques de reconstruire et d’étendre les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines dans les boîtes de culture. Le système organoïde pulmonaire humain fournit un modèle in vitro unique et physiologiquement actif pour diverses applications, y compris l’étude de l’interaction virus-hôte, le dépistage de médicaments et la modélisation de la maladie.
Introduction
Les organoïdes sont devenus un outil robuste et universel pour la modélisation in vitro du développement d’organes et l’étude de la biologie et de la maladie. Lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu de culture défini par un facteur de croissance, les cellules souches adultes (ASC) d’une variété d’organes peuvent être étendues en 3 dimensions (3D) et auto-assemblées en grappes cellulaires semblables à des organes composées de plusieurs types de cellules, appelées organoïdes. Le laboratoire de Clevers a rapporté la dérivation du premier organoïde dérivé de l’ASC, l’organoïde intestinal humain, en 2009 1,2. Par la suite, des organoïdes dérivés de l’ASC ont été établis pour une variété d’organes et de tissus humains, y compris la prostate 3,4, le foie 5,6, l’estomac 7,8,9, le pancréas10, la glande mammaire11 et le poumon 12,13 . Ces organoïdes dérivés de l’ASC ont conservé les propriétés cellulaires, structurelles et fonctionnelles critiques de l’organe natif et ont maintenu la stabilité génétique et phénotypique dans la culture d’expansion à long terme14,15.
Les organoïdes peuvent également être dérivés de cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS)16. Alors que les organoïdes dérivés de PSC exploitent les mécanismes de développement des organes pour leur établissement, les ASC peuvent être contraints de former des organoïdes en reconstruisant des conditions qui imitent la niche des cellules souches lors de l’auto-renouvellement physiologique des tissus ou de la réparation des tissus. Les organoïdes dérivés de PSC sont des modèles favorables pour explorer le développement et l’organogenèse, bien qu’incapables d’atteindre le niveau de maturation comparable des organoïdes dérivés de l’ASC. L’état de maturation fœtale des organoïdes dérivés de la CSP et la complexité de l’établissement de ces organoïdes empêchent considérablement leurs vastes applications pour l’étude de la biologie et de la pathologie dans les tissus matures.
Les voies respiratoires humaines, du nez à la bronchiole terminale, sont tapissées de l’épithélium des voies respiratoires, également appelé épithélium cilié pseudostratifié, qui se compose de quatre principaux types de cellules, à savoir les cellules ciliées, les cellules gobelets, les cellules basales et les cellules club. Nous avons créé l’organoïde pulmonaire humain dérivé de l’ASC à partir de tissus pulmonaires humains en collaboration avec le laboratoire12,13 de Clevers. Ces organoïdes pulmonaires sont successivement dilatés dans le milieu d’expansion pendant plus d’un an; la durée précise varie selon les différentes lignées organoïdes obtenues auprès de différents donneurs. Cependant, par rapport à l’épithélium natif des voies respiratoires, ces organoïdes pulmonaires extensibles à long terme ne sont pas assez matures puisque les cellules ciliées, la principale population cellulaire des voies respiratoires humaines, sont sous-représentées dans ces organoïdes pulmonaires. Ainsi, nous avons développé un protocole de différenciation proximale et généré des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D qui phénocopisent morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires à un niveau quasi physiologique.
Ici, nous fournissons un protocole vidéo pour dériver les organoïdes pulmonaires humains des tissus pulmonaires primaires, élargir les organoïdes pulmonaires et induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D.
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Protocol
Toutes les expérimentations utilisant des tissus humains décrits dans le présent document ont été approuvées par le Conseil d’examen institutionnel de l’Université de Hong Kong/Hospital Authority Hong Kong West Cluster (UW13-364 et UW21-695). Le consentement éclairé des patients a été obtenu avant le prélèvement de tissus.
1. Dérivation d’organoïdes pulmonaires humains
- Préparation de matériel expérimental
- Préparer le milieu basal en complétant le milieu DMEM/F12 avancé avec 2 mM de glutamine, 10 mM d’HEPES, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
- Préparer le milieu d’expansion organoïde pulmonaire humain en complétant le milieu basal avec 10 % de R-spondine 1 milieu conditionné, 10 % de milieu conditionné noggin, 1x supplément de B27, 1,25 mM de N-acétylcystéine, 10 mM de nicotinamide, 5 μM de Y-27632, 500 nM d’A-83-01, 1 μM de SB202190, 5 ng/mL de facteur de croissance fibroblyte (FGF)-7, 20 ng/mL de FGF-10 et 100 μg/mL de primocine (voir tableau des matériaux).
REMARQUE: Le milieu conditionné R-spondin 1 et Noggin peut être remplacé par la R-spondine 1 recombinante commerciale (500 ng / mL) et Noggin (100 ng / mL). - Préchauffer une plaque de culture en suspension de 24 puits dans un incubateur de culture cellulaire. Utilisez un incubateur de culture cellulaire standard contenant 5 % de CO2 et une atmosphère humidifiée à 37 °C. Décongeler la matrice du sous-sol dans un réfrigérateur à 4 °C. Gardez la matrice du sous-sol et le milieu de culture sur la glace pendant l’expérimentation.
- Isolement cellulaire à partir de tissus pulmonaires humains pour la culture organoïde 3D
- Procurez-vous des tissus pulmonaires humains fraîchement réséqués d’une taille d’environ 0,5 cm chez les patients qui subissent une résection chirurgicale en raison de diverses maladies. Transporter les tissus pulmonaires dans 30 mL de milieu basal à température ambiante et traiter le plus rapidement possible à l’intérieur d’une hotte de biosécurité.
- Hacher les tissus pulmonaires en petits morceaux (0,5-1 mm) avec un scalpel stérile dans un plat de culture cellulaire de 10 cm. Laver les morceaux de tissu avec 10 mL de milieu basal froid dans un tube centrifuge de 15 mL, suivi d’une centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 8 mL de milieu basal complété par de la collagénase à une concentration finale de 2 mg/mL. Digérer les morceaux de tissu en secouant le tube à 120 tr/min pendant 30-40 min à 37 °C.
- Pipetez de haut en bas pendant 20x pour cisailler les morceaux de tissu digérés à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL. Empiler une crépine de 100 μm sur un tube de centrifugeuse de 50 mL et filtrer la suspension.
- Récupérez les morceaux de tissu sur la crépine avec le milieu basal et transférez-les dans un tube de centrifugeuse de 15 mL, suivi d’une deuxième série de cisaillement et de filtrage. Un cisaillement-filtrage supplémentaire peut être effectué 1x-2x pour isoler plus de cellules, en particulier lorsqu’un petit morceau de tissu (par exemple, <0,5 cm) est acheté.
- Ajouter FBS à l’écoulement avec une concentration finale de 2% pour terminer la digestion, suivie d’une centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de milieu basal, puis la centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- (Facultatif) Si de nombreux érythrocytes sont vus dans la pastille (estimée par la couleur de la pastille), remettez en suspension la pastille cellulaire dans 2 mL de tampon de lyse des globules rouges et incubez à température ambiante pendant 5 min. Ensuite, ajouter 10 mL de milieu basal au tube, suivi d’une centrifugation à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
- Remettez en suspension le granulé dans une matrice froide du sous-sol et conservez-le sur la glace. Ajouter 80-160 μL de matrice de sous-sol pour les cellules récupérées à partir d’un tissu pulmonaire de taille d’environ 0,5 cm; la quantité est suffisante pour ensemencer 2-4 gouttelettes.
- Distribuer 40 μL de suspension dans chaque puits d’une plaque de culture de suspension préchauffée de 24 puits. Incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 10-15 min. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier pour former une gouttelette.
- Ajouter 500 μL de milieu d’expansion des organoïdes pulmonaires humains complété par 5 nM d’Heregulin bêta-1 à chaque puits et incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire.
- Rafraîchissez le support tous les 3 jours. Retirez l’ancien milieu tout en gardant la gouttelette intacte et ajoutez le milieu frais avec prudence. Passage des organoïdes après l’incubation pendant 10-14 jours. Utilisez Heregulin beta-1 uniquement dans la culture initiale avant le premier passage.
- Observez les organoïdes au microscope pour vous assurer que les organoïdes ne sont pas incorporés avec une densité cellulaire très élevée. Si une gouttelette se désintègre en raison d’une densité cellulaire trop élevée, récupérez et réincorporez les organoïdes et les cellules avec un volume plus élevé de matrice sous-jacente pour produire plus de gouttelettes avec une densité cellulaire plus faible et souhaitable.
2. Expansion des organoïdes pulmonaires humains
- Préparez une pipette Pasteur en brûlant l’extrémité d’une pipette Pasteur sur une flamme, comme un brûleur Bunsen, pour réduire l’ouverture de 1,5 mm à environ 1,0 mm de diamètre. Refroidir les pipettes, puis autoclaver pour stériliser. Mouiller les pipettes avec le milieu basal pour éviter la fixation et la perte de cellules lors du cisaillement mécanique.
- Passage des organoïdes pulmonaires avec cisaillement mécanique
- Utilisez une pointe de 1 mL et pipet de haut en bas pour briser les gouttelettes obtenues ci-dessus. Ensuite, transférez les organoïdes avec le milieu dans un tube centrifuge de 15 mL et ajustez le volume à 10 mL avec un milieu basal froid. Jeter le surnageant après centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C
- Laver à nouveau les organoïdes avec 10 mL de milieu basal froid. Remettre en suspension les organoïdes dans 2 mL de milieu basal froid. Pipet de haut en bas pour cisailler les organoïdes en petits morceaux avec une pipette Pasteur.
- Compléter avec le milieu basal jusqu’à un volume total de 10 mL, suivi d’une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettez en suspension les fragments organoïdes avec une matrice de sous-sol froide suffisante pour permettre une expansion de 1:3 à 1:5. Restez sur la glace.
- Placer 40 μL de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque préchauffée de 24 puits. Incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 10-15 min. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier.
- Ajouter 500 μL de milieu d’expansion organoïde pulmonaire à chaque puits et incuber dans un incubateur de culture cellulaire. Rafraîchissez le support tous les 3 jours. Passage des organoïdes toutes les 2 semaines avec un rapport de 1:3 à 1:5.
- Passage des organoïdes pulmonaires avec trypsinisation
REMARQUE: La trypsinisation est préférable lorsqu’il est difficile de cisailler l’organoïde pulmonaire en petits morceaux à l’aide d’un pipot Pasteur, ou que la taille des organoïdes est très variable, ou que les expérimentations ultérieures nécessitent des organoïdes de taille plus uniforme.- Prélevez les organoïdes pulmonaires comme indiqué à l’étape 2.2.1. Remettre l’organoïde en suspension dans 1 mL d’enzyme de dissociation et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 3 à 5 min.
- Ajouter 1 mL de milieu basal au tube. Cisaillez les organoïdes mécaniquement en pipettant les organoïdes de haut en bas en petits morceaux à l’aide d’un pipet Pasteur. Vérifiez la taille des pièces organoïdes au microscope à un grossissement 4x. Ensuite, ajoutez 40 μL de FBS pour mettre fin à la digestion.
REMARQUE: Déterminer la taille des fragments organoïdes au microscope selon l’arrangement expérimental. Si une expérience a besoin de plus d’organoïdes ou d’organoïdes de taille plus uniforme, cisaillez les organoïdes en plus petits morceaux ou même en cellules individuelles. Ensuite, il faut plus de temps, probablement 3 semaines, avant que les organoïdes soient prêts pour l’expérimentation. - Compléter avec le milieu basal jusqu’à un volume final de 10 mL, suivi d’une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre en suspension les pièces organoïdes dans une matrice de sous-sol froide avec un volume suffisant pour passer avec un rapport de 1:5-1:10. Restez sur la glace.
- Placer 40 μL de suspension organoïde dans chaque puits d’une plaque préchauffée de 24 puits. Incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 10-15 min. Laissez la matrice du sous-sol se solidifier.
- Complétez avec 500 μL de milieu d’expansion organoïde pulmonaire par puits et incubez dans un incubateur de culture cellulaire. Actualisez le milieu d’expansion tous les 3 jours. Passage des organoïdes après 2-3 semaines.
REMARQUE: Environ 100 organoïdes sont montés dans une gouttelette de 40 μL de matrice de sous-sol. Les organoïdes pulmonaires se développent normalement mieux avec une densité cellulaire relativement élevée. Réincorporez les organoïdes avec une densité cellulaire plus faible si les gouttelettes se désintègrent ou si les organoïdes en croissance se fixent ensemble en raison de la densité cellulaire trop élevée.
3. Différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires
- Préparer le milieu de différenciation proximal (milieu) en complétant le milieu basal de l’interface air liquide avec 1x supplément d’interface air liquide, 1x supplément d’entretien de l’interface air liquide, 4 μg/mL d’héparine, 1 μM d’hydrocortisone, 10 μM de Y-27632 et 10 μM de DAPT (voir tableau des matériaux).
- Organoïdes 3D des voies respiratoires
- Incuber les organoïdes pulmonaires dans le milieu de dilatation pendant 7 à 10 jours après le passage par cisaillement mécanique. Remplacez le milieu d’expansion par le milieu. Incuber les organoïdes dans le milieu pendant 14 jours dans un incubateur de culture cellulaire.
- Jetez le support dans chaque puits. Ajouter un tampon de lysat cellulaire pour prélever l’organoïde différencié des voies respiratoires pour l’extraction de l’ARN et la détection de l’expression des gènes cellulaires par test RT-qPCR.
- Alternativement, incuber les organoïdes à 37 °C pendant 60 min après l’ajout de 10 mM d’EDTA pour dissocier les organoïdes en cellules individuelles, suivi d’une analyse par cytométrie en flux pour examiner les populations cellulaires. Les organoïdes sont prêts pour diverses manipulations expérimentales.
- Organoïde 2D des voies respiratoires
- Préparez suffisamment d’organoïdes pulmonaires 3D pour la culture de différenciation 2D. Au total, 1,3 x 105 et 4,5 x 105 cellules sont nécessaires pour un insert de support perméable à 24 puits et un insert de support perméable à 12 puits, respectivement.
- Après la croissance des organoïdes pulmonaires 3D dans le milieu d’expansion pendant 2 semaines, digérez les organoïdes en cellules simples et ensemencez dans les inserts de 24 puits et 12 puits pour générer des organoïdes des voies respiratoires 2D.
- Pré-incuber les inserts avec le milieu basal pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire. Ajouter 250 μL et 500 μL de milieu basal dans la chambre supérieure et inférieure d’une plaque de 24 puits, respectivement. Pour une plaque de 12 puits, ajouter 500 μL et 1 000 μL de milieu basal dans la chambre supérieure et inférieure, respectivement.
- Prélever des organoïdes pulmonaires 3D comme décrit à l’étape 2.2.1. Remettre en suspension les organoïdes avec 1 mL d’enzyme de dissociation et incuber dans un bain-marie à 37 °C pendant 3-5 min.
- Ajouter 1 mL de milieu basal au tube. Pipet de haut en bas pour cisailler les organoïdes en cellules individuelles avec un pipet Pasteur et vérifier les cellules au microscope. Ensuite, ajoutez 40 μL de FBS pour mettre fin à la digestion.
- Filtrer les cellules à travers une passoire de 40 μm dans un tube de centrifugeuse de 50 mL. Transférer la suspension de la cellule filtrée dans un tube de 15 mL. Compléter avec le milieu basal jusqu’à un volume total de 10 mL, suivi d’une centrifugation à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
- Remettre en suspension la pastille, recueillie à partir de 24 gouttelettes (40 μL), dans 1 à 2,5 mL de milieu d’expansion organoïde pulmonaire en fonction de la densité cellulaire dans les gouttelettes. Comptez le nombre de cellules avec un compteur de cellules au microscope. Ajuster la concentration de la cellule à 1,3 x 106/mL (pour les inserts à 24 puits) ou 9 x 105/mL (pour les inserts à 12 puits).
- Retirez le milieu basal des chambres supérieure et inférieure. Ajouter 500 μL et 1 000 μL de milieu d’expansion dans la chambre inférieure de l’insert à 24 puits et de l’insert à 12 puits, respectivement. Ensemencement de 100 μL et 500 μL de suspension cellulaire préparés à l’étape 3.3.7 sur la chambre apicale de l’insert à 24 puits et de l’insert à 12 puits, respectivement.
- Incuber dans un incubateur de culture cellulaire pendant 2 jours. Remplacez le milieu d’expansion par le milieu dans la chambre apicale et inférieure des plaques. Incuber les organoïdes dans un incubateur de culture cellulaire pendant 14 jours et rafraîchir le milieu tous les 3 jours.
REMARQUE: Les cils mobiles sont discernables dans les organoïdes 3D et 2D au microscope à partir du jour 7 après l’incubation dans le milieu. Après 14 jours de culture de différenciation dans le milieu, les organoïdes des voies respiratoires sont matures pour diverses manipulations expérimentales. - Mesurer la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) tous les deux jours à l’aide d’un système de mesure de la résistance électrique selon un protocole standard décrit aupoint 17.
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Representative Results
Ce protocole permet la dérivation d’organoïdes pulmonaires humains avec un taux de réussite élevé. Le tissu pulmonaire humain frais est haché en petits morceaux, puis décomposé avec de la collagénase. Les cellules uniques résultantes sont incorporées dans la matrice du sous-sol et incubées dans le milieu d’expansion organoïde pulmonaire complété par un cocktail de facteurs de niche pour l’excroissance des cellules souches épithéliales (étape 1.1.2). La figure 1 montre la microphotographie de cellules pulmonaires fraîchement isolées incorporées dans la matrice membranaire basale à facteur de croissance réduit de type 2 (BME; Figure 1A, à gauche). Les organoïdes kystiques apparaissent et s’agrandissent avec le temps (Figure 1A, à droite). Pendant ce temps, les cellules non apparentées subissent la mort cellulaire progressivement. Les fibroblastes sont présents dans la culture lors des premier ou deuxième passages. Par la suite, la culture contient exclusivement des organoïdes épithéliaux, qui sont des organoïdes pulmonaires dérivés de cellules souches épithéliales présentes dans les tissus pulmonaires primaires. Ces organoïdes pulmonaires sont passés toutes les 2-3 semaines par cisaillement mécanique dans un rapport de 1:3 à 1:5 ou par trypsinisation dans un rapport de 1:5 à 1:10 (étapes 2.2-2.3). Les microphotographies représentatives des organoïdes pulmonaires après le quatrième passage sont montrées à la figure 1B. Après cisaillement mécanique, les fragments organoïdes incorporés dans le BME forment des domaines kystiques en quelques heures (Figure 1B, à gauche). Une microphotographie du même champ le jour 5 (Figure 1B, à droite) montre des organoïdes en croissance au fil du temps. Ces organoïdes pulmonaires humains en expansion hébergent les quatre principaux types de cellules épithéliales des voies respiratoires, y compris les cellules ciliées ACCTUB+ ou FOXJ1+, les cellules basales P63+, les cellules club CC10+ et les cellules gobelet MUC5AC+18 (Figure 1C), dans un état prématuré. Notamment, ces organoïdes pulmonaires humains peuvent être passés consécutivement et de manière stable pendant plus de 1 an. Lorsqu’ils sont maintenus dans la matrice du sous-sol, les organoïdes pulmonaires sont les plus susceptibles de montrer une polarité apicale, moins de 2% à 3% des organoïdes pulmonaires montrent une polarité apicale13. En conséquence, les sommets cellulaires ne sont pas facilement accessibles à moins que les organoïdes 3D ne soient cisaillés.
Cependant, par rapport à l’épithélium natif des voies respiratoires humaines, ces organoïdes pulmonaires extensibles à long terme ne sont pas suffisamment matures puisque la population cellulaire dominante dans l’épithélium des voies respiratoires humaines natives, la cellule ciliée, est sous-représentée dans l’organoïde pulmonaire. Nous avons ensuite défini un milieu de différenciation proximale (MP) pour améliorer l’état de maturation des organoïdes pulmonaires humains. Les organoïdes incubés dans le milieu d’expansion et le milieu ont développé une morphologie distincte au fil du temps (Figure 2A). Les cils mobiles étaient plus abondants dans les organoïdes du milieu que ceux du milieu d’expansion. Après 2 semaines de culture de différenciation dans le milieu, des cils mobiles sont discernables dans chaque organoïde (Figure 2B et vidéo supplémentaire 1). Fait intéressant, les cils battants entraînent les débris cellulaires et la mucine excrétée à l’intérieur de la lumière organoïde pour tourbillonner unidirectionnellement, ce qui récapitule adéquatement l’escalier mécanique mucociliaire pour éliminer les particules inhalées (vidéo supplémentaire 1), un important mécanisme d’auto-nettoyage des voies respiratoires humaines. Nous démontrons que les cellules ciliées ont augmenté de façon spectaculaire pour atteindre environ 50% dans les organoïdes différenciés par rapport aux organoïdes pulmonaires d’origine. Pour évaluer les pourcentages de quatre types de cellules épithéliales, les organoïdes des voies respiratoires 2D ont été analysés par cytométrie en flux. Brièvement, les organoïdes ont été dissociés avec 10 mM d’EDTA pendant 60 min à 37 °C, fixés avec 4 % de PFA et perméabilisés avec 0,1 % de tensioactif. Par la suite, les cellules ont été incubées avec des anticorps primaires (voir Tableau des matériaux) pendant 1 h à 4 °C suivies d’une coloration avec des anticorps secondaires. Un système FACS a été utilisé pour analyser les échantillons. L’analyse par cytométrie en flux a démontré que les organoïdes différenciés accueillent quatre types de cellules épithéliales des voies respiratoires (figure 2C). Par conséquent, nous avons développé un protocole de différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires qui peuvent simuler fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines à un niveau quasi physiologique.
Pour permettre à la surface apicale organoïde d’être facilement accessible et de mieux modéliser l’exposition de l’épithélium des voies respiratoires humaines aux agents pathogènes respiratoires, nous avons généré des monocouches 2D d’organoïdes des voies respiratoires. Après 2 semaines de culture de différenciation, les organoïdes des voies respiratoires 2D ont développé une barrière épithéliale intacte (Figure 3A,B). Nous avons également effectué un test de blocage de dextran pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale formée dans les organoïdes des voies respiratoires 2D. Le jour 10 après la culture dans des inserts transwell, l’isothiocyanate-dextran de fluorescéine (MW 10 000) a été ajoutée dans le milieu de la chambre supérieure et incubée à 37 °C pendant 4 h. Les milieux dans les chambres supérieure et inférieure ont été récoltés pour un essai de fluorescence. L’indice de blocage de dextran fait référence à l’intensité de fluorescence du milieu dans la chambre supérieure par rapport à celle de la chambre inférieure (Figure 3B). Ces organoïdes 2D des voies respiratoires contiennent également des cellules ciliées abondantes (Figure 3C). Les cellules ciliées ont été marquées par un anticorps anti-β-tubuline IV (ACCTUB) et un anticorps secondaire anti-souris 488 de chèvre. Les images confocales ont été acquises à l’aide d’un microscope confocal. Des images multicanaux ont été acquises à l’aide des lasers 405 nm pour DAPI, 488 nm pour ACCTUB et 633/640 nm pour Phalloidin. Les paramètres d’imagerie ont été ajustés conformément au manuel d’utilisation du microscope confocal. En bref, la taille du sténopé a été réglée sur 1 UA, le gain principal a été réglé sur 650 V à 750 V avec un gain numérique de 1,0 et la puissance laser a été ajustée pour chaque canal dans la plage de 0,2% à 5%. Le traitement de l’image a été effectué à l’aide du logiciel d’analyse fourni.
Les voies respiratoires humaines sont tapissées de deux types distincts d’épithéliums, c’est-à-dire l’épithélium des voies respiratoires et l’épithélium alvéolaire. Le premier tapisse les voies respiratoires de la cavité nasale à la bronchiole terminale et se compose de quatre principaux types de cellules épithéliales, à savoir les cellules ciliées, les cellules gobelets, les cellules club et les cellules basales. De plus, l’épithélium des voies respiratoires qui tapisse les voies respiratoires proximales et distales présente une composition cellulaire variable le long de l’axe proximal-distal. L’épithélium proximal des voies respiratoires est pseudostratifié, composé de cellules ciliées abondantes et de cellules de gobelet sécrétant du mucus; alors que l’épithélium distal des voies respiratoires est une seule couche de cellules cuboïdes ciliées et en massue avec moins de cellules basales et gobelet19. Les tissus pulmonaires humains utilisés pour dériver les organoïdes pulmonaires ont été obtenus auprès de patients qui ont subi des résections chirurgicales en raison de diverses maladies. Nous utilisons des tissus pulmonaires normaux adjacents aux tissus malades pour la culture organoïde. Ces tissus pulmonaires contiennent généralement des bronchioles de taille variable entourées de sacs alvéolaires. Au cours de la culture initiale, les cellules souches épithéliales des voies respiratoires ou les cellules progénitrices des voies respiratoires dans les tissus pulmonaires survivent et prolifèrent en raison des facteurs de niche dans le milieu d’expansion. Le milieu d’expansion permet la dérivation initiale et l’expansion à long terme des organoïdes pulmonaires en dirigeant les organoïdes vers un état immature, tandis que le protocole de différenciation des voies respiratoires génère des organoïdes des voies respiratoires phénocopiquant l’épithélium natif morphologiquement et fonctionnellement. Le système modèle, y compris la dérivation, l’expansion et la différenciation des organoïdes pulmonaires, est décrit à la figure 4. La composition cellulaire de l’épithélium proximal et distal des voies respiratoires est également illustrée à la figure 4.
Figure 1 : Dérivation, expansion et caractérisation des organoïdes pulmonaires humains. (A) Une microphotographie représentative montre des cellules individuelles incorporées dans la matrice du sous-sol après isolement des tissus pulmonaires le jour 0 (à gauche). Le jour 5, les organoïdes kystiques se développent (à droite). La barre d’échelle est de 0,5 mm. (B) Une microphotographie représentative des organoïdes pulmonaires le jour du quatrième passage et le jour 5 après le passage. La barre d’échelle est de 0,5 mm. P1 et P4 représentent les premier et quatrième passages. Les images ont été prises à un grossissement de 10x. (C) Images confocales de quatre types de cellules épithéliales des voies respiratoires dans des organoïdes pulmonaires humains. Quatre lignées de cellules épithéliales des voies respiratoires sont présentes dans les organoïdes pulmonaires, y compris les cellules ciliées ACCUB+ et FOXJ1+, les cellules basales P63+, les cellules club CC10+ et les cellules gobelets MUC5AC+. Les noyaux et les filaments d’actine cellulaires sont contre-colorés avec du DAPI (bleu) et de la Phalloidine-647 (violet), respectivement. La barre d’échelle est de 10 μm. Ce chiffre a été adopté à partir de13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Différenciation proximale des organoïdes pulmonaires humains. (A) Les organoïdes pulmonaires humains ont été cultivés dans le milieu ou le milieu exp dilatateur (Exp) en parallèle pendant 16 jours. Des microphotographies en champ lumineux d’organoïdes aux jours indiqués sont montrées. La barre d’échelle est de 0,4 mm. (B) Les cils dans les organoïdes différenciés des voies respiratoires sont représentés (flèche noire). La barre d’échelle est de 20 μm. (C) Les pourcentages de types cellulaires individuels dans les organoïdes incubés dans le milieu (en haut) et le milieu d’expansion (en bas) tels que détectés par l’analyse FACS. Les histogrammes représentatifs d’une ligne organoïde sont montrés. L’expérience a été réalisée dans trois lignées organoïdes différentes. Ce chiffre a été adopté à partir de13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Génération d’organoïdes des voies respiratoires différenciés en 2D. (A) La résistance électronique trans-épithéliale (TEER) a été mesurée au jour indiqué après l’incubation dans le milieu. Les données montrent ±'écart-type moyen (ET) des monocouches 2D dans 10 inserts. (B) Le jour 10 après la culture dans des plaques de support perméables, de l’isothiocyanate-dextran de fluorescéine a été ajoutée et les milieux dans les chambres supérieure et inférieure ont été récoltés pour un essai de fluorescence après 4 h. L’indice de blocage de dextran fait référence à l’intensité de fluorescence du milieu dans la chambre supérieure par rapport à celle de la chambre inférieure. Le diamètre des inserts de support perméables utilisés dans notre expérience est de 0,4 μm. Sans ensemencement de cellules, le dextran peut pénétrer librement dans les inserts 2D normaux. Ainsi, l’indice de blocage dextran d’une 2D normale (la barre étiquetée avec Blank) devrait être de 1. Les données représentent la moyenne ± SD de 10 inserts ensemencés avec des organoïdes des voies respiratoires 2D (organoïde 2D) et ceux en deux inserts vierges (blanc). (C) Images confocales de cellules ciliées ACCTUB+ abondantes (vert) dans des organoïdes des voies respiratoires 2D. Les filaments d’actine cellulaires sont contre-colorés avec de la phalloïdine-647 (violet). La barre d’échelle est de 20 μm. Ce chiffre a été adopté à partir de13. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Illustration schématique de la dérivation, de l’expansion et de la différenciation des organoïdes pulmonaires humains. Des cellules individuelles isolées à partir de tissus pulmonaires humains sont directement incorporées dans la matrice du sous-sol et incubées dans le milieu d’expansion organoïde pulmonaire. Les organoïdes pulmonaires humains dérivés peuvent être étendus à long terme avec une grande stabilité et facilement récupérés à partir de stocks cryoconservés. Lors de la différenciation, les organoïdes des voies respiratoires générés peuvent simuler fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines. Des organoïdes des voies respiratoires 2D et 3D ont été développés pour diverses manipulations expérimentales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo supplémentaire 1. Les cils battant de manière synchrone entraînent les débris cellulaires à tourbillonner unidirectionnellement dans les organoïdes différenciés des voies respiratoires13. Cette vidéo a été adoptée à partir de13. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Les voies respiratoires humaines sont tapissées de l’épithélium des voies respiratoires, également connu sous le nom d’épithélium cilié pseudostratifié. Les principaux types de cellules de l’épithélium des voies respiratoires supérieures sont les cellules ciliées qui permettent le mouvement coordonné de leurs cils apicals pour expulser le mucus et les particules inhalées des voies respiratoires, les cellules gobelet qui produisent et sécrètent du mucus et les cellules basales qui tapissent la membrane basale et sont impliquées dans la régénération. Dans les petites voies respiratoires telles que les bronchioles, l’épithélium cuboïdal des voies respiratoires contient des cellules club sécrétoires et moins de cellules ciliées que dans les régions supérieures des voies respiratoires. Nous décrivons un protocole robuste pour dériver les organoïdes pulmonaires humains des cellules souches épithéliales dans les tissus pulmonaires humains. Ces organoïdes pulmonaires humains sont maintenus dans le milieu d’expansion et traversés consécutivement pendant plus de 1 an avec une grande stabilité. Les principaux facteurs de croissance dans le milieu d’expansion comprennent R-spondin, un agoniste Wnt20; et Noggin, qui est un inhibiteur de la signalisation BMP21, ainsi que FGF7 et FGF10. Des études antérieures ont révélé un rôle crucial de la signalisation Wnt, FGF et BMP dans l’homéostasie de l’épithélium respiratoire 22,23,24. Le milieu d’expansion permet la dérivation initiale et l’expansion à long terme des organoïdes pulmonaires en dirigeant les organoïdes vers un état immature. Nous développons en outre une méthode de différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D, qui s’adaptent à quatre principaux types de cellules des voies respiratoires et simulent l’épithélium des voies respiratoires humaines à un niveau quasi physiologique. Pendant toute la procédure, y compris la dérivation initiale, l’expansion à long terme et la différenciation proximale, ni purification cellulaire fastidieuse ni cellules nourricières et stromales ne sont nécessaires. Ainsi, nous établissons un modèle organoïde de l’épithélium des voies respiratoires humaines. Les deux phases de la culture, la culture d’expansion et la culture de différenciation, s’excluent mutuellement. Les organoïdes pulmonaires fournissent une source stable pour l’expansion à long terme, tandis que les organoïdes différenciés des voies respiratoires phénoccopyent fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines. Ces organoïdes se prêtent à diverses manipulations expérimentales, y compris l’imagerie, le séquençage de l’ARN, l’analyse par cytométrie en flux, l’édition génétique, etc.13,14,25,26,27.
Pour assurer une grande efficacité de la dérivation des organoïdes pulmonaires, le milieu d’expansion doit être reconstitué avec précision et minutie, ce qui est essentiel pour le taux d’établissement élevé permis par le protocole. Une limitation majeure de ce modèle organoïde est la composition épithéliale pure, le manque de cellules stromales et de cellules immunitaires présentes dans la muqueuse respiratoire humaine, ce qui peut entraîner une certaine déviation des organoïdes des voies respiratoires de l’épithélium natif. Ainsi, nous nous efforçons de générer la prochaine génération d’organoïdes respiratoires en incorporant des cellules immunitaires et d’autres composants biologiquement pertinents dans notre modèle organoïde actuel.
Les organoïdes des voies respiratoires que nous avons établis simulent fidèlement la composition et la fonctionnalité multicellulaires de l’épithélium respiratoire humain natif à un niveau quasi physiologique, ce qui est impossible dans toute lignée cellulaire homogène. Nos modèles organoïdes permettent aux scientifiques de reconstruire et d’étendre de manière stable l’épithélium natif des voies respiratoires humaines dans des plaques de culture. Ces organoïdes des voies respiratoires sont un outil universel pour étudier la biologie et la pathologie des voies respiratoires humaines. Les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires utilisées dans les laboratoires de recherche ne sont pas extensibles en raison de la capacité de réplication limitée et ne servent guère d’outil de recherche reproductible et facilement accessible.
Les organoïdes, y compris les organoïdes respiratoires humains, ont révélé leur caractère unique et leur force pour l’étude des agents pathogènes humains, y compris le SARS-CoV-2 28,29,30,31,32,33,34. En tant qu’outil universel et physiologiquement actif, les organoïdes pulmonaires humains peuvent être largement utilisés pour explorer la biologie et la pathologie des voies respiratoires humaines.
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Disclosures
J. Z., C.L. et M.C.C. sont répertoriés comme inventeurs sur le brevet des organoïdes des voies respiratoires (numéro de publication: US-2021-0207081-A1). Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Acknowledgments
Nous remercions le Centre des sciences panoromiques et de l’unité de microscope électronique, Faculté de médecine Li Ka Shing, Université de Hong Kong, pour son aide en imagerie confocale et en cytométrie en flux. Ce travail a été en partie soutenu par le financement du Fonds de recherche médicale et de santé (HMRF, 17161272 et 19180392) du Bureau de l’alimentation et de la santé; Fonds général de recherche (GRF, 17105420) du Conseil des subventions de recherche; et Health@InnoHK, Commission de l’innovation et de la technologie, le gouvernement de la Région administrative spéciale de Hong Kong.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | - |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | - | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | - | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
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