이 프로토콜은 마우스 모델 시스템에서 그람 음성 단세균 패혈증의 유도를 기술한다. 상기 모델은 패혈증 동안 염증성 및 치명적인 숙주 반응을 조사하는데 유용하다.
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이 논문에서
요약
초록
패혈증은 미생물 침윤 또는 조직 손상에 대한 조절이 어려운 숙주 면역 반응으로, 감염 또는 손상으로부터 멀리 떨어진 부위에서 장기 손상을 유발한다. 현재, 패혈증의 널리 사용되는 마우스 모델은 리포폴리사카라이드 (LPS)-유도된 내독소혈증, 맹장 결찰 및 천자 (CLP), 및 단세균 감염 모델 시스템을 포함한다. 이 프로토콜은 마우스에서 살모넬라 티피뮤리움 감염-유도된 패혈성 복막염 동안 숙주 반응을 연구하는 방법을 기술한다. S. 그람 음성 세포 내 병원균 인 티피뮤리움은 생쥐에서 장티푸스와 같은 질병을 일으 킵니다.
이 프로토콜은 배양 준비, 복강 내 주사를 통한 마우스의 패혈성 복막염 유도 및 전신 숙주 반응을 연구하는 방법을 정교하게 설명합니다. 또한, 상이한 기관에서의 박테리아 부담의 평가 및 복막 세척에서 증가된 호중구 수의 유세포 분석이 제시된다. 살모넬라 균 마우스에서 티피뮤리움-유도된 패혈증은 전염증성 사이토카인의 증가와 복강 내의 호중구의 빠른 침윤을 유도하여, 생존율을 낮춘다.
이 프로토콜의 모든 단계가 최적화되어 패혈성 복막염의 발병기전을 재현 할 수 있습니다. 이 모델은 세균성 패혈증 동안 면역학적 반응, 질병 진행에서 상이한 유전자의 역할, 및 패혈증을 약화시키는 약물의 효과를 연구하는데 유용하다.
서론
패혈증은 미생물 침윤 또는 조직 손상에 대한 조절되지 않는 전신성 염증 및 면역 반응으로 정의되며, 감염 또는 손상 부위로부터 멀리 떨어진 장기 손상을 초래한다. 패혈성 쇼크는 부피 소생술 동안 지속되는 저혈압을 특징으로 하는 패혈증의 하위 집합으로, 사망 위험이 실질적으로 증가한다1. 일반 대중은 COVID-19 전염병 동안이 장애를 더 잘 알게되었습니다. 높은 관련 사망률에도 불구하고, 패혈증의 세계적 부담에 대한 포괄적 인 역학 데이터는 진단의 복잡성 때문에 부족합니다. 2017 년에는 전 세계적으로 48.9 백만 패혈증 발생률과 11 백만 명의 사망자가 있었으며 전 세계 사망자2의 19.7 %를 차지했습니다. 또한, 중환자실 환자에서 감염 및 관련 패혈증의 연장 유병률에 관한 연구에 따르면 환자로부터의 양성 격리물의 62%가 그람 음성 유기체3이었다.
처음에는 패혈증에 대한 조사가 미생물 병인을 묘사하는 데 중점을 두었습니다. 그러나 숙주가 자신과 비 자아를 구별하는 방법을 지시하는 "위험 가설"을 이해하면 침입하는 병원체에 대한 숙주 반응을 이해하는 방향으로 패혈증 연구의 균형이 기울어졌습니다. 패혈증의 널....
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프로토콜
살모넬라 티피뮤리움을 이용한 모든 실험은 바이오 안전 레벨 2(BSL-2) 시설에서 수행되었다. 적절한 개인 보호 장비 (PPE)를 사용하고 안전을 보장하며 표준 BSL-2 생물학적 위험 처리 방법을 따르기 위해주의를 기울여야합니다. 모든 마우스 실험은 IISc, Institutional Animal Ethics Committee에 의해 명시된 지침에 따라 수행되었다. 마우스는 인도 정부의 환경 및 산림부의 승인을 받은 IISc의 중앙 동물 시설(등록 번호: 48/1999/CPCSEA, 1999년 1월 3일자)에서 사육되고 유지되었다. 실험 프로토콜은 승인 된 허가 번호 CAF / Ethics / 797 / 2020으로 동물 실험의 목적 및 통제 및 감독위원회에 의해 승인되었습니다.
BSL2 정의 : BSL2 등급은 생물 유해 물질이 환경 및 실험실 직원에게 중간 정도의 위협을 제기한다는 것을 나타냅니다5.
1. 살모넬라 티피뮤리움의 문화 준비
- 살모넬라 티피뮤리움 NCTC 12023 글리세롤 스톡 100 μL를 루리아 베르타니(LB) 국물 ....
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결과
이러한 특정 모델을 이용한 숙주 면역 반응의 상세한 특성화는 이전 간행물 8,9에 제시되어 있다. 설명된 프로토콜의 몇 가지 대표적인 결과가 이 섹션에 설명되어 있습니다. 이 모델은 S의 전신 감염을 유도하는 것을 목표로 한다. 티피뮤륨은 박테리아 배양물을 복강내 주사하여 패혈증을 유도한다. 감염을 확인하기 위해, 패혈성 마우스로부터의 간 및 비장의 용해물을 SS 한천 플레이트에 퍼뜨렸고, 콜로니의 수를 계수하였다. 도 1에서, SS 한천 플레이트의 이미지는 패혈성 마우스의 간 및 비장에서의 장기 CFU 부담을 나타낸다. 균질화된 기관 용해물을 1 × 10-1의 희석액으로 확산시키고, 37°C에서 인큐베이션하였다. 블랙 색소 S. 티피뮤리움 콜로니는 37°C에서 ∼12시간 배양 후에 나타났다. 더욱이, 마우스의 감염.......
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토론
이 글은 살모넬라 티피뮤리움의 복강내 주사에 의해 심각한 형태의 세균성 패혈증을 유도하는 방법을 설명한다. 이 모델은 살모넬라 티피뮤리움이 세포내 병원체이고, 따라서, 병원성이 높고, 그람 음성 패혈증의 임상적으로 관련된 상태를 모방하기 때문에 다른 모델보다 유리하다. 이 모델에서 복막염 패혈증의 결과는 전신적이며, 감염 후 96 시간 이내에 100 % 사망률이 있습니다. 따라서, 이 모델은 패혈증을 감쇠시키는 데 있어서 염증성 및 치명적인 숙주 반응8 및 치료적 개입의 효과를 연구하는데 중요한 역할을 한다.
이 모델 시스템에서, 복강의 세포 조성은 접종된 병원체와 싸우기 위해 극적으로 변화한다. 많은 수의 LY6G + 호중구가 복강에 침투하여 F4 / 80 + 대식세포가 동시에 감소하여 대식세포 소멸 반응 (MDR)8,10
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
우리는 연구를 위해 생쥐를 공급해 주신 중앙 동물 시설, IISc에 감사드립니다. 이 연구는 인도 정부의 생명 공학 및 과학 및 공학 연구위원회에서 DpN에 대한 보조금으로 자금을 지원했습니다. DBT-IISc 프로그램 및 DST-FIST 보조금의 인프라 지원은 크게 인정됩니다. DpN 연구소의 이전 및 현재 구성원 모두에게 도움을 주셔서 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 소모품 | |||
| 1 mL 멸균 주사기(26G 바늘 포함 | ) Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | Tarsons, 미국 | 500010 | |
| 10 mL 멸균 주사기(21 G 바늘 포함 | ) Beckton Dickinson, 스페인 | 307758 | |
| 50 mL 원추형 플라스크 | Tarsons, 미국 | 441150 | |
| 50 mL 눈금 원심분리기 튜브 | Tarsons, 미국 | 546041 | |
| 50 mL 눈금 원심분리기 | 튜브 Tarsons, 미국 | 546021 | |
| 세포 스프레더 | VWR, 미국 | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 | HiMedia, 뭄바이, 인도 | TS1006 | |
| 에탄올 | 머크 | 100983 | |
| FcR 차단제 | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC 쥐 안티 마우스 Ly6G (클론 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| 글리세롤 | 시그마 - 알드리치 | G9012 | |
| 수작업 기반 균질화기 | - | - | |
| 혈구계(Neubauer 계수실) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| 파라포름알데히드 | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, 미국 | 460091 | |
| RPMI | Himedia, 뭄바이, 인도 | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, 뭄바이, 인도 | M108 | |
| 아지드화 나트륨 | 시그마-알드리치 | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| 유세포 분석기 | BD FACSverse | ||
| 인큐베이터 | N-biotek | ||
| 분광 광도계 | Shimadzu | ||
| 계량 기계 | Sartorius |
참고문헌
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. ....
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