מחקר זה מציג שיטה לניתוח גליקומיקה של גליקופרוטאינים על ידי שילוב של עיכול פרונאז E, פרמתילציה וניתוח ספקטרומטריית מסה. שיטה זו מסוגלת לנתח את כל סוגי הגליקנים המקושרים ל- N, כולל N-גליקנים חיידקיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מחקר זה מציג שיטה לניתוח גליקומיקה של גליקופרוטאינים על ידי שילוב של עיכול פרונאז E, פרמתילציה וניתוח ספקטרומטריית מסה. שיטה זו מסוגלת לנתח את כל סוגי הגליקנים המקושרים ל- N, כולל N-גליקנים חיידקיים.
גליקוזילציה של חלבון היא אחד השינויים הנפוצים והמורכבים ביותר לאחר תרגום. פותחו טכניקות רבות לאפיון התפקידים הספציפיים של גליקנים, הקשר בין המבנים שלהם והשפעתם על תפקודי החלבונים. שיטה נפוצה לניתוח גליקנים היא שימוש במחשוף אקסוגליקוזידאז כדי לשחרר גליקנים המקושרים ל-N מגליקופרוטאינים או גליקופפטידים באמצעות פפטיד-N-גליקוזידאז F (PNGase F). עם זאת, הקשרים בין גליקן לחלבון בחיידקים שונים ואין אנזים זמין לשחרור גליקנים מגליקופרוטאינים חיידקיים. בנוסף, גליקנים חופשיים תוארו גם בתאי יונקים, חיידקים, שמרים, צמחים ודגים. במאמר זה, אנו מציגים שיטה שיכולה לאפיין את מערכת הגליקוזילציה המקושרת ל-N בקמפילובקטר ג'ג'וני על ידי זיהוי גליקנים מקושרים לאספרגין (Asn) וגליקנים חופשיים שאינם מחוברים לחלבוני המטרה שלהם. בשיטה זו, סך החלבונים מ-C. jejuni עוכלו על ידי Pronase E עם יחס אנזים לחלבון גבוה יותר (2:1-3:1) וזמן דגירה ארוך יותר (48-72 שעות). לאחר מכן טוהרו ה-Asn-גליקנים והגליקנים החופשיים שהתקבלו באמצעות מחסניות פחמן גרפיטיות נקבוביות, פרמתילציה ונותחו על ידי ספקטרומטריית מסה.
חלבון N-גליקוזילציה הוא אחד השינויים הנפוצים והמורכבים ביותר לאחר תרגום באיקריוטים1. N-גליקנים ממלאים תפקיד חיוני בקיפול חלבונים ויש להם גם השפעה על מיון חלבונים בתעבורה ביוסינתטית2. ספקטרומטריית מסה נמצאת בשימוש נרחב בניתוח גליקנים המשתחררים על ידי מחשוף אקסוגליקוזידאז (גליקומיקס). הפפטידים הנותרים נטולי גליקוזיל (גליקופרוטומיקה) שימשו בדרך כלל לזיהוי רצפי הפפטידים הגליקוזיליים באיקריוטים3. הזיהוי של גליקנים המקושרים ל-N בקמפילובקטר ג'ג'וני הצביע על כך ש-N-glycosylation אינו מוגבל לאיקריוטים 4,5,6,7,8.....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
1. תרבית של C. jejuni 11168H ומיצוי סך החלבונים
הערה: C. jejuni 11168H הוא נגזרת משובטת היפרמוטלית של NCTC 1116812.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
השיטה המבוססת על השילוב של עיכול פרונאז E ופרמתילציה יושמה על ניתוח N-glycan מתמציות חלבון כוללות של C. jejuni 11168H. איור 1 מציג תרשים זרימה של הליך הניסוי. בעיכול טיפוסי, היחס בין אנזים לגליקופרוטאין נקבע בין 1:100 ל-1:20. כאן, היחס בין פרונאז E לחלבון הוגדל ל-2:1-3:1 ונעשה שימוש בעיכול ארוך יותר כדי להשיג עיכול פליטה על ידי דגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר מכן, ה-Asn-גליקנים מעיכול הפליטה טוהרו על ידי PGC ועברו פרמתילציה בגישת DMSO-NaOH שגרתית. ניתוח MALDI-MS של מעכלי .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
ישנם שני שלבים קריטיים בפרוטוקול ליישום אסטרטגיית גליקומיקה אוניברסלית זו. השלב הקריטי הראשון הוא השלמת עיכול הפליטה. שיטה זו תלויה מאוד בהשלמת עיכול Pronase E. לכן חיוני להשתמש בזמן עיכול ארוך וביחס אנזימים לחלבון גבוה. בדרך כלל, מומלץ להשתמש ביחס של 2:1-3:1 עבור פרונאז E/חלבון, וזמן דגירה של 48 שעות. הוכח כי עיכול פליטה מוצע זה ייצר את הגליקנים עם חומצת אמינו אחת כמרכיב העיקרי10. יש לטהר את המוצרים מעיכול הפליטה על ידי מחסנית PGC. הוא לא רק שמר על גליקנים אלא גם.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
המחברים מודים לקנת צ'אן, דיוויד ג'יי מקנלי, האראלד נוטהאפט, כריסטין מ. שימנסקי, ז'אן-רוברט בריסון ואלאונורה אלטמן על הסיוע והדיונים המועילים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2,5-חומצה דיהידרוקסיבנזואית (DHB), | סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) | 149357 | |
| 2-פרופנול | פישר סיינטיפיק (אוטווה, אונטריו, קנדה) | AA22906K7 | |
| 4000 Q-Trap | AB Sciex (קונקורד, קנדה) | ספקטרומטר מסה | |
| 4800 MALDI-TOF/TOF | Applied Biosystems (פוסטר סיטי, קליפורניה) | ספקטרומטר מסה | |
| אצטוניטריל ( ACN) | פישר סיינטיפיק (אוטווה, אונטריו, קנדה) | A996-4 | |
| עירוי לב מוח (BHI) מרק | סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) | 5121 | |
| C18 מחסניות ספטמבר-פאק | ווטרס (מילפורד, מסצ'וסטס | ||
| WAT036945 כלורופורם | סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) | CX1054 | |
| Difco | Fisher Science (אוטווה, אונטריו, קנדה) | DF0037-17-8 | Fisher Science |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) | 276855 | |
| צינור אפנדורף | בקוטר (מיסיסאוגה, אונטריו, קנדה) | SPE155-N | |
| קרחוני אצטי חומצה | סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) | A6283 | |
| מתנול | פישר סיינטיפיק, אוטווה, אונטריו, קנדה) | A544-4 | |
| מתיל יודיד | סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) | 289566 | |
| מחסנית PGC | תרמו מדעית (וולת'אם, מסצ'וסטס) | 60106-303 | פרונאז פחמן גרפיטי נקבובי |
| E | סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) | 7433-2 | |
| ערכת בדיקת חלבון | Bio-rad (מיסיסוגה, אונטריו, קנדה) | 5000001 | |
| רכז ואקום בקירור | Thermo Scientific (Waltham, MA) | SRF110P2-230 | |
| נתרן הידרוקסיד | סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) | 367176 | |
| מעבד אולטרסאונד סוניקטור | Mandel Scientific (גואלף, אונטריו, קנדה) | XL 2020 | |
| חומצה טריפלואצטית (TFA) | פישר סיינטיפיק (אוטווה, אונטריו, קנדה) | A11650 | |
| Tris-HCl | סיגמא-אולדריץ' (סנט לואיס, מיזורי) | T3253 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב