È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Questo studio presenta un metodo per l'analisi glicomica delle glicoproteine mediante una combinazione di digestione della pronasi E, permetilazione e analisi di spettrometria di massa. Questo metodo è in grado di analizzare tutti i tipi di glicani N-legati, compresi gli N-glicani batterici.
La glicosilazione delle proteine è una delle modificazioni post-traduzionali più comuni e complesse. Molte tecniche sono state sviluppate per caratterizzare i ruoli specifici dei glicani, la relazione tra le loro strutture e il loro impatto sulle funzioni delle proteine. Un metodo comune per l'analisi dei glicani consiste nell'impiegare la scissione dell'esoglicosidasi per rilasciare glicani legati all'N da glicoproteine o glicopeptidi utilizzando il peptide-N-glicosidasi F (PNGasi F). Tuttavia, i legami glicano-proteina nei batteri sono diversi e non è disponibile alcun enzima per rilasciare glicani dalle glicoproteine batteriche. Inoltre, i glicani liberi sono stati descritti anche in cellule di mammiferi, batteri, lieviti, piante e pesci. In questo articolo, presentiamo un metodo in grado di caratterizzare il sistema di glicosilazione N-linked in Campylobacter jejuni rilevando glicani liberi e legati all'asparagina (Asn) che non sono attaccati alle loro proteine bersaglio. In questo metodo, le proteine totali di C. jejuni sono state digerite dalla pronasi E con un rapporto enzima/proteine più elevato (2:1-3:1) e un tempo di incubazione più lungo (48-72 ore). Gli Asn-glicani e i glicani liberi risultanti sono stati quindi purificati utilizzando cartucce di carbonio grafitico poroso, permetilati e analizzati mediante spettrometria di massa.
La N-glicosilazione delle proteine è una delle modificazioni post-traduzionali più comuni e complesse negli eucarioti1. Gli N-glicani svolgono un ruolo essenziale nel ripiegamento delle proteine e hanno anche un impatto sulla selezione delle proteine nel traffico biosintetico2. La spettrometria di massa è stata ampiamente utilizzata nell'analisi dei glicani rilasciati dalla scissione delle esoglicosidasi (glicomicsi). I restanti peptidi deglicosilati (glicoproteomica) sono stati comunemente usati per identificare le sequenze di peptidi glicosilati negli eucarioti3....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
1. Coltura di C. jejuni 11168H ed estrazione delle proteine totali
NOTA: C. jejuni 11168H è un derivato clonale ipermobile di NCTC 1116812.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Il metodo basato sulla combinazione di digestione e permetilazione della pronasi E è stato applicato all'analisi degli N-glicani da estratti proteici totali di C. jejuni 11168H. La Figura 1 mostra un diagramma di flusso della procedura sperimentale. Nella digestione tipica, il rapporto tra enzima e glicoproteina è stato impostato tra 1:100 e 1:20. Qui, il rapporto tra pronasi E e proteine è stato aumentato a 2:1-3:1 e una digestione più lunga è stata impiegata per ottenere una diges.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ci sono due passaggi critici nel protocollo per l'attuazione di questa strategia di glicomica universale. Il primo passo critico è il completamento della digestione dei gas di scarico. Questo metodo dipende fortemente dal completamento della digestione della pronasi E. È quindi essenziale utilizzare un lungo tempo di digestione e un elevato rapporto enzimi/proteine. In genere, si suggerisce di utilizzare un rapporto di 2:1-3:1 per la pronasi E/proteina e un tempo di incubazione di 48 ore.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Gli autori non hanno conflitti di interesse.
Gli autori ringraziano Kenneth Chan, David J. McNally, Harald Nothaft, Christine M. Szymanski, Jean-Robert Brisson ed Eleonora Altman per l'assistenza e le utili discussioni.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB), | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 149357 | |
| 2-propanolo | Fisher Scientific ( Ottawa, Ontario, Canada) | AA22906K7 | |
| 4000 Q-Trap | AB Sciex (Concord, Canada) | Spettrometro di massa | |
| 4800 MALDI-TOF/TOF | Applied Biosystems (Foster City, CA) | Spettrometro di massa | |
| acetonitrile ( ACN) | Fisher Scientific ( Ottawa, Ontario, Canada) | A996-4 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) brodo | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 5121 | |
| C18 Cartucce Sep-Pak | Waters (Milford, MA). | ||
| cloroformio | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | CX1054 | |
| Difco | Fisher Science (Ottawa, Ontario, Canada) | DF0037-17-8 | Fisher Science |
| dimetil solfossido (DMSO) | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 276855 | |
| tubo Eppendorf | Diamed (Missisauga, Ontario, Canada) | SPE155-N | |
| acetico glaciale acido | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | A6283 | |
| metanolo | Fisher Scientific, Ottawa, Ontario, Canada) | A544-4 | |
| ioduro di metile | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 289566 | |
| cartuccia PGC | Thermo Scientific(Waltham,MA) | 60106-303 | Pronasi porosa grafitica |
| del carbonio E | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 7433-2 | |
| Kit per il dosaggio delle proteine | Bio-rad (Mississauga, Ontario, Canada) | 5000001 | |
| Concentratore sottovuoto refrigerato | Thermo Scientific(Waltham,MA) | SRF110P2-230 | |
| idrossido di sodio | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | 367176 | |
| Sonicatore Processore ad ultrasuoni | Mandel Scientific (Guelph, Ontario,Canada) | XL 2020 | |
| Acido trifluoacetico (TFA) | Fisher Scientific ( Ottawa, Ontario, Canada) | A11650 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | T3253 |
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Questo articolo è stato pubblicato
Video in arrivo