Rilevamento e quantificazione di nanotubi a effetto tunnel mediante immagini 3D Volume View

Deepak Kunhi Valappil; Abinaya Raghavan; Sangeeta Nath

doi:10.3791/63992

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Articolo metodologico

Rilevamento e quantificazione di nanotubi a effetto tunnel mediante immagini 3D Volume View

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DOI:

10.3791/63992

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31 agosto 2022

Deepak Kunhi Valappil^*¹ , Abinaya Raghavan^*¹ , Sangeeta Nath¹

¹Manipal Institute of Regenerative Medicine, Manipal Academy of Higher Education, India

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I nanotubi a effetto tunnel (TNT) sono principalmente nanotubi di membrana F-actina aperti che collegano le cellule vicine, facilitando la comunicazione intercellulare. La caratteristica notevole che distingue i TNT da altre protrusioni cellulari è la natura sospesa dei nanotubi tra le cellule. Qui, caratterizziamo i TNT costruendo una vista del volume 3D di immagini z-stack confocali.

Abstract

Recenti scoperte hanno rivelato che le cellule eseguono un trasferimento intercellulare diretto, a lungo raggio, tramite condotti su nanometria, membrana di actina, vale a dire "nanotubi tunneling" (TNT). I TNT sono definiti come estensioni di membrana a doppio strato lipidico aperte che mediano la continuità tra cellule vicine di diametro compreso tra 50 nm e 1 μm. I TNT sono stati dimostrati inizialmente nelle cellule neuronali, ma studi successivi hanno rivelato l'esistenza di TNT in diversi tipi di cellule e malattie, come malattie neurodegenerative, infezioni virali e cancro. Diversi studi hanno fatto riferimento a nanostrutture di membrana chiuse e accoppiate elettricamente tra cellule vicine come TNT o strutture simili al TNT.

La spiegazione dell'ultrastruttura in termini di continuità della membrana all'endpoint è tecnicamente impegnativa. Inoltre, gli studi sulla comunicazione cellula-cellula sono impegnativi in termini di caratterizzazione dei TNT utilizzando metodi convenzionali a causa della mancanza di marcatori specifici. I TNT sono principalmente definiti come protrusioni di membrana aperte a base di F-actina. Tuttavia, una delle principali limitazioni è che la F-actina è presente in tutti i tipi di protrusioni, rendendo difficile differenziare i TNT da altre protrusioni. Una delle caratteristiche notevoli dei TNT a base di F-actina è che queste strutture si librano tra due cellule senza toccare il substrato. Pertanto, TNT distinti colorati con F-actina possono essere convenientemente distinti da altre sporgenze come filopodi e neuriti in base al loro librarsi tra le cellule.

Abbiamo recentemente dimostrato che l'internalizzazione dell'amiloide-β oligomerica_1-42(oAβ) attraverso l'endocitosi actina-dipendente stimola la chinasi-1 attivata da p21 attivata (PAK1), che media la formazione di TNT contenenti F-actina coespressi con fosfo-PAK1 tra cellule neuronali SH-SY5Y. Questo protocollo delinea un metodo di analisi del volume 3D per identificare e caratterizzare i TNT dalle immagini z-stack catturate di protrusioni di membrana immunocolorate con F-actina e fosfo-PAK1 in cellule neuronali trattate con oAβ. Inoltre, i TNT si distinguono dallo sviluppo di neuriti e escrescenze neuronali basate su condotti di membrana con tubazione tubulinica F-actina e β-III.

Introduzione

I nanotubi a effetto tunnel (TNT) sono condotti di membrana basati su F-actina, principalmente aperti e svolgono un ruolo vitale nel trasferimento intercellulare di carichi e organelli¹. La caratteristica unica dei TNT è che collegano le cellule vicine senza alcun contatto con il substrato; Sono lunghi oltre 10-300 μm e i loro diametri variano tra 50 nm e 1 μm ^2,3. I TNT sono strutture transitorie e la loro durata dura da pochi minuti a diverse ore. I TNT sono stati dimostrati per la prima volta nelle cellule neuronali PC12¹; Successivamente, numerosi studi hanno....