Summary
암세포의 전이성 능력을 평가하기 위한 CAM-Delam 분석은 비교적 빠르고, 쉽고, 저렴하다. 이 방법은 전이 형성을 조절하는 분자 메커니즘을 풀고 약물 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 인간 종양 샘플을 분석하기 위한 최적화된 분석은 개인화된 암 치료를 위한 임상 방법이 될 수 있다.
Abstract
암 관련 사망의 주요 원인은 전이 형성 (즉, 암세포가 원발성 종양에서 먼 장기로 확산되어 이차 종양을 형성 할 때)입니다. 기저 라미나와 기저막의 분해로 정의 된 박리는 암세포의 다른 조직 및 기관으로의 전이 및 확산을 용이하게하는 초기 과정입니다. 암 세포의 박리 능력을 점수화하는 것은 이들 세포의 전이성 잠재력을 나타낼 것이다.
우리는 표준화 된 방법 인 ex ovo CAM-Delam 분석을 개발하여 암세포가 박리되고 침입하는 능력을 시각화하고 정량화하여 전이성 공격성을 평가할 수 있습니다. 간략하게, CAM-Delam 방법은 배아 10일째에 병아리 맥락알란토막(CAM) 상의 실리콘 고리에 암 세포를 시딩하고, 이어서 몇 시간에서 수일까지 배양하는 것을 포함한다. CAM-Delam 분석은 병아리 배아 인큐베이션 동안 내부 가습된 챔버의 사용을 포함한다. 이 새로운 접근법은 배아 생존율을 10 % -50 %에서 80 % -90 %로 증가시켜 다른 CAM 분석에서 낮은 배아 생존율에 대한 이전의 기술적 문제를 해결했습니다.
다음에, 연관된 암 세포 클러스터를 갖는 CAM 샘플을 단리하고, 고정시키고, 동결시켰다. 마지막으로, cryostat-sectioned 샘플을 시각화하고 면역조직화학을 사용하여 기저막 손상 및 암 세포 침윤에 대해 분석하였다. 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현하도록 설계된 다양한 알려진 전이성 및 비 전이성 암 세포주를 평가함으로써, CAM-Delam 정량 결과는 박리 능력 패턴이 전이성 공격성을 반영하고 네 가지 범주로 점수화 될 수 있음을 보여주었습니다. 전이성 공격성의 표시로서 박리 능력을 정량화하는 것 외에도이 분석의 향후 사용은 박리, 침윤, 미세 전이의 형성 및 종양 미세 환경의 변화를 제어하는 분자 메커니즘을 푸는 것입니다.
Introduction
암 환자의 사망률의 약 90 %는 암 전이의 결과에 의해 발생하며, 이는 암이 원래 시작된 곳에서 신체의 다른 부위에 이차 종양이 형성되는것입니다 1. 따라서, 종양 전이의 형성을 억제하기 위한 잠재적 표적을 찾기 위해 전이성 관련 메카니즘을 동정하는 것이 중요하다. 그 후, 전이성 과정을 평가할 수 있는 모델 시스템이 필요하다.
전이 동안, 암세포는 상피 세포가 부착성과 극성 특성을 잃고 대신 침습성 중간엽 문자2를 획득하는 정상적인 세포 과정 인 상피 대 중간엽 전이 (EMT)를 겪습니다. 박리는 EMT 과정의 일부이며 기저막에서 라미닌의 분해를 포함하며, 이는 암세포가 원발성 종양을 떠나 다른 조직을 침범하기위한 전제 조건입니다. 전이 형성 동안 상향조절되는 주요 인자는 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMPs), ADAM (디스인터진 및 메탈로프로테이나제), ADAMTS (트롬보스폰딘 모티프를 갖는 ADAM) 및 막형 MMP (MT-MMPs)3,4를 포함한다. 이러한 요인들은 모든 기저막에서 발현되는 라미닌과 같은 분자를 분해하여 세포 이동 및 침입을 촉진합니다.
수정 된 병아리 알의 chorioallantoic 막 (CAM)은 기저막의 일종입니다. 수정 된 병아리 난자는 전이성 모델로 사용되어 왔으며, 암세포는 배아 외 CAM에 시딩되고 병아리 배아에서 관찰 된 이후 전이 형성5. 더욱이, 생체 내 마우스 전이성 모델이 빈번하게 사용되며, 여기서 암세포는 마우스에 이식되고 다양한 장기의 전이가 분석된다6. 이 접근법은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 동물에게 불편 함을 줄 수 있습니다. 이를 해결하기 위해 우리는 암세포의 전이성 공격성을 평가하는 더 빠르고 저렴한 모델인 CAM-Delam assay를 개발했습니다. 이 모델에서, 병아리 CAM을 분해하는 암 세포의 능력 (예를 들어, 박리 능력)은 중간엽 내로의 잠재적 인 암 세포 침윤과 결합하여 전이성 공격성의 측정으로 사용된다.
이전 간행물7을 기반으로 한 본 기사는 수정 된 병아리 난자 처리, 암세포 배양 및 시딩, 해부 및 CAM 샘플의 분석에서부터 암세포의 박리 능력을 네 가지 범주로 채점하는 것까지 CAM-Delam 분석을 자세히 설명합니다 : 손상, 변경, 손상 및 침윤. 우리는 또한이 분석이 박리 과정을 조절하는 분자 메커니즘을 결정하는 데 어떻게 사용될 수 있는지에 대한 예를 제공합니다.
Protocol
간단히 말해서, 도 1은 CAM-Delam 분석에서의 전체 단계를 요약한 것이다. 아래 프로토콜은 30 개의 배양 된 수정 된 닭고기 달걀과 세 개의 고리 / 난자에 별도로 시딩되고 네 가지 시점에서 분석 된 두 개의 다른 암 세포주의 사용을 기반으로합니다.
1. 계란 부화
- 90 % 이상의 수정을 보장하는 지역 부화장에서 수정 된 병아리 알을 사용하십시오.
참고 : 계란은 실온 (RT)에서 4 일 이상 보관해서는 안됩니다. 스웨덴에서는 배아 닭의 실험적 사용에 대한 윤리적 허가가 배아 일 (E) 14 이상에서만 필요합니다. - 필요한 경우 마른 종이 타월을 사용하거나 물에 적신 계란의 먼지 나 깃털을 조심스럽게 기계적으로 닦아냅니다.
- 계란 인큐베이터를 사용하기 전에 (매번) 70 % 에탄올로 청소하고 멸균하십시오.
- 원하는 수의 알을 달걀 쟁반에 넣고 병아리 알을 70 % 습도의 37.5-38 °C의 달걀 인큐베이터에서 수평으로 배양하십시오. 이것을 잠복기 0일로 간주하십시오 (그림 1A).
2. 계량 보트, 플라스틱 상자 및 해부 장비 준비
- 70 % 에탄올을 사용하여 투명 캡으로 30 개의 계량 보트와 30 개의 작은 플라스틱 상자 (~ 0.4 L)를 살균하십시오.
- 계량 보트와 상자를 하룻밤 사이에 층상 후드(ON)에서 건조시키고 인큐베이션 3일에 추가로 사용할 때까지 닫힌 플라스틱 상자에 보관하십시오.
- 배양된 계란 30개당 2L의 증류 또는 탈이온화된H2O를 멸균한다.
- 70 % 에탄올을 분무하여 두 쌍의 가위와 세 쌍의 포셉을 살균하십시오. 기구를 공기 건조시킨 다음 잠복기 3 일까지 멸균 된 상자에 보관하십시오.
참고: 이러한 작업(단계 2.1-2.4)은 잠복기 3일 전날 언제든지 수행할 수 있습니다. 오염을 피하기 위해 장갑을 사용하십시오.
3. 계란을 열고 내부 가습실로 옮깁니다.
참고: 오염을 방지하기 위해 장갑과 얼굴 마스크를 사용하십시오.
- 약 50 mL의 멸균된H2O를 멸균된 플라스틱 박스에 첨가한다. 오염을 피하기 위해 물이 채워진 상자는 뚜껑을 닫은 채로 사용할 때까지 RT에 보관하십시오.
- 잠복기 3 일째에 가위의 날카로운 부분을 사용하여 달걀 껍질을 부수고 껍질에서 곧은 개구부를 자릅니다.
- 수동으로 계량 보트 위에 달걀 껍질을 열고 계량 보트에서 달걀 흰자위, 노른자 및 부착 된 건강한 배아를 수집합니다 (그림 1B). 심장이 뛰고, 노른자가 손상되지 않았으며, 실험을 위해 혈관이 발달 된 손상되지 않은 배아를 찾으십시오 (배양 된 난자의 >95 %). 기형 배아, 심장이 뛰지 않는 배아, 부러진 난황 또는 손상된 노른자 혈관이있는 난자를 버리십시오.
- 계량 보트를 내부 가습실로 부드럽게 옮깁니다.
참고: 단계 3.2.-3.4.의 경우 오염을 피하기 위해 가능한 한 빨리 작업하고 가능한 경우 층류 후드를 사용하십시오. - 계란 인큐베이터에서 내부 가습 챔버를 인큐베이션한다(그림 1C).
- 껍질이 없는 난자를 사용하기 전에 계란 배양기에서 3일째부터 10일째까지 배양하고(단계 3.6 참조), 필요할 때 배양기에 물을 첨가하여 70% 습도를 유지한다.
- 투명한 플라스틱 뚜껑을 통해 내부 가습 챔버에서 매일 죽은 배아 또는 오염 된 껍질이없는 난자가 있는지 확인하고 인큐베이터에서 제거하십시오.
4. 실리콘 고리의 제조
- 실리콘 링을 제조하려면 내경과 외경이 각각 4mm 및 5mm인 실리콘 튜브를 ∼1mm 두께로, 바람직하게는 종이 커터를 사용하여 절단한다(그림 1D).
- 실리콘 링을 작은 유리 병으로 옮기고(그림 1D), 금속 호일로 덮은 다음 오토클레이브 등을 사용하여 멸균합니다.
참고: 오염될 수 있는 사용하지 않는 실리콘 링의 반복적인 오토클레이빙은 피하십시오, 왜냐하면 그러한 처리는 실리콘 링이 멤브레인에 부착되는 용량을 감소시키고, 이후에 암 세포/콜라겐/RPMI 용액이 링 외부로 누출되기 때문입니다. - 멸균 실리콘 링을 RT에 보관하십시오.
참고: 이 단계는 잠복기 10일 하루 전에 언제든지 수행할 수 있습니다.
5. 암세포의 제조
참고: 세포 배양 배지, 트립신 및 1x PBS와 같은 용액은 4°C에서 저장되며 세포에 첨가하기 전에 수조에서 37°C로 가열해야 합니다. 가열 후 병을 70 % 에탄올로 헹구고 사용하기 전에 말리십시오.
- 관련 배지에 관심있는 암 세포주를 5% (v/v)CO2의 존재 하에 37°C의 세포 배양 배양기에서 배양한다.
참고: 여기에서, U251-GFP 교모세포종 및 PC-3U-GFP 전립선암 세포를 10%(v/v) 태아 소 혈청(FBS) 및 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(PS)이 보충된 완전한 RPMI 배지-RPMI 배지에서 배양하였다. - 약 50 × 10,6 개의 암세포가 CAM-Delam 분석의 배양 10일에 수확 준비가 되도록 암세포의 배양을 계획한다.
- 세포 배양 배지를 2-3 일마다 또는 배지 색상이 분홍색에서 주황색 / 노란색으로 바뀔 때 변경하십시오.
- 선택사항: 암세포를CoCl2 로 처리하여 저산소증을 유발하여 세포 수확 1일 전에 박리에 대한 분자 기계론적 효과를 조사한다.
주의:CoCl2 는 적당한 독성을 가지고 있습니다. 흄 후드에서주의 깊게 취급하고 제조업체의 지침을 따르십시오.- 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸인 15 mL 원뿔형 튜브에 멸균 증류H200 10 mL에 0.0258 g을 용해시켜 신선한 20 mM CoCl2원액을 준비한다.
- 50 mL 원뿔형 튜브에서, 직경 15 cm 당 1% (v/v) PS (FBS는 제외)로 보충된 RPMI 배지 25 mL에 20 mM CoCl2원액 250 μL를 섞는다. 부드럽게 소용돌이.
- 세포 배양 접시에서 완전한 RPMI 배지를 제거한다.
- 세포를 멸균된 1x PBS 2x로 세척한다.
- 200 μM CoCl2 세포 트립신화로 RPMI 배지25 mL를 첨가한다(단계 5.6 참조).
- 계란 배양 10일째에, 250 μL의 타입 I 콜라겐(5 mg/mL)과 10% FBS와 1%(v/v) PS로 보충된 750 μL의 세포 배양 RPMI 배지를 포함하는 콜라겐/RPMI 믹스 1 mL를 준비한다.
- 암세포를 트립신화하여 세포를 분리하여 먼저 세포 배양액을 제거하고 1x PBS로 2x 세척한다.
- 직경 15 cm 세포 배양 접시 당 트립신 용액 3 mL (0.05%)를 첨가하고, 세포가 분리될 때까지 세포 배양 배양기에서 2-3분 동안 인큐베이션한다. 테이블 상단의 거꾸로 된 현미경을 사용하여 분리 된 세포를 확인하십시오. 필요한 경우 플라스크의 측면을 부드럽게 탭하여 남아있는 클러스터 또는 부착 된 세포를 제거하십시오.
- 5 mL의 완전한 RPMI 배지를 각 세포 배양 접시에 첨가하여 트립신을 불활성화시키고 모든 세포 배양 접시에서 세포 현탁액을 50 mL 튜브로 수집한다.
- Trypan Blue 배제 방법에 의해 암세포를 계수하여 세포 카운터를 사용하여 죽은 세포와 살아있는 세포를 구별한다. 10 μL의 세포 현탁액을 0.4% 트리판 블루 염색의 10 μL에 첨가한다. 샘플을 몇 번 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음, 챔버 당 10 μL의 세포 혼합물을 세포 카운터의 샘플 슬라이드에 로딩한다. 셀 카운팅 3x를 반복하여 셀 번호/mL를 확인합니다.
- 계산하고 500 × g에서 50 mL 튜브에서 50 x 106 살아있는 암 세포를 함유하는 정확한 부피 세포 배양 현탁액을 5분 동안 원심분리한다.
- 상층액을 버리고 세포 펠릿을 콜라겐/RPMI 믹스 1mL와 섞는다. 콜라겐은 젤라틴 물질이므로 거품 형성시 세포가 손실되지 않도록 1mL 피펫으로 세포를 매우 천천히 조심스럽게 혼합하십시오.
- 준비된 세포 현탁액을 얼음 위에 보관하고 계란 작업 영역으로 가져 오십시오.
참고 : 준비된 암세포를 얼음 위에 너무 오래 보관하지 마십시오. 준비된 암세포는 15-25 분 이내에 CAM에 놓아야합니다.
6. CAM에 암세포 시딩
참고: 오염을 방지하기 위해 장갑과 얼굴 마스크를 사용하십시오.
- 인큐베이션 10 일째에, 인큐베이터에서 인큐베이터 껍질이없는 알과 함께 내부 가습 챔버를 꺼내십시오.
참고 : 배양 된 계란의 초기 수의 약 90 %가 사용될 수 있습니다. 그림 2를 참조하십시오. - 내부 가습 챔버를 열고 멸균 된 포셉을 사용하여 CAM에 최대 여섯 개의 실리콘 링을 놓습니다.
참고: 실리콘 링을 서로 가까이 두거나 더 큰 혈관에 가깝게 두지 마십시오. - 피펫팅에 의해 암 세포 현탁액을 혼합하여 암 세포의 균일한 분포를 얻고, 제조된 암 세포 현탁액 20 μL(1 × 10,6 세포)를 실리콘 링 내부에 첨가한다(도 1E). 세포를 추가 할 때 피펫 팁을 CAM 위에 두어 멤브레인이 손상되지 않도록하십시오.
참고 : 이전 연구 결과7에 따르면 다른 암세포는 동일한 CAM의 별도의 고리에 시드 될 수 있습니다. - 내부 가습 챔버를 닫고 계란 인큐베이터에 넣으십시오.
7. 연관된 암 세포와 CAM의 분리
- 14 시간, 1.5 일, 2.5 일 및 3.5 일의 배양 후 약 7 개의 내부 가습 챔버를 꺼내 한 번에 하나씩 뚜껑을 엽니 다.
- 한 쌍의 가위로 실리콘 링 외부를 절단하여 CAM에 부착된 배양된 암세포(소위 CAM-Delam 샘플)를 해부한다(그림 1F).
- 포셉을 사용하여 단리된 CAM-Delam 샘플을 즉시 조직의 고정을 위해 페트리 디쉬의 0.1 M 인산염 완충액 (PB) 중의 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 옮긴다. 얼음 위에 또는 4 °C에서 1 시간 동안 유지하십시오.
참고: 4% PFA 용액을 4°C에서 최대 5일 동안 보관하십시오. 주의: PFA는 독성이 있습니다. PFA 파우더 및 PFA 용액을 취급 할 때는 흄 후드를 사용하고 얼굴 마스크와 장갑을 착용하십시오. 분말 또는 용액 증기를 흡입하지 마십시오. 제조업체의 지침을 따릅니다. - 닭 배아를 무력화시키고 특정 쓰레기통에 생물학적 폐기물로 버리십시오.
- 4% PFA 용액을 제거하고 0.1 M PB 중의 30% 수크로오스를 CAM-Delam 샘플에 첨가하고, 4°C에서 1시간 동안 평형화시킨다.
- 해부 현미경으로 포셉을 사용하여 실리콘 링을 조심스럽게 제거하십시오. 한 쌍의 가위로 CAM-Delam 샘플을 중간에 암세포가 있는 직사각형 모양으로 자릅니다(그림 1G).
- 한 쌍의 포셉으로 CAM-Delam 샘플을 페트리 접시의 냉동 섹션 배지로 옮겨 과도한 자당을 제거한 다음 몰드를 냉동 섹션 배지에 임베딩합니다.
- 해부 현미경 하에서 CAM-Delam 샘플을 바늘 모양의 기기를 사용하여 임베딩 몰드에 수직 방향으로 U 자형으로 배치합니다(그림 1G).
- CAM-Delam 샘플을 동결시키고 -80°C에서 보관한다.
8. CAM-Delam 샘플 단면화
- 냉동된 CAM-Delam 샘플을 냉동 절법을 사용하여 5-6회 연속 슬라이드 상에서 10 μm로 절편한다.
- 절편이 있는 슬라이드를 -80°C에 보관하거나 면역조직화학 염색에 직접 사용하십시오.
9. 면역조직화학 염색
- 면역 프로토콜을 시작하기 전에 슬라이드를 -80 °C에서 RT로 5 분 동안 가져 오십시오.
- 섹션이 끝나는 슬라이드에 소수성 마커가있는 선을 만듭니다. 몇 분 동안 말리십시오.
- 슬라이드를 가습된(H2O) 챔버에 놓고, 절편을 ∼200-500 μL의 블로킹 용액(0.1% 트리톤 X-100[TBST]로 트리스 완충 식염수 중 10% 태아 송아지 혈청 및 0.1% 소듐 아지드)으로 덮고 15-30분 동안 인큐베이션한다.
참고: 이 단계부터 슬라이드가 건조되지 않도록 하십시오. - 블로킹 용액을 붓고 블로킹 용액에 희석된 목적하는 일차 항체 100-150 μL로 교체하고 4°C에서 ON으로 인큐베이션한다. 바람직하게는 GFP 또는 다른 형광 태깅된 암 세포주를 사용하지 않을 경우 암 세포 마커와 함께 기저 라미나를 정의하기 위해 토끼 항-라미닌-111 항체를 사용한다.
참고 : 여기에서 토끼 안티 폰 Willebrand Factor도 CAM의 혈관을 감지하는 데 사용되었습니다. - TBST 버퍼로 채워진 세 개의 유리 큐벳을 준비하십시오.
- 일차 항체 용액을 붓고, 슬라이드를 유리 큐벳으로 옮기고, TBST에서 각각 5분 동안 적어도 3x 세척한다.
- 슬라이드에서 과량의 TBST를 제거하고 연종이 조직으로 소수성 장벽 영역에서 제거하십시오.
- 슬라이드를 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 디히드로클로라이드 (DAPI)와 결합된 블로킹 용액에 희석된 적합한 2차 형광 항체의 100-150 μL로 표지하고 1시간 동안 RT에서 어둠 속에서 인큐베이션한다.
- 이차 항체 용액을 붓고, 슬라이드를 유리 큐벳으로 옮기고, TBST에서 각각 5분 동안 적어도 3x 세척한다.
- 슬라이드에서 과량의 TBST를 제거하고 연종이 조직으로 소수성 장벽 영역에서 제거하십시오.
- 슬라이드에 형광 장착 매체 1-2방울을 올려 슬라이드를 장착하고 유리 커버슬립을 부드럽게 올려 기포를 피합니다.
- 슬라이드를 분석하기 전에 4°C에서 적어도 1시간 동안 건조시키고, 슬라이드를 4°C로 보관한다.
10. 현미경 이미징 및 박리 점수 매기기
- 디지털 카메라가 장착된 에피형광 현미경을 사용하여, 바람직하게는 10x 배율로 단면을 촬영한다(도 1H).
- 다음 CAM-Delam 점수 매기기 범주를 사용하여 섹션을 분석합니다(그림 3).
- 눈에 보이는 변화없이 손상되지 않은 기본 라미나를 찾으십시오.
- 변경되었지만 손상되지 않은 기본 라미나를 찾으십시오.
- 세포 침범없이 손상된 기저 라미나를 찾으십시오.
- 세포 침범으로 손상된 기저 라미나를 찾으십시오.
Representative Results
도 1은 CAM-Delam 분석7의 주요 단계를 제시한다. 내부 가습 챔버(도 1C)의 사용은 병아리 배아의 생존율을 배양 10일에 <50%에서 최대 90%까지, 그리고 배양 13일째에 ~15%에서 최대 80%까지 유의하게 개선시켰다(도 2).
그림 1: CAM-Delam 분석의 주요 단계 . (A) 수정한 닭 알을 회전 없이 수평으로 배양합니다. (B,C) 인큐베이션 3 일째에, 알을 깨서 멸균 계량 보트 (B)에 넣고, 보트를 추가 인큐베이션 (C)을 위해 내부 가습 챔버에 위치시킨다. (D) 실리콘 링을 준비한다. (e) 인큐베이션 10일째에, 실리콘 고리를 CAM 상에 놓고, 피펫을 사용하여 고리 내부에 1 x 106 개의 암세포를 시드한다. (F, G) 상이한 시점(시간 내지 수일)에서, 부착된 암 세포로 CAM을 해부하고, (F) PFA에 고정시키고, 수크로스로 처리하고, 동결 섹션 배지에 위치시키고, (G) -80°C에서 동결시킨다. (H) 연관된 GFP+ 암 세포(녹색) 및 라미닌 면역조직화학 염색(적색)을 갖는 절편화된 CAM의 예이다. 스케일 바 = 2mm(E,F), 1mm(G) 및 100μm(H). 이 수치는 Palaniappan et al.7에서 나온 것입니다. 약어: CAM = 맥락알란토막; PFA = 파라포름알데히드; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 배양 방법과 관련하여 닭 배아 생존. (A,B) 배양 10일째에, 내부 HCs에서의 닭 배아 생존율이 두 배로 증가하였다(평균값 89.33; N=105)를 페트리 디쉬에서의 인큐베이션과 비교(A; 평균값 40; N=64) 및 비가습 챔버(B; 평균값 48.67; N = 46). (C,D) 배양 13일째에, HC를 사용하여 여전히 높은 생존율이 관찰되었다 (평균값 81.67; N=105)인 반면, 배아 생존의 주요 감소는 PD를 사용하여 발견되었다(C; 평균값 11.33; N=64) 및 N-HC(D; 평균값 18.33; N = 46). 통계적 유의성은 짝을 이루지 않은 두 꼬리 t-검정을 사용하여 시험하였다. 오류 막대는 표준 편차를 나타냅니다. *p< 0.05, **p는 0.01, ***p는 0.001< ***p<다. 이 그림은 Palaniappan et al.7에서 수정되었습니다. 약어: HC = 가습 챔버; PD = 페트리 요리; N-HC = 비가습 챔버; E X = 잠복기 X. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
이 프로토콜을 사용하여 GFP (U251 교모세포종, PC-3U 전립선, SW620 결장 및 A549 폐)를 발현하는 상이한 암 세포주의 분석은 Palaniappan et al.7에 의해 이전에 보고되었다. CAM-Delam 분석의 결과에는 병아리 기저 층으로 넘어간 세포로 정의되는 라미닌에 의해 검출된 기저 라미나의 형태학, 및 암세포 침윤의 차이가 포함되며, 이는 병아리 기저 라미나 층을 병아리 중배엽층으로 교차시킨 세포로 정의됩니다(그림 3). 이러한 결과는 기저 라미나를 분해하고 중간엽을 침범하는 암세포의 용량이 네 가지 범주 중 하나로 점수화될 수 있음을 보여준다: 1) 눈에 보이는 변화가 없는 온전한 기저 라미나(그림 3B), 2) 변경되었지만 손상되지 않은 기저 라미나(그림 3C), 3) 세포 침윤이 없는 손상된 기저 라미나(그림 3D), 4) 세포 침윤으로 손상된 기저 라미나(그림 3E) ). 또 다른 관찰은, 암세포가 변경되거나 손상된 기저 라미나를 야기했을 때, 혈관8에서 합성되는 폰 빌레브란트의 인자에 대한 항체 염색에 의해 정의된 혈관 형성의 증가로 CAM이 또한 두꺼워졌다는 것이다(도 4C-H). 이 두 표현형, 즉 두꺼워진 CAM과 혈관의 증가된 형성은 CAM이 손상되지 않았을 때 관찰되지 않았다(도 4A,B).
도 3: CAM-Delam 스코어링. (A-E) CAM 기저 라미나의 완전성에 기초한 CAM-Delam 스코어링 예는, 항-라미닌(적색) 및 GFP 발현 암 세포의 잠재적 침윤(녹색)에 의해 시각화된다. (A) 암세포 없이 CAM을 조절한다. (B-E) 암세포에 대한 반응에서, 기저 라미나의 형태를 설명하는 네 가지 범주가 점수가 매겨질 수 있다: (B) 온전한 라미닌, (C) 변경되었지만 손상되지 않은 라미닌 (별표로 나타냄), (D) 손상된 라미닌이지만 암세포 침윤이 없는 (화살표), 세포 침윤이 있는 손상된 라미닌 (화살촉). 스케일 바 = 100 μm (A-E). 이 수치는 Palaniappan et al.7에서 나온 것입니다. 약어: CAM = 맥락알란토막; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: CAM 비후와 혈관 형성의 평가. (A-H) 다양한 암 세포 유형의 라미나에 반응하여 항-폰 빌레브란트 인자(적색)에 의해 검출된 CAM 비후화 및 혈관 형성의 시각화의 예이다. (A, B) 암세포없이 CAM을 제어하십시오. (C,D) 비-전이성 암 세포주 (온전함으로서 스코어링됨)에 대한 반응으로, 중간엽의 명백한 비후화 또는 증가된 혈관 형성은 검출되지 않았다. (E-H) 변화되거나 손상된 라미닌을 초래하는 전이성 암세포에 반응하여, 중간엽이 두꺼워졌고 (이중 화살촉으로 나타남) 증가된 혈관 형성이 관찰되었다 (화살표로 표시됨). 스케일 바 = 100 μm. 이 그림은 Palaniappan et al.7에서 수정되었습니다. 약어: CAM = 맥락알란토막; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
U251 교모세포종 및 PC-3U 전립선암 세포는 완전히 상이한 박리 능력을 갖는 암 세포주의 두 가지 예이다(도 5). PC-3U 세포는 1.5일 후, 2.5일 후에 명확한 침윤과 함께 손상된 라미닌을 유도하였다(도 5A). 대조적으로, U251 세포는 1.5-3.5 일 후에 라미닌의 사소한 변화를 유도했지만 라미닌에 눈에 띄는 손상을 일으키지 않았습니다 (그림 5B).
도 5: 전립선(PC-3U) 및 교모세포종(U251) 암세포의 박리 능력을 시각화한 것이다. (A) PC-3U 세포는 14시간 후에 라미닌의 경미한 변화를 유도하고, 1.5일 후에 라미닌의 손상(화살표), 및 침윤 개시 2.5일 후, 3.5일 후에 증가하였다(화살촉). (B) U251 세포는 1.5-3.5 일 후에 라미닌의 경미한 변화를 일으킨다. 오른쪽 패널에는 CAM-Delam 득점을 나타내는 그래프가 표시됩니다. y축은 샘플 수를 나타내고 x축은 배양 시점을 나타냅니다. 스케일 바 = 100 μm (A,B). 이 그림은 Palaniappan et al.7에서 수정되었습니다. 약어: CAM = 맥락알란토막; GFP = 녹색 형광 단백질. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
CAM-Delam 분석은 박리 과정을 조절하는 분자 메커니즘을 정의하는 데 사용할 수 있습니다. 한 가지 예는 광범위한 MMP 억제제 GM6001을 사용하여 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)를 억제하는 것의 결합 유무에 관계없이 저산소증을 유도하기 위해CoCl2 처리의 사용이다 (도 6). CoCl2 처리 후, U251 비-전이성 암 세포는 박리 및 침습성 세포를 유도하는 능력을 획득하였고, 이는 MMP 억제제 GM6001과 조합된CoCl2 처리시 억제되었다(도 6). 따라서, CAM-Delam 분석은 박리 과정에 영향을 미치는 분자 및 분자 경로를 정의할 때 유용할 수 있다.
도 6: CoCl2에 단독으로 또는 MMP 억제제와 함께 노출된U251 세포에 반응하는 박리 패턴. (A-C) U251 세포를 다양한 조건 동안 CAM 상에서 3.5일 동안 배양하였다. (A) 단독으로 배양된 U251 세포는 라미닌에 대한 어떠한 손상도 유도하지 않았다. (b) 세척 전에 CoCl2에 미리 노출된 U251 세포를 배양하고 CAM 상에서 세포 시딩을 유도하여 라미닌 손상 및 세포 침윤을 유도하였다. (c) 광범위한 스펙트럼 MMP 억제제 GM6001로 전처리(1시간 동안), 세척 및 CAM에U251 세포를 시딩하기 전에 CoCl2 노출(24h)에 이어서, CoCl2 처리의 효과를 억제하고, 명백한 라미닌 손상 또는 암세포 침윤이 검출되지 않았다. 스케일 바 = 100 μm (A-C). 패널 (B) 및 (C)는 Palaniappan et al.7로부터 왔다. 약어: CAM = 맥락알란토막; GFP = 녹색 형광 단백질; CoCl2 = 염화코발트; MMP = 매트릭스 메탈로프로테이나제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 논문은 암 세포의 전이성 공격성을 평가하기 위한 CAM-Delam 검정을 기술하고, 몇 시간 내지 며칠 내에 중간엽 내로의 기저 라미나 조절 및 잠재적 세포 침윤을 스코어링함으로써 결정된다. 다양한 CAM 분석에 대한 이전의 기술적 인 문제는 병아리 배아의 낮은 생존이었습니다. 이 문제는 배아 인큐베이션 중에 내부 가습 챔버의 사용을 도입하여 해결되었으며, 이는 배아 생존을 10 % -50 %에서 80 % -90 % 7로 증가 시켰습니다. 따라서 내부 가습 챔버의 사용은 일반적으로 CAM 분석뿐만 아니라 다른 전 오보 병아리 실험에서도 유용 할 수 있습니다.
CAM에 1 x 10 6 암세포를 시딩한 후 14 h, 1.5일, 2.5일 및 3.5일에서 제시된 스코어링 시점은6개의 상이한 암 세포주를 사용한 엄격한 방법 개발에 기초하고 있으며, 암 세포주의 비적층으로부터 탈라미네이팅-침윤 용량에 이르는 범위를 구별하기에 충분하다. 각 시점과 세포주 당 세 개의 고리가있는 네 개의 알을 최소한으로 사용하는 것이 좋으며, 이는 적어도 한 번 또는 실험 설계 및 통계 요구 사항에 따라 반복되어야합니다. CAM-Delam 분석의 한 가지 장점은 암세포의 공격성과 전이 형성의 잠재적 위험을 추정하기 위해 며칠 이내에 암 세포의 박리 능력에 관한 유익한 결과를 얻는 것입니다. 결과의 신속한 전달은 침범하는 암세포와 후속 미세 종양 / 종양 새싹 및 장기 전이로 인한 기저 라미나의 분해를 모니터링함으로써 촉진됩니다. 전통적으로, CAM 모델은 장기 전이의 형성을 분석하는데 사용되어 왔으며, 이는9가 결정되기까지 약 2주가 걸린다. 7개의 상이한 암 세포주를 사용함으로써, 우리는 이전에7개의 박리 스코어링이 설치 류 모델 10,11,12,13,14에서 전이를 형성하는 암 세포의 능력과 관련이 있다는 것을 확인하였으며, 이는 CAM-Delam 분석의 예측 값을 지지한다. 또한, 마우스 모델은 전이를 검사 할 수 있기 전에 몇 주에서 몇 달까지 더 긴 시간이 필요합니다15,16. 간단히 말해서, 병아리 배아에서 나중에 종양 형성을 검사하는 것이 아니라 박리 능력을 채점하는 데 초점을 맞춘 CAM-Delam 분석이 개발 된 CAM-Delam 분석은 기존 닭 CAM 침윤 및 마우스 종양 모델을 보완하는 좋은 보완물입니다.
CAM-Delam 분석의 한계는 암세포 자체가 라미닌을 발현하는 경우 기저 라미나의 불분명한 시각화일 수 있다. 만약 그렇다면, E-cadherin과 같은 기저 라미나를 나타내는 다른 마커들이 사용될 수 있다7. 다른 CAM 침윤 연구는 IV 형 콜라겐을 사용하여 CAM 및 범 시토케라틴 및 비멘틴을 시각화하여 침입하는 암세포와 미세 종양 / 종양 새싹17,18의 형성을 확인했습니다.
박리는 발달 중과 나중에 삶의 정상적인 세포 과정으로, 세포가 상피를 떠나 다른 조직으로 이동할 수있게합니다. 발달 동안 디라미네이팅 세포의 예는 신경 볏 및 후각 개척 뉴런19,20; 나중에 인생에서 상처 치유는 박리21에 달려 있습니다. 암 동안,이 과정은 잘못된 세포 및 / 또는 잘못된 시간에 상향 조절됩니다. 따라서, CAM-Delam 방법은 박리를 조절하는 분자 메커니즘을 푸는 데 사용될 수 있으며, 이는 기본적인 생물학적 및 질병 지식 모두에 중요 할 것입니다. 이러한 박리 연구에는 CAM에 시딩된 암세포에 관심 있는 인자를 추가하거나 유전자 변형 암세포를 연구하는 것이 포함됩니다. 여기에 제시된 한 가지 예는 저산소증을 유도하는 비전이성 세포주 U251의 CoCl2 전처리이며, 이는 광범위한 스펙트럼 MMP 억제제에 의해 억제될 수있는 전이성 공격적인 용량의 유도를 유도한다. 따라서, 박리를 조절하는 핵심 분자를 찾는 것은 이 과정을 억제하기 위한 억제제를 설계할 가능성을 증가시킨다. 이와 관련하여, CAM-Delam 프로토콜에 대한 또 다른 잠재적인 용도는 박리 및 세포 침윤의 억제를 위한 약물 스크리닝에 있다. 또한 클리닉에서 암 중증도 평가는 진단, 치료 계획 및 치료에 중요한 구성 요소입니다. 현재, TNM 스테이징 시스템(T, 종양 크기; N, 노드-암이 림프절로 확산되었는지 여부; M, 원거리 전이)는 암(22)의 중증도를 평가하는데 사용된다. CAM-Delam 분석은 암 세포의 공격성과 전이 형성에 대한 잠재적 위험을 평가하는 혁신적인 접근법을 정의하며 TNM 스테이징 시스템에 유용한 보완책이 될 수 있습니다. 주목할 만한 점은 TNM 스테이징이 고정된 조직 샘플의 분석에 기초한 반면, 잠재적인 임상 CAM-Delam 접근법은 동결 세포(23)를 부활시키기 위한 기술과 결합하여 신선하거나 신선한-냉동 조직을 검사할 것이라는 점이다.
Disclosures
저자는 공개 할 경쟁 이익이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 관련 암 세포주 및 항체에 대한 도움을 주신 Umeå University의 다음 연구원들에게 감사드립니다 : L. Carlsson (von Willebrand Factor 항체), J. Gilthorpe (U251) 및 M. Landström (PC-3U). 우리는 또한 HEK293-TLR-AAVS1 안정한 세포주의 생성을 위해 Gilthorpe 실험실에서 Hauke Holthusen에게 감사드립니다. Gunhaga 실험실에서의 작업은 스웨덴 암 재단 (18 0463), Umeå Biotech Incubator, Norrlands Cancerforskningsfond, Swedish Research Council (2017-01430) 및 Umeå University의 의학 교수진의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
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