Summary
يصف هذا البروتوكول حقنة من نقطتين من الليسوفوسفاتيديل كولين عبر إطار مجسمة لتوليد نموذج إزالة الميالين مستقر وقابل للتكرار في الفئران.
Abstract
تساهم إشارات الليزوفوسفوليبيد بوساطة المستقبلات في الفيزيولوجيا المرضية للأمراض العصبية المتنوعة ، وخاصة التصلب المتعدد (MS). Lysophosphatidylcholine (LPC) هو ليسوفوسفوليبيد داخلي المنشأ مرتبط بالالتهاب ، ويمكن أن يسبب ضررا سريعا مع سمية دهون المايلين ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين البؤري. هنا ، يتم تقديم بروتوكول مفصل لحقن LPC التجسيمي المكون من نقطتين والذي يمكن أن يسبب مباشرة إزالة الميالين الشديدة ويكرر إصابة إزالة الميالين التجريبية بسرعة وثبات في الفئران عن طريق الإجراء الجراحي. وبالتالي ، فإن هذا النموذج وثيق الصلة بأمراض إزالة الميالين ، وخاصة مرض التصلب العصبي المتعدد ، ويمكن أن يساهم في الأبحاث ذات الصلة ذات الصلة ذات الصلة سريريا. أيضا ، تم استخدام طرق التلطيخ الأزرق السريع Luxol و Luxol لتصوير المسار الزمني لإزالة الميالين في الجسم الثفني للفئران التي تم حقنها باستخدام LPC. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الطريقة السلوكية لتقييم الوظيفة الإدراكية للفئران بعد النمذجة. بشكل عام ، يعد الحقن ثنائي النقطة للليسوفوسفاتيديل كولين عبر إطار مجسمة طريقة مستقرة وقابلة للتكرار لتوليد نموذج إزالة الميالين في الفئران لمزيد من الدراسة.
Introduction
تتضمن إشارات الليزوفوسفوليبيد بوساطة المستقبلات عمليات فسيولوجية متنوعة لجميع أنظمة الأعضاء تقريبا1. في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تلعب هذه الإشارات دورا حاسما في مسببات الأمراض العصبية المناعية الذاتية مثل التصلب المتعدد (MS). التصلب المتعدد هو اضطراب مزمن بوساطة المناعة يتميز بإزالة الميالين المرضية والاستجابة الالتهابية ، مما يسبب اختلالا وظيفيا عصبيا وضعفا إدراكيا 2,3. بعد الانتكاس المستمر والتحويل أثناء المرض المبكر ، يتقدم معظم المرضى في النهاية إلى المرحلة الثانوية التقدمية ، والتي يمكن أن تسبب ضررا لا رجعة فيه للدماغ والعجز الناتج4. ويعتقد أن السمة المميزة المرضية للمسار الثانوي التقدمي هي إزالة الميالين من اللويحات الناجمة عن الآفات الالتهابية5. يمكن أن تقلل العلاجات الحالية للتصلب المتعدد بشكل كبير من خطر الانتكاس. ومع ذلك، لا يوجد حتى الآن علاج فعال للضرر المزيل للميالين على المدى الطويل الناجم عن التصلب المتعددالتدريجي 6. وبالتالي ، هناك حاجة إلى نموذج ثابت وقابل للتكرار بسهولة لدراسة العلاجات قبل السريرية التي تركز على تنكس المادة البيضاء.
إزالة الميالين وإعادة الميالين هما عمليتان مرضيتان رئيسيتان في تطوير التصلب المتعدد. إزالة الميالين هي فقدان غمد المايلين حول المحاور العصبية التي تسببها الخلايا الدبقية الصغيرة ذات الأنماط الظاهرية المؤيدة للالتهابات7 ، وتؤدي إلى بطء توصيل النبضات العصبية وتؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية والاضطرابات العصبية. Remyelination هي استجابة إصلاح داخلية المنشأ بوساطة الخلايا قليلة التغصن ، حيث يمكن أن تؤدي الاضطرابات إلى تنكس عصبي وضعف إدراكي8. الاستجابة الالتهابية أمر بالغ الأهمية للعملية برمتها ، مما يؤثر على كل من درجة تلف المايلين وإصلاحه.
لذلك ، فإن النموذج الحيواني المستقر لإزالة الميالين الالتهابية المستمرة له معنى لمزيد من الاستكشاف للاستراتيجيات العلاجية للتصلب المتعدد. نظرا لتعقيد مرض التصلب العصبي المتعدد ، تم إنشاء أنواع مختلفة من النماذج الحيوانية لمحاكاة الآفات المزيلة للميالين في الجسم الحي ، بما في ذلك التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ، ونماذج إزالة الميالين السامة ، و cuprizone (CPZ) ، و lysophosphatidylcholine (LPC)9 . LPC هو ليسوفوسفوليبيد داخلي المنشأ مرتبط بالالتهاب ، ويمكن أن يؤدي إلى تلف سريع مع سمية دهون المايلين ، مما يؤدي إلى إزالة الميالين البؤري. استنادا إلى التقارير السابقة والأبحاث10,11 ، يتم توفير بروتوكول مفصل للحقن من نقطتين مع بعض التعديلات. بشكل عام ، ينتج نموذج حقن LPC الكلاسيكي المكون من نقطة واحدة فقط إزالة الميالين المحلية في موقع الحقن وغالبا ما يكون مصحوبا بإعادة الميالين التلقائي12,13. ومع ذلك ، يمكن لنموذج LPC للحقن المكون من نقطتين أن LPC يمكن أن يحفز مباشرة إزالة الميالين في جسم الفأر الثفني ويسبب إزالة الميالين بشكل أكثر دواما مع القليل من تجديد المايلين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة معهد رعاية الحيوان التابعة لكلية تونغجي الطبية ، جامعة هواتشونغ للعلوم والتكنولوجيا ، الصين. تم استخدام الفئران البالغة C57BL/6 من الذكور والإناث (النوع البري ، WT ؛ 20-25 جم ؛ 8-10 أسابيع من العمر) لهذه الدراسة. تم الحصول على الفئران من مصادر تجارية (انظر جدول المواد). تم إيواء الفئران في منشأة حيوانية محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) مع توفير المياه والغذاء بشكل مخصص. تم الاحتفاظ بها في فترة 12 ساعة بالتناوب من دورة الضوء والظلام في الظروف القياسية لدرجة حرارة 22 درجة مئوية والرطوبة النسبية من 55٪ -60٪.
1. إعداد حل LPC
- قم بإذابة 25 ملغ من مسحوق LPC (انظر جدول المواد) مع 250 ميكرولتر من محلول الكلوروفورم والميثانول المختلط (1: 1) لصنع محلول LPC بنسبة 10٪ ونقله إلى أنبوب طرد مركزي 500 ميكرولتر.
ملاحظة: إذا لم يتم إذابة LPC بالكامل ، فضع أنبوب الطرد المركزي في منظف بالموجات فوق الصوتية والموجات فوق الصوتية عند 40 كيلو هرتز لمدة ~ 1 ساعة للحصول على حل موحد. - قسم المحلول إلى 3 ميكرولتر / أنبوب وخزنه عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: يمكن تخزين الحل لمدة ~ 2 سنوات. - قبل الجراحة ، قم بتخفيف المحلول (الخطوة 1.2.) باستخدام 27 ميكرولتر من محلول كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪ ، واحتفظ بالمحلول في حمام مائي بدرجة حرارة ثابتة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: قم بإعداد المحلول قبل بدء الحقن مباشرة.
2. التحضير الجراحي
- استخدم إبرة 32 جم ، 2 بوصة للاتصال بحقنة 5 ميكرولتر (انظر جدول المواد). تأكد من أن حقنة الميكرولتر دون عائق. سحب 5 ميكرولتر من محلول LPC لإعداد الحقن.
- تخدير الماوس في غرفة تحريض متصلة بمبخر الأيزوفلوران مع 3٪ أيسوفلوران ممزوج بأكسجين 100٪ بمعدل حوالي 0.3 لتر / دقيقة.
- تأكد من عمق التخدير من خلال عدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم بينما يكون التنفس سلسا.
- حلق رأس الماوس بين الأذنين باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. ضع قطرات العين المشحمة لمنع جفاف القرنية أثناء العملية.
- بعد ذلك ، ضع الماوس في إطار مجسمة (انظر جدول المواد) مع الجانب الظهري لأعلى ، وقم بتأمين الرأس باستخدام مخروط الأنف ومشبك الأسنان. الحفاظ على التخدير مع 1.2 ٪ -1.6 ٪ isoflurane من خلال أنفه.
ملاحظة: يمكن تعديل تركيز الأيزوفلوران وفقا للحالة التنفسية للفئران.
3. الإجراء الجراحي
ملاحظة: يتم وضع الحيوانات على وسادة التدفئة أثناء جميع الإجراءات.
- قم بإصلاح الماوس على الجهاز المجسمي باستخدام قضبان الأذن الثنائية. تأكد من أن قضبان الأذن مستوية والرأس أفقي ومستقر.
- تطهير الجلد على الرأس عن طريق مسح عدة مرات مع اليود تليها الكحول في حركة دائرية. ثم استخدم مشرطا لقطع شق صغير يبلغ حوالي 1.5 سم على طول خط الوسط لفروة الرأس لفضح الجمجمة.
- امسح الجمجمة بقطعة قطن مغموسة في 1٪ من بيروكسيد الهيدروجين حتى يتم الكشف عن البريجما واللامدا واليافوخ الخلفي. ضع المحقنة على الجهاز المجسم.
ملاحظة: استخدم بيروكسيد الهيدروجين بعناية وتجنب لمس الأنسجة المحيطة. - ضمان الوضع الأفقي لرأس الحيوان (الأمامي والخلفي واليسار واليمين).
- اضبط مقبض المحور Z للإطار المجسمة بحيث يلمس طرف الإبرة والجمجمة فقط دون الانحناء، ثم قم بقياس إحداثيات المحور Z. تحقق من إحداثيات Z للبريجما واليافوخ الخلفي.
- اضبط شريط الأذن بحيث لا يزيد الفرق بين إحداثيات Z للبريجما واليافوخ الخلفي عن 0.02 مم. ثم اتبع نفس الطريقة لقياس إحداثيات Z للمواضع المقابلة على الجانبين الأيسر والأيمن من خط الوسط. اضبط شريط الأذن للتأكد من أن اليسار واليمين في نفس المستوى.
- حدد موقع الجسم الثفني. اضبط أصل XYZ على bregma.
ملاحظة: موقع الحقن الأول هو 1.0 مم جانبي للبريجما، وعمق 2.4 مم، وأمامي 1.1 مم. موقع الحقن الثاني هو 1.0 مم جانبي إلى bregma ، وعمق 2.1 مم ، و 0.6 مم أمامي. على سبيل المثال، إحداثيات البريجما هي (0,0,0). قم بقياس إحداثيات Z للموقع المقابل الذي تم وضع علامة عليه على أنه (-1 ، 1.1 ، X) و (-1 ، 0.6 ، Y). يمكن تحديد إحداثيات موقع الحقن الأولى للجسم الثفني هي (-1 ، 1.1 ، −[X + 2.4]) ، وموقع الحقن الثاني هو (-1 ، 0.6 ، − [Y + 2.1]). - بمجرد تحديد موقع الحقن ، ضع علامة بعلامة معقمة على الجمجمة وسجل الإحداثيات.
- قم بحفر الموقع المحدد برفق باستخدام مثقاب الجمجمة (انظر جدول المواد). احرص على تجنب أي نزيف.
- حرك الإبرة ببطء إلى الإحداثيات المعطاة وابدأ الحقن. للحث على إزالة الميالين من الجسم الثفني ، حقن 2 ميكرولتر من محلول LPC (الخطوة 1.) في كل موقع حقن (الخطوة 3.5) بمعدل 0.4 ميكرولتر / دقيقة.
- بعد الحقن ، احتفظ بالإبرة في كل موقع لمدة 10 دقائق إضافية.
ملاحظة: تأكد من أن الفاصل الزمني لحقنتين لا يزيد عن 20 دقيقة. - خياطة الجلد مع خياطة 4-0 وانتظر حتى يستيقظ الحيوان في غضون 10 دقائق. إدارة المسكنات بعد العملية الجراحية وفقا للوائح المؤسسية لرعاية الحيوانات.
ملاحظة: يمكن تحديد الوقت الموصى به للقتل الرحيم وفقا لغرض التجربة.
4. استخراج عينة لإزالة الميالين البؤري
ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول هذه الخطوة، يرجى الاطلاع على التقريرالمنشور سابقا 14.
- قم بإذابة صبغة حمراء محايدة (انظر جدول المواد) في محلول 1٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
- قبل ساعات من التضحية بالفئران (لمزيد من التفاصيل ، انظر المرجع السابق10) ، حقن 500 ميكرولتر من صبغة حمراء محايدة بنسبة 1٪ في PBS عن طريق الحقن داخل الصفاق لكل فأر.
- قم بإجراء تروية القلب12 مع 30 مل من 0.1٪ PBS المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية.
- قم بتقطيع الدماغ إلى 1 مم باستخدام قالب دماغي (انظر جدول المواد).
- تصور الآفة الملطخة باللون الأحمر المحايد تحت المجهر وفصل الآفة.
ملاحظة: قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة الطبيعية المحيطة لتحسين دقة التحليل اللاحق. يمكن فحص أنسجة الآفة باستخدام RT-PCR والمجهر الإلكتروني وتحليلات اللطخة الغربية.
5. تلطيخ الأنسجة والتألق المناعي
- للتلطيخ النسيجي والتألق المناعي12 ، بعد تروية القلب (الخطوة 4.3) ، قم بإزالة الدماغ10 ، وإصلاح 4٪ PFA بين عشية وضحاها (عند 4 درجات مئوية) ، وجفاف تماما في 30٪ السكروز.
- مقطعة إلى أقسام الدماغ الإكليلي 20 مم باستخدام قطاعة مجمدة 10 عند درجة حرارة ثابتة (-20 درجة مئوية).
- استخدم الشرائح لتلطيخ Luxol fast Blue (LFB) ، والتألق المناعي ، واللطخة الغربية10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أدى الحقن المكون من نقطتين من LPC إلى إزالة الميالين بشكل أكثر متانة
LPC يؤدي أساسا إلى تلف سريع مع سمية المايلين وانقسام سلامة المحور العصبي15. كان يوم الحقن يعتبر اليوم 0. تم الاحتفاظ بالفئران لمدة 10-28 يوما (10 نقطة في البوصة و 28 نقطة في البوصة). تم استخدام تلطيخ Luxol fast Blue (LFB)10 لتقييم منطقة إزالة الميالين في الفئران في هذه النقاط الزمنية. في نموذج الحقن المكون من نقطتين ، كان هناك إزالة ميالين كبيرة على 10 نقطة في البوصة مقارنة بمجموعة صورية ، مما يدل على أن الحقن الموضعي ل LPC يمكن أن يزيل الميالين بنجاح الجسم الثفني. لا تزال هناك درجة عالية نسبيا من إزالة الميالين عند 28 نقطة في البوصة ، مما يشير إلى إزالة الميالين المستمرة والمستقرة بسبب حقن LPC المكون من نقطتين (الشكل 1D-E).
لمزيد من التقييم لفقدان غمد المايلين ، تم اختيار 10 أيام كنقطة زمنية رئيسية عندما يكون إزالة الميالين واضحا نسبيا. من خلال تلطيخ التألق المناعي للبروتين الأساسي المتحلل للمايلين (dMBP) ، لوحظت زيادة ملحوظة في dMBP في المجموعة المحقونة ب LPC عند 10 نقاط في البوصة (الشكل 1F) ، والتي تمثل فقدان المايلين في الجسم الثفني. أيضا ، تم استخدام بروتين أنسجة الآفة التي تم الحصول عليها (الخطوة 4.) لتحليل تعبير MBP بواسطة اللطخة الغربية. بعد النمذجة وفقا للبروتوكول ، أظهر MBP خسارة كبيرة (الشكل 1G). كانت هذه النتائج متسقة مع LFB وتلطيخ التألق المناعي.
لوحظ مورفولوجيا المايلين في الجسم الثفني بعد 10 أيام من حقن LPC باستخدام المجهر الإلكتروني (تم استخراج أنسجة الآفة وفقا للخطوة 4). يتحقق إزالة الميالين الواضحة من نجاح النمذجة (الشكل 2).
أثر حقن LPC المكون من نقطتين على تجديد المايلين
يلعب تمايز ونضج الخلايا قليلة التغصن (OLGs) دورا حاسما في إصلاح غمد المايلين في MS. يحدث تجديد المايلين في المقام الأول عن طريق التمييز بين خلايا سلائف الخلايا قليلة التغصن (OPCs) إلى خلايا قليلة التغوير المائلة. وبالتالي ، ستتأثر عملية إصلاح المايلين بمجرد حظر تمايز OPCs إلى OLGs. Gst-π هو علامة نضج تمايز OPC16. بعد 10 أيام من حقن LPC ، يمكن أن نرى من خلال التألق المناعي أن Gst-π انخفض مقارنة بالمجموعة الوهمية (الشكل 3A). في الوقت نفسه ، يمكن أن تنعكس القدرة على انتشار الخلايا قليلة التغصن من خلال نسبة Ki67 (تكاثر الخلايا قليلة التغصن) و Olig2 (إجمالي خلايا سلالة oligodendrocyte) 17,18. تمثل نسبة التوطين المشترك Ki67 / Olig2+ الأعلى المزيد من انتشار الخلايا القليلة التغصن بعد 10dpi (الشكل 3B). تشير هذه الصور إلى أن منطقة الآفة تحاول الإصلاح من خلال نضج وانتشار OPCs بعد حقن LPC.
حقن LPC من نقطتين يضعف الذاكرة المكانية للفئران
لتحليل قدرة الذاكرة المكانية لحقن LPC في الفئران ، تم استخدام متاهة موريس المائية (WMM)19 ولم تظهر أي فرق في سرعة السباحة بين الفئران الوهمية والفئران التي تم حقنها بواسطة LPC. ومع ذلك ، عندما تمت إزالة المنصة في متاهة موريس المائية ، تم تقليل زمن الوصول للعثور على المنصة المخفية (ضعف التعلم المكاني) ، وزاد الوقت المستغرق في الربع المستهدف (ضعف الاحتفاظ بالذاكرة) (الشكل 4). تشير النتائج إلى أن الذاكرة المكانية للفئران المزيلة للميالين ضعيفة بشكل كبير في نموذج حقن LPC المكون من نقطتين. ويرد في الجدول 1 عدد الحيوانات المستخدمة في تجارب مختلفة. تلقى كل ماوس تدريبا بدءا من اليوم 2 أو اليوم 20.
الشكل 1: الحقن من نقطتين لإزالة الميالين الناجم عن LPC. (أ) تمثيل مواقع الحقن (1.0 مم جانبية ، عمق 2.4 مم ، و 1.1 مم أمامي). (ب) تمثيل مواقع الحقن (1.0 مم جانبية، وعمق 2.1 مم، و 0.6 مم أمامي). (ج) رسم توضيحي للنقاط الزمنية للكشف. (د) الكشف عن آفات المادة البيضاء عن طريق تلطيخ LFB. تلطيخ LFB في 10 أيام بعد الحقن (dpi) و 28 نقطة في البوصة ، مما يدل على إزالة الميالين المستمرة من الجسم الثفني (شريط المقياس = 200 ميكرومتر). (ه) التحديد الكمي لمنطقة إزالة الميالين في نقاط زمنية مختلفة. يتم تمثيل البيانات كمتوسط ± SD ، ANOVA أحادي الاتجاه متبوعا باختبارات المقارنة المتعددة ل Bonferroni. ****p < 0.0001، n = 6 لكل مجموعة. (F) صور تمثيلية للتلطيخ المناعي dMBP في الجسم الثفني (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). بالمقارنة مع الشام ، الذي لم يكن لديه تقريبا dMBP ، يمكن رؤية dMBP واضح بعد حقن LPC. (ز) تحليل اللطخة الغربية لتعبير MBP. أظهر MBP خسارة كبيرة بعد حقن LPC. تم استخدام β-actin كعنصر تحكم في التحميل لقياس التعبير الأساسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تؤكد صور المجهر الإلكتروني البنية الفائقة النخاعية في الجسم الثفني للزائفة مقارنة بالبنية المزيلة للميالين في الفئران المحقونة ب LPC (شريط المقياس = 1 ميكرومتر).
الشكل 3: أثر الحقن المكون من نقطتين على نضج وانتشار OPCs. (أ) صور تمثيلية π GST-في الجسم الثفني للفئران الوهمية والمحقونة ب LPC (شريط المقياس = 20 ميكرومتر). يشير اللون الأحمر إلى π ضريبة السلع والخدمات. (ب) صور تمثيلية للتوطين المشترك ل Olig2 و Ki67 (شريط المقياس = 20 ميكرومتر). الأحمر يدل على Ki67 ، والأخضر يدل على Olig2. تم التقاط الصور باستخدام نظام الفحص المجهري البؤري مع خطوط ليزر 488 نانومتر و 594 نانومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ضعف الذاكرة المكانية الناجم عن حقن LPC. (أ) صور تمثيلية لمسار سباحة الفئران في كل مجموعة في وجود المنصة (مرحلة التعلم). (ب) صور تمثيلية لمسارات سباحة الفئران في كل مجموعة بعد إزالة المنصة (مرحلة الذاكرة). ويرد في الجدول 1 عدد الحيوانات المستخدمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| مجموعة | الشام | مجموعة LPC-Group |
| LFB تلطيخ | 6 | 12 (10 نقاط لكل بوصة، 6؛ 28 نقطة لكل بوصة، 6) |
| المجهر الإلكتروني | 4 | 4 |
| لو | 6 | 6 |
| اللطخة الغربية | 4 | 4 |
| متاهة موريس المائية | 12 | 12 |
الجدول 1: عدد الحيوانات المستخدمة في الاختبارات المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مرض التصلب العصبي المتعدد، وهو مرض مزيل للميالين مزيل للجهاز العصبي المركزي، هو أحد الأسباب الأكثر شيوعا للخلل العصبي لدى الشباب20 عاما. سريريا، ما يقرب من 60٪ -80٪ من مرضى التصلب المتعدد يعانون من دورة الانتكاسات والمغفرة قبل تطوير MS الثانوي التدريجي 21,22، ويؤدي في نهاية المطاف إلى ضعف الحركة التراكمي والعجز المعرفي مع مرور الوقت23. حاليا ، لا يوجد نموذج تجريبي واحد يغطي مجموعة كاملة من السمات السريرية أو المرضية أو المناعية للمرض24. لمحاكاة العملية المرضية والتسبب في مرض التصلب العصبي المتعدد في مراحل مختلفة ، هناك ثلاثة نماذج حيوانية شائعة لإزالة الميالين مع مزاياها وقيودها ، بما في ذلك نموذج EAE ، وتغذية الحيوانات CPZ ، ونماذج إزالة الميالين التي يسببها LPC.
في الفئران ، يتم تحفيز EAE عن طريق استجابة مناعية بعد حقن مستضدات المايلين ، مما يؤدي إلى تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة وتسلل الخلايا الليمفاوية T و B المحيطة بالأوعية الدموية ، وغالبا ما يرتبط تلف المايلين المصاحب بتكرار المرض20,25. إنه يحاكي بشكل أفضل خصائص فترة الانتكاس وتحويل التصلب المتعدد. ومع ذلك ، فإنه يحتوي أيضا على العديد من القيود. على سبيل المثال ، EAE هو في المقام الأول مرض يؤثر على المادة البيضاء في الحبل الشوكي ، في حين أن مرض التصلب العصبي المتعدد يسبب بشكل رئيسي إزالة الميالين من القشرة الدماغية ، وموقع وتوقيت الآفات عشوائي ، مما يجعل من الصعب الحصول على الآفات بدقة19.
CPZ و LPC هي المواد الأكثر استخداما للحث على نماذج إزالة الميالين السامة. انهم جميعا قادرون على التسبب في إزالة الميالين الجهاز العصبي المركزي بعد الإدارة. في نموذج CPZ ، أدى إطعام الفئران الصغيرة إلى كوبريزون مخلب النحاس إلى موت الخلايا قليلة التغصن وإزالة الميالين القابلة للانعكاس اللاحقة. بعد انسحاب كوبريزون ، تم تشغيل عملية إعادة ميالين عفوية في غضون 4 أيام26,27. ينتج عن CPZ بشكل أساسي إزالة الميالين على نطاق واسع ، بينما يميل حقن LPC نحو إزالة الميالين البؤري. بسبب السم والاستجابة الالتهابية ، فإن الحقن الكلاسيكي من نقطة واحدة من LPC يؤدي إلى شكل سريع وقابل للتكرار للغاية من إزالة الميالين28.
ومع ذلك ، لا يمكن لأي من النماذج المذكورة أعلاه أن تحاكي بشكل صحيح العملية المرضية للتصلب المتعدد التدريجي الذي يتميز بإزالة الميالين المستمرة. لذلك ، يقترح البروتوكول الحالي نموذجا لحقن ثنائي النقطة من LPC مباشرة في الجسم الثفني للحث على إزالة الميالين على المدى الطويل. وتشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول الضبط الأفقي لرأس الحيوان وتحديد موقع إحداثيات الحقن. في الخطوة 3.5.، يجب على المرء التأكد من ضبط مستوى البريجما واليافوخ الخلفي أولا ثم ضبط المستويات اليسرى واليمنى. في الوقت نفسه ، تجدر الإشارة إلى أنه بعد ضبط المستويات اليسرى واليمنى ، يجب إعادة وضع نقطة الصفر قبل العمليات اللاحقة. هذه الخطوة حاسمة لأنها ترتبط ارتباطا مباشرا بدقة تحديد المواقع. في الخطوة 3.6.، عند تحديد إحداثيات المحور Z، يجب على المرء التأكد من أن نهاية الإبرة والجمجمة لا تزال على اتصال دقيق، ويمكن للباحث ملاحظة ما إذا كانت الإبرة عازمة. في الخطوة 3.10 ، تبقى الإبرة في مكانها لمدة 10 دقائق لمنع الدواء من التدفق من ممر الإبرة.
وينطوي هذا البروتوكول على بعض القيود. مثل غيرها من النماذج المزيلة للميالين التي تسببها السمية ، فإنها تفتقر إلى نمذجة العمليات المناعية. ثانيا ، على الرغم من أن نموذج الحقن المكون من نقطتين يمكن أن يحافظ على إزالة الميالين لفترة طويلة نسبيا ، إلا أنه لا يزال مصحوبا حتما بدرجة طفيفة من تجديد المايلين مع تقدم المرض إلى مرحلة لاحقة. قد لا يكون نموذجا أكثر ملاءمة لمحاكاة التصلب المتعدد التدريجي الثانوي من بروتين سكري أوليغودندروسيت (MOG) الناجم عن التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي29,30. ينتج نموذج حقن LPC الكلاسيكي المكون من نقطة واحدة فقط إزالة الميالين الالتهابية الموضعية مصحوبة بإعادة الميالين التلقائية. أظهرت الأبحاث السابقة أن تسلل الخلايا التائية والخلايا البائية والبلاعم بعد حقن LPC هو عامل رئيسي في إصلاح المايلين15. ومع ذلك ، بالمقارنة مع نموذج الحقن الكلاسيكي ، فإن نموذج LPC للحقن ثنائي النقطة يحفز إزالة الميالين البؤري السريع للجسم الثفني ويحافظ على درجة إزالة الميالين لفترة أطول مع القليل من إعادة الميالين.
نظرا لتعقيد مرض التصلب العصبي المتعدد، تتطلب مراحل المرض المختلفة وصفا أفضل لنماذج مختلفة. الحقن ثنائي النقطة ل LPC عبر إطار مجسمة هو نموذج فأر تجريبي مستقر وفعال وقابل للتكرار. يمكن أن يؤدي هذا النموذج إلى إزالة الميالين على المدى الطويل ، مصحوبا بإصلاح أقل للمايلين بمرور الوقت. وهذا يعني أنه يمكن استخدام نموذج الحقن المكون من نقطتين ليس فقط لدراسة أمراض إزالة الميالين ولكن أيضا لدراسة تدخلات إصلاح المايلين. إلى جانب ذلك ، يمكن لهذا النموذج بسهولة وسرعة تقييم إزالة الميالين بعد التدخل من خلال التألق المناعي والطرق النسيجية ، ويمكن أن ينعكس الخلل المعرفي للتصلب المتعدد من خلال ضعف الذاكرة المكانية للفئران المزيلة للميالين في الاختبار السلوكي. في الختام ، يمكن لهذا النموذج من إزالة الميالين المستقرة أن يسهل الدراسات المرضية وما قبل السريرية على حد سواء على التقدم الثانوي للتصلب المتعدد والتصلب المتعدد الانتكاسي التحويلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنح: 82071380 ، 81873743).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
