Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין באמצעות מסגרת סטריאוטקסית כדי ליצור מודל דמילינציה יציב וניתן לשחזור בעכברים.
Abstract
איתות ליזופוספוליפידים בתיווך קולטן תורם לפתופיזיולוגיה של מחלות נוירולוגיות מגוונות, במיוחד טרשת נפוצה (MS). ליזופוספטידילכולין (LPC) הוא ליזופוספוליפיד אנדוגני הקשור לדלקת, והוא עלול לגרום לנזק מהיר עם רעילות לשומנים של המיאלין, מה שמוביל לדה-מילינציה מוקדית. כאן, מוצג פרוטוקול מפורט להזרקת LPC סטריאוטקטית דו-נקודתית שעלולה לגרום ישירות לדה-מילינציה חמורה ולשכפל את הפגיעה הניסיונית בדה-מילינציה במהירות וביציבות בעכברים על ידי הליך כירורגי. לפיכך, מודל זה רלוונטי מאוד למחלות דמילינציה, במיוחד טרשת נפוצה, והוא יכול לתרום למחקר הרלוונטי מבחינה קלינית. כמו כן, שיטות הכתם הכחולות המהירות של לוקסול ולוקסול שימשו לתיאור מהלך הזמן של דה-מילינציה בקורפוס קלוסום של עכברים שהוזרקו להם LPC. בנוסף, השיטה ההתנהגותית שימשה להערכת התפקוד הקוגניטיבי של עכברים לאחר מודלים. באופן כללי, הזרקה דו-נקודתית של ליזופוספטידילכולין באמצעות מסגרת סטריאוטקסית היא שיטה יציבה וניתנת לשחזור ליצירת מודל דה-מילינציה בעכברים לצורך מחקר נוסף.
Introduction
איתות ליזופוספוליפידים בתיווך קולטן כולל תהליכים פיזיולוגיים מגוונים של כמעט כל מערכות האיברים1. במערכת העצבים המרכזית (CNS), איתות זה ממלא תפקיד קריטי בפתוגנים של מחלות נוירולוגיות אוטואימוניות כגון טרשת נפוצה (MS). טרשת נפוצה היא הפרעה כרונית בתיווך מערכת החיסון המאופיינת בדה-מיאלינציה פתולוגית ובתגובה דלקתית, הגורמת לתפקוד לקוי נוירולוגי ולפגיעה קוגניטיבית 2,3. לאחר הישנות מתמשכת והעברה במהלך המחלה המוקדמת, רוב החולים מתקדמים בסופו של דבר לשלב המשני-מתקדם, מה שעלול לגרום נזק בלתי הפיך למוח ולנכות 4 וכתוצאה מכך לנכות4. הוא האמין כי סימן ההיכר הפתולוגי של הקורס המשני-פרוגרסיבי הוא demyelinating פלאקים הנגרמים על ידי נגעים דלקתיים5. טיפולים קיימים בטרשת נפוצה יכולים להפחית באופן משמעותי את הסיכון להישנות המחלה. עם זאת, עדיין אין טיפול יעיל לנזקי דה-מילינליזציה ארוכי טווח הנגרמים על ידי טרשת נפוצה6 מתקדמת. לפיכך, נדרש מודל מבוסס ביציבות וניתן לשחזור בקלות כדי לחקור טיפולים פרה-קליניים המתמקדים בניוון החומר הלבן.
Demyelination ו remyelination הם שני תהליכים פתולוגיים עיקריים בפיתוח טרשת נפוצה. Demyelination הוא אובדן של נדן מיאלין סביב אקסונים המושרה על ידי מיקרוגליה עם פנוטיפים פרו דלקתיים7, וזה מוביל הולכה איטית של דחפים עצביים ומביא לאובדן נוירונים והפרעות נוירולוגיות. רמילינציה היא תגובת תיקון אנדוגנית המתווכת על ידי אוליגודנדרוציטים, שבה הפרעות עלולות להוביל לניוון עצבי ולפגיעה קוגניטיבית8. התגובה הדלקתית חיונית לכל התהליך, ומשפיעה הן על מידת הנזק למיאלין והן על התיקון.
לפיכך, מודל חייתי יציב של דה-מילינציה דלקתית מתמשכת הוא בעל משמעות להמשך חקירה של אסטרטגיות טיפוליות לטרשת נפוצה. בשל המורכבות של טרשת נפוצה, סוגים שונים של מודלים של בעלי חיים הוקמו כדי לחקות נגעים דה-מיאליננטים in vivo, כולל אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE), מודלים רעילים-דמילינה, קופריזון (CPZ) וליזופוספטידילכולין (LPC)9 . LPC הוא ליזופוספוליפיד אנדוגני הקשור לדלקת, והוא עלול לגרום לנזק מהיר עם רעילות לשומנים במיאלין, מה שמוביל לדה-מילינציה מוקדית. בהתבסס על דוחות קודמים ומחקר10,11, פרוטוקול מפורט של הזרקה דו-נקודתית עם כמה שינויים מסופק. באופן כללי, מודל ההזרקה הקלאסי של LPC בנקודה אחת מייצר רק דמילינציה מקומית באתר ההזרקה ומלווה לעתים קרובות ברמילינציה ספונטנית12,13. עם זאת, מודל ההזרקה הדו-נקודתית של LPC יכול להדגים כי ה-LPC יכול לגרום ישירות לדה-מילינציה בקורפוס קלוסום של העכבר ולגרום לדמילינציה עמידה יותר עם מעט התחדשות מיאלין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של המכון לטיפול בבעלי חיים של המכללה הרפואית טונג'י, אוניברסיטת הואז'ונג למדע וטכנולוגיה, סין. בוגרים C57BL/6 זכרים ונקבות עכברים (סוג בר, WT; 20-25 גרם; 8-10 שבועות) שימשו למחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים). עכברים שוכנו במתקן מסוים לבעלי חיים ללא פתוגנים (SPF) עם מים ומזון שסופקו עד ליביטום. הם נשמרו בתקופה מתחלפת של 12 שעות של מחזור אור וחושך בתנאים הסטנדרטיים של טמפרטורת 22 מעלות צלזיוס ולחות יחסית של 55%-60%.
1. הכנת תמיסת LPC
- ממיסים 25 מ"ג אבקת LPC (ראו טבלת חומרים) בתמיסה מעורבת של 250 μL של כלורופורם ומתנול (1:1) כדי ליצור תמיסת LPC של 10% ולהעביר אותה לצינור צנטריפוגה של 500 μL.
הערה: אם ה- LPC אינו מומס לחלוטין, מקם את שפופרת הצנטריפוגה בחומר ניקוי קולי ואולטרה-סוניקט ב- 40 קילוהרץ במשך כשעה אחת כדי לקבל פתרון אחיד. - חלקו את התמיסה ל-3 μL/tube ואחסנו ב-−80°C.
הערה: ניתן לאחסן את הפתרון למשך כשנתיים. - לפני הניתוח, דיללו את התמיסה (שלב 1.2)ב-27 μL של תמיסת NaCl של 0.9%, ושמרו על התמיסה באמבט מים בטמפרטורה קבועה של 37 מעלות צלזיוס.
הערה: הכן את הפתרון רגע לפני תחילת ההזרקה.
2. הכנה כירורגית
- השתמש במחט של 32 G, 2 כדי להתחבר למזרק של 5 μL (ראה טבלת חומרים). ודא שהמזרק המיקרוליטר אינו מופרע. למשוך 5 μL של תמיסת LPC להכנת ההזרקה.
- הרדמה את העכבר בתא אינדוקציה המחובר לאידוי איזופלורן עם 3% איזופלורן מעורבב עם 100% חמצן בקצב של כ-0.3 ליטר לדקה.
- אשרו את עומק ההרדמה על ידי היעדר רפלקס צביטה בבוהן בזמן שהנשימה חלקה.
- לגלח את ראש העכבר בין האוזניים באמצעות מכונת גילוח חשמלית. יש למרוח טיפות עיניים משמן כדי למנוע יובש בקרנית במהלך ההליך.
- לאחר מכן, מקם את העכבר במסגרת סטריאוטקסית (ראה טבלת חומרים) עם הצד הגבי למעלה, והאבטח את הראש באמצעות חרוט אף ומהדק שיניים. לשמור על הרדמה עם 1.2%-1.6% איזופלורן דרך האף.
הערה: ניתן להתאים את ריכוז האיזופלוראן בהתאם למצב הנשימה של העכברים.
3. הליך כירורגי
הערה: בעלי חיים מונחים על כרית חימום במהלך כל ההליכים.
- תקן את העכבר למנגנון הסטריאוטקסי עם מוטות אוזניים דו-צדדיים. ודאו כי מוטות האוזניים מישוריים והראש אופקי ויציב.
- יש לחטא את העור שעל הראש על ידי ניגוב מספר פעמים עם יודופור ואחריו אלכוהול בתנועה מעגלית. לאחר מכן השתמש באזמל כדי לחתוך חתך קטן של כ 1.5 ס"מ לאורך קו האמצע של הקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
- נגבו את הגולגולת עם צמר גפן טבול במי חמצן של 1% עד שנחשפו הברגמא, למבדה והפונטנלה האחורית. הניחו את המזרק על המנגנון הסטריאוטקסי.
הערה: השתמש במי חמצן בזהירות והימנע מלגעת ברקמות הסובבות אותה. - הקפידו על מיקום אופקי של ראש החיה (מלפנים ומאחור ושמאל וימינה).
- התאם את ידית ציר ה- Z של המסגרת הסטריאוטקסית כך שקצה המחט והגולגולת פשוט יגעו ללא כיפוף, ולאחר מכן מדוד את קואורדינטת ציר ה- Z. בדוק את קואורדינטות Z של bregma ופונטנל אחורי.
- התאם את מוט האוזן כך שההפרש בין קואורדינטות Z של bregma לבין פונטנל אחורי הוא לא יותר מ- 0.02 מ"מ. לאחר מכן, בצע את אותה שיטה כדי למדוד את קואורדינטות Z של המיקומים המתאימים בצד שמאל וימני של קו האמצע. התאם את מוט האוזן כדי לוודא שהשמאל והימני נמצאים באותה רמה.
- אתר את הקורפוס קלוסום. הגדר את מקור ה- XYZ ל- bregma.
הערה: אתר ההזרקה הראשון הוא 1.0 מ"מ רוחבי לברגמה, עומק 2.4 מ"מ ו-1.1 מ"מ קדמי. אתר ההזרקה השני הוא 1.0 מ"מ רוחבי לברגמה, עומק 2.1 מ"מ ו-0.6 מ"מ קדמי. לדוגמה, הקואורדינטות של הברגמה הן (0,0,0). מדוד את קואורדינטות Z של המיקום המתאים המסומן כ- (-1, 1.1, X) ו- (-1, 0.6, Y). ניתן לקבוע כי קואורדינטת אתר ההזרקה הראשונה של קורפוס קלוסום היא (-1, 1.1, −[X + 2.4]), ואתר ההזרקה השני הוא (-1, 0.6, −[Y + 2.1]). - לאחר קביעת אתר ההזרקה, יש להטביע חותם עם סמן סטרילי על הגולגולת ולרשום את הקואורדינטות.
- קודחים בעדינות את האתר המסומן באמצעות מקדחת גולגולת (ראו טבלת חומרים). הקפידו למנוע דימום.
- הזיזו באיטיות את המחט לקואורדינטות הנתונות והתחילו את ההזרקה. כדי לגרום לקורפוס קלוסום דמילינציה, הזריקו 2 μL של תמיסת LPC (שלב 1.) בכל אתר הזרקה (שלב 3.5.) בקצב של 0.4 μL/min.
- לאחר ההזרקה, שמור את המחט בכל אתר למשך 10 דקות נוספות.
הערה: ודא שהמרווח של שתי זריקות הוא לא יותר מ -20 דקות. - לתפור את העור עם תפר 4-0 ולחכות שהחיה תתעורר תוך 10 דקות. ניהול משככי כאבים לאחר הניתוח בהתאם לתקנות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים.
הערה: ניתן לקבוע את הזמן המומלץ להמתת חסד בהתאם למטרת הניסוי.
4. מיצוי דגימה לדה-מילינציה מוקדית
הערה: לפרטים אודות שלב זה, עיין בדוח14 שפורסם בעבר.
- ממיסים צבע אדום נייטרלי (ראו טבלת חומרים) בתמיסה של 1% בתמיסה של 1% בתמיסת מלח עם חציית פוספט (PBS).
- שעות לפני הקרבת העכברים (לפרטים, ראו הפניה קודמת10), הזריקו 500 μL של 1% צבע אדום נייטרלי ב-PBS על ידי הזרקה תוך-צפקית לכל עכבר.
- בצעו פרפוזיה לבבית12 עם 30 מ"ל של 0.1% PBS מצופה מראש ב-4 מעלות צלזיוס.
- פורסים את המוח ל-1 מ"מ עם תבנית מוח (ראו טבלת חומרים).
- דמיינו את הנגע המוכתם באדום נייטרלי מתחת למיקרוסקופ ונתקו את הנגע.
הערה: הסר כמה שיותר רקמות נורמליות מסביב כדי לשפר את הדיוק של הניתוח הבא. ניתן לבחון את רקמת הנגע באמצעות RT-PCR, מיקרוסקופיית אלקטרונים וניתוחי כתמים מערביים.
5. צביעה היסטולוגית ואימונופלואורסצנציה
- עבור צביעה היסטולוגית ואימונופלואורסצנציה12, לאחר זלוף לב (שלב 4.3.), להסיר את המוח10, לתקן 4% PFA לילה (ב 4 מעלות צלזיוס), ולהתייבש לחלוטין ב 30% סוכרוז.
- חותכים למקטעי מוח קורונליים בקוטר 20 מ"מ באמצעות פרוסה קפואה10 בטמפרטורה קבועה (−20 מעלות צלזיוס).
- השתמשו בפרוסות עבור צביעת לוקסול בכחול מהיר (LFB), אימונופלואורסצנציה וכתם מערבי10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הזרקה דו-נקודתית של ה-LPC הביאה לדה-מילינציה עמידה יותר
LPC מוביל בעיקר לנזק מהיר עם רעילות למילין ומחשוף של שלמות האקסון15. יום ההזרקה נחשב ליום 0. העכברים הוחזקו לתקופה של 10-28 ימים (10 dpi ו-28 dpi). לוקסול צביעה כחולה מהירה (LFB)10 שימשה להערכת אזור הדמילינציה בעכברים בנקודות זמן אלה. במודל ההזרקה הדו-נקודתית, הייתה דמילינציה משמעותית ב-10 dpi בהשוואה לקבוצת ה-sham, מה שמראה כי הזרקה מקומית של LPC יכולה לנטרל בהצלחה את הקורפוס קלוסום. רמה גבוהה יחסית של דמילינציה עדיין קיימת ב-28 dpi, מה שמעיד על דמילינציה מתמשכת ויציבה עקב הזרקת LPC דו-נקודתית (איור 1D-E).
כדי להעריך עוד יותר את אובדן נדן המיאלין, 10 ימים נבחרו כנקודת זמן מרכזית כאשר הדמילינציה ניכרת יחסית. באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית של חלבון בסיסי מיאלין מושפל (dMBP), נצפתה עלייה יוצאת דופן של dMBP בקבוצה המוזרקת LPC ב-10 dpi (איור 1F), מה שמייצג אובדן מיאלין בקורפוס קלוסום. כמו כן, החלבון של רקמת הנגע שהתקבל (שלב 4.) שימש לניתוח הביטוי של MBP על ידי כתם מערבי. לאחר המידול לפי הפרוטוקול, MBP הראה אובדן משמעותי (איור 1G). תוצאות אלה עלו בקנה אחד עם ה-LFB ועם צביעת האימונופלואורסצנציה.
המורפולוגיה של המיאלין בקורפוס קלוסום 10 ימים לאחר הזרקת LPC נצפתה במיקרוסקופ האלקטרונים (רקמת הנגע הופצה על פי שלב 4.). הדה-מיאלינציה הברורה מאמתת את הצלחת הדוגמנות (איור 2).
הזרקת LPC דו-נקודתית השפיעה על התחדשות המיאלין
ההבחנה וההבשלה של אוליגודנדרוציטים (OLGs) ממלאים תפקיד מכריע בתיקון נדן המיאלין ב- MS. התחדשות המיאלין מתרחשת בעיקר על ידי הבחנה בין תאים מקדימים של אוליגודנדרוציטים (OPCs) לאוליגודנדרוציטים מיאלינים. לפיכך, תהליך תיקון המיאלין יושפע ברגע שההבחנה של OPCs ל- OLGs תיחסם. Gst-π הוא הסמן של התבגרות ההבחנה OPC16. לאחר 10 ימים של הזרקת LPC, ניתן לראות על ידי אימונופלואורסצנציה כי ה-Gst-π ירד בהשוואה לקבוצת ה-sham (איור 3A). יחד עם זאת, יכולת ההתפשטות של אוליגודנדרוציטים יכולה לבוא לידי ביטוי ביחס של Ki67 (אוליגודנדרוציטים מתרבים) ו Olig2 (סך כל תאי שושלת אוליגודנדרוציטים)17,18. יחס הלוקליזציה הגבוה יותר של Ki67/ Olig2+ מייצג התפשטות רבה יותר של אוליגודנדרוציטים לאחר 10dpi (איור 3B). תמונות אלה מצביעות על כך שאזור הנגע מנסה לתקן באמצעות הבשלה ושגשוג של OPCs לאחר הזרקת LPC.
הזרקת LPC דו-נקודתית פגעה בזיכרון המרחבי של עכברים
כדי לנתח את יכולת הזיכרון המרחבי של הזרקת LPC בעכברים, נעשה שימוש במבוך המים מוריס (WMM)19 ולא הראה הבדל במהירות השחייה בין עכברים שהוזרקו ל-LPC. עם זאת, כאשר הפלטפורמה הוסרה במבוך המים של מוריס, ההשהיה למציאת הפלטפורמה הנסתרת הצטמצמה (פגיעה בלמידה מרחבית), והזמן שבילה ברביע המטרה גדל (פגיעה בשימור הזיכרון) (איור 4). התוצאות מצביעות על כך שהזיכרון המרחבי של עכברים שעברו דה-מיין נפגע באופן משמעותי במודל הזרקת ה-LPC הדו-נקודתי. מספר בעלי החיים המשמשים בניסויים שונים מופיע בטבלה 1. כל עכבר קיבל הכשרה החל מהיום השני או ביום ה-20.
איור 1: הזרקה דו-נקודתית של הדמילינציה המושרה על-ידי LPC. (A) ייצוג של אתרי ההזרקה (1.0 מ"מ לרוחב, עומק 2.4 מ"מ ו-1.1 מ"מ קדמי). (B) ייצוג אתרי ההזרקה (1.0 מ"מ רוחבי, עומק 2.1 מ"מ ו-0.6 מ"מ קדמי). (C) המחשה של נקודות זמן זיהוי. (ד) זיהוי נגעי החומר הלבן באמצעות צביעת LFB. צביעת LFB ב-10 ימים לאחר ההזרקה (dpi) ו-28 dpi, המציגה דה-מיאלינציה מתמשכת של קורפוס קלוסום (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). (E) כימות אזור הדמילינציה בנקודות זמן שונות. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD, ANOVA חד כיווני ואחריו מבחני ההשוואה המרובים של Bonferroni. ****p < 0.0001, n = 6 לכל קבוצה. (F) תמונות מייצגות של חיסון dMBP בקורפוס קלוסום (סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר). בהשוואה ל-sham, שכמעט ולא היה לו dMBP, ניתן היה לראות dMBP ברור לאחר הזרקת LPC. (G) ניתוח כתם מערבי של ביטוי MBP. MBP הראה הפסד משמעותי לאחר הזרקת LPC. β-אקטין שימש כבקרת הטעינה למדידת ביטוי בסיסי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים מאשרות את מבנה העל-מיאליני בקורפוס קלוסום של ה-sham בהשוואה למבנה ה-demyelinated בעכברים שהוזרקו ל-LPC (סרגל קנה מידה = 1 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הזרקה דו-נקודתית השפיעה על ההבשלה וההתפשטות של OPCs. (A) תמונות מייצגות של GST-π בקורפוס קלוסום של עכברים שהוזרקו ל-SHAM ו-LPC (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר). האדום מסמל GST-π. (B) תמונות מייצגות של לוקליזציה משותפת של Olig2 ו- Ki67 (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר). האדום מסמל את Ki67, והירוק מסמל את אוליג2. התמונות צולמו באמצעות מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית עם קווי לייזר של 488 ננומטר ו-594 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: פגיעה בזיכרון מרחבי הנגרמת על-ידי הזרקת LPC. (A) תמונות מייצגות של נתיב השחייה של העכברים בכל קבוצה בנוכחות הפלטפורמה (שלב הלמידה). (B) תמונות מייצגות של נתיבי השחייה של העכברים בכל קבוצה לאחר הסרת הפלטפורמה (שלב הזיכרון). מספר בעלי החיים המשומשים מופיע בטבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| קבוצה | שאם | קבוצת LPC |
| צביעת LFB | 6 | 12 (10 dpi, 6; 28 dpi, 6) |
| מיקרוסקופיית אלקטרונים | 4 | 4 |
| אם | 6 | 6 |
| כתם מערבי | 4 | 4 |
| מבוך המים מוריס | 12 | 12 |
טבלה 1: מספר בעלי החיים המשמשים לניסויים השונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טרשת נפוצה, מחלה כרונית של מערכת העצבים המרכזית, היא אחד הגורמים השכיחים ביותר לתפקוד נוירולוגי של מבוגרים צעירים בני20. מבחינה קלינית, כ-60%-80% מחולי הטרשת הנפוצה חווים את מעגל ההישנות וההפוגות לפני שהם מפתחים טרשת נפוצה משנית-מתקדמת21,22, ובסופו של דבר היא מובילה לליקויים בתנועה מצטברים ולליקויים קוגניטיביים לאורך זמן23. נכון לעכשיו, אין מודל ניסיוני אחד המכסה את כל מגוון המאפיינים הקליניים, הפתולוגיים או החיסוניים של המחלה24. כדי לדמות את התהליך הפתולוגי והפתוגנזה של טרשת נפוצה בשלבים שונים, ישנם שלושה מודלים נפוצים של בעלי חיים עם היתרונות והמגבלות שלהם, כולל מודל EAE, האכלת בעלי חיים CPZ ומודלים של דמילינציה המושרה על ידי LPC.
בעכברים, EAE מושרה על ידי תגובה חיסונית בעקבות הזרקת אנטיגנים של מיאלין, וכתוצאה מכך הפעלה מיקרוגליאלית וחדירה של לימפוציטים מסוג T ו-B פריווסקולריים, והנזק המיאליני הנלווה אליו קשור לעתים קרובות להישנות המחלה 20,25. הוא מדמה טוב יותר את המאפיינים של תקופת ההישנות-העברה של טרשת נפוצה. עם זאת, יש לו גם כמה מגבלות. לדוגמה, EAE היא בעיקר מחלה המשפיעה על החומר הלבן של חוט השדרה, בעוד ש-MS גורמת בעיקר לדה-מילינציה של קליפת המוח, והמיקום והתזמון של הנגעים הם אקראיים, מה שמקשה על השגת נגעים במדויק19.
CPZ ו-LPC הם החומרים הנפוצים ביותר להשראת מודלים רעילים-מתפרקים. כולם מסוגלים לגרום לדה-לגיטימציה של CNS לאחר הממשל. במודל CPZ, האכלת עכברים צעירים כלאטור קופריזון הנחושת גרמה למוות של אוליגודנדרוציטים ולאחר מכן לדה-מילינציה הפיכה. לאחר הנסיגה של cuprizone, תהליך remyelination ספונטני הופעל בתוך 4 ימים 26,27. CPZ גורם בעיקר לדה-מילינציה נרחבת, בעוד שהזרקת LPC נוטה לכיוון דמילינציה מוקדית. בשל הרעלן והתגובה הדלקתית, הזריקה החד-נקודתית הקלאסית של LPC גורמת לצורה מהירה וניתנת לשחזור גבוהה של דמיאלינציה28.
עם זאת, אף אחד מהמודלים הנ"ל אינו יכול לחקות כראוי את התהליך הפתולוגי של טרשת נפוצה מתקדמת המאופיינת בדה-מילינציה מתמשכת. לכן, הפרוטוקול הנוכחי מציע מודל להזרקה דו-נקודתית של LPC ישירות לתוך קורפוס קלוסום כדי לגרום לדה-מילינציה ארוכת טווח. שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים התאמה אופקית של ראש החיה ואיתור קואורדינטות ההזרקה. בשלב 3.5., יש לוודא תחילה להתאים את רמת ה-bregma והפונטנל האחורי ולאחר מכן להתאים את הרמות השמאלית והימנית. יחד עם זאת, יש לציין כי לאחר התאמת הרמות השמאלית והימנית, יש למקם מחדש את נקודת האפס לפני הפעולות הבאות. שלב זה הוא חיוני מכיוון שהוא קשור ישירות לדיוק המיקום. בשלב 3.6., בעת קביעת הקואורדינטות של ציר Z, יש לוודא כי קצה המחט והגולגולת יישארו במגע מדויק, והחוקר יכול לבחון אם המחט כפופה. בשלב 3.10., המחט נשארת במקומה במשך 10 דקות כדי למנוע מהתרופה לזרום ממעבר המחט.
לפרוטוקול הנוכחי יש כמה מגבלות. בדומה למודלים אחרים של דה-מיאלינציה הנגרמת על-ידי רעילות, היא חסרה את המידול של תהליכים אימונולוגיים. שנית, למרות שמודל ההזרקה הדו-נקודתי יכול לשמור על דמילינציה במשך זמן רב יחסית, הוא עדיין מלווה באופן בלתי נמנע במידה קלה של התחדשות המיאלין ככל שהמחלה מתקדמת לשלב מאוחר יותר. ייתכן שזה לא מודל מתאים יותר להדמיית טרשת נפוצה מתקדמת משנית מאשר מיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (MOG) המושרה על ידי אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית29,30. מודל ההזרקה הקלאסי של LPC בנקודה אחת מייצר רק דמילינציה דלקתית מקומית המלווה בר-מילינציה ספונטנית. מחקרים קודמים הראו כי חדירה של תאי T, תאי B ומקרופאגים לאחר הזרקת LPC היא גורם מפתח בתיקון מיאלין15. עם זאת, בהשוואה למודל ההזרקה הקלאסי, מודל ההזרקה הדו-נקודתית LPC גורם לדה-מילינציה מוקדית מהירה של קורפוס קלוסום ושומר על מידת הדמילינציה במשך תקופה ארוכה יותר עם מעט רמילינציה.
בשל המורכבות של טרשת נפוצה, שלבי מחלה שונים דורשים מודלים שונים כדי להיות מתוארים טוב יותר. הזרקה דו-נקודתית של LPC באמצעות מסגרת סטריאוטקסית היא מודל עכבר ניסיוני יציב, יעיל וניתן לשחזור. מודל זה יכול להוביל לדה-מילינציה ארוכת טווח, מלווה בפחות תיקון מיאלין לאורך זמן. משמעות הדבר היא שניתן להשתמש במודל ההזרקה הדו-נקודתית לא רק כדי לחקור מחלות דה-מילינציה אלא גם כדי לחקור התערבויות בתיקון מיאלין. חוץ מזה, מודל זה יכול בקלות ובמהירות להעריך את הדמילינציה לאחר ההתערבות באמצעות אימונופלואורסצנציה ושיטות היסטולוגיות, ואת תפקוד לקוי קוגניטיבי של טרשת נפוצה יכול לבוא לידי ביטוי על ידי זיכרון מרחבי לקוי של עכברים demyelinated במבחן ההתנהגות. לסיכום, מודל זה של דה-מיאלינציה יציבה יכול להקל על מחקרים פתולוגיים ופרה-קליניים הן על ההתקדמות המשנית של טרשת נפוצה והן על הטרשת הנפוצה המחזירה הישנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענקים: 82071380, 81873743).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
