Summary
Il presente protocollo descrive un'iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico per generare un modello di demielinizzazione stabile e riproducibile nei topi.
Abstract
La segnalazione dei lisofosfolipidi mediata dal recettore contribuisce alla fisiopatologia di diverse malattie neurologiche, in particolare la sclerosi multipla (SM). La lisofosfatidilcolina (LPC) è un lisofosfolipide endogeno associato all'infiammazione e potrebbe indurre un rapido danno con tossicità ai lipidi mielinici, portando alla demielinizzazione focale. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per l'iniezione stereotassica di LPC a due punti che potrebbe causare direttamente una grave demielinizzazione e replicare la lesione da demielinizzazione sperimentale in modo rapido e stabile nei topi mediante procedura chirurgica. Pertanto, questo modello è molto rilevante per le malattie da demielinizzazione, in particolare la SM, e può contribuire al relativo avanzamento della ricerca clinicamente rilevante. Inoltre, l'immunofluorescenza e i metodi di colorazione blu veloce Luxol sono stati utilizzati per rappresentare il decorso temporale della demielinizzazione nel corpo calloso dei topi iniettati con LPC. Inoltre, il metodo comportamentale è stato utilizzato per valutare la funzione cognitiva dei topi dopo la modellazione. Nel complesso, l'iniezione a due punti di lisofosfatidilcolina attraverso un frame stereotassico è un metodo stabile e riproducibile per generare un modello di demielinizzazione nei topi per ulteriori studi.
Introduction
La segnalazione dei lisofosfolipidi mediata dal recettore coinvolge diversi processi fisiologici di quasi tutti i sistemi di organi1. Nel sistema nervoso centrale (SNC), questa segnalazione svolge un ruolo fondamentale nella patogenetà delle malattie neurologiche autoimmuni come la sclerosi multipla (SM). La sclerosi multipla è una malattia cronica immuno-mediata caratterizzata da demielinizzazione patologica e risposta infiammatoria, che causa disfunzione neurologica e deterioramento cognitivo 2,3. Dopo continue recidive e remittenti durante la malattia precoce, la maggior parte dei pazienti alla fine progredisce allo stadio secondario-progressivo, che potrebbe causare danni irreversibili al cervello e conseguente disabilità4. Si ritiene che il segno patologico del decorso secondario-progressivo sia la demielinizzazione delle placche causate da lesioni infiammatorie5. I trattamenti esistenti per la SM possono ridurre significativamente il rischio di recidiva. Tuttavia, non esiste ancora una terapia efficace per il danno demielinizzante a lungo termine causato dalla SM6 progressiva. Pertanto, è necessario un modello stabilmente stabilito e facilmente riproducibile per studiare terapie precliniche che si concentrano sulla degenerazione della sostanza bianca.
La demielinizzazione e la rimielinizzazione sono due importanti processi patologici nello sviluppo della sclerosi multipla. La demielinizzazione è la perdita della guaina mielinica intorno agli assoni indotta da microglia con fenotipi pro-infiammatori7, e porta a una lenta conduzione degli impulsi nervosi e provoca la perdita di neuroni e disturbi neurologici. La rimielinizzazione è una risposta di riparazione endogena mediata da oligodendrociti, in cui i disturbi potrebbero portare a neurodegenerazione e deterioramento cognitivo8. La risposta infiammatoria è cruciale per l'intero processo, influenzando sia il grado di danno mielinico che la riparazione.
Pertanto, un modello animale stabile di demielinizzazione infiammatoria persistente è significativo per un'ulteriore esplorazione delle strategie terapeutiche per la SM. A causa della complessità della SM, sono stati stabiliti vari tipi di modelli animali per imitare le lesioni demielinizzanti in vivo, tra cui l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), i modelli tossico-demielinizzanti, il cuprizone (CPZ) e la lisofosfatidilcolina (LPC)9 . LPC è un lisofosfolipide endogeno associato all'infiammazione e potrebbe indurre un rapido danno con tossicità ai lipidi mielinici, portando alla demielinizzazione focale. Sulla base di precedenti rapporti e ricerche10,11, viene fornito un protocollo dettagliato di iniezione a due punti con alcune modifiche. Generalmente, il classico modello di iniezione LPC a un punto produce solo demielinizzazione locale nel sito di iniezione ed è spesso accompagnato da rimielinizzazione spontanea12,13. Tuttavia, il modello LPC a iniezione a due punti può dimostrare che l'LPC può indurre direttamente demielinizzazione nel corpo calloso del topo e causare demielinizzazione più duratura con poca rigenerazione della mielina.
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Protocol
Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dall'Institute of Animal Care Committee del Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Cina. Per il presente studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6 maschi e femmine (wild type, WT; 20-25 g; 8-10 settimane di età). I topi sono stati ottenuti da fonti commerciali (vedi Tabella dei materiali). I topi sono stati ospitati in una specifica struttura per animali privi di agenti patogeni (SPF) con acqua e cibo forniti ad libitum. Sono stati mantenuti in un periodo alternato di 12 ore di ciclo di luce e buio nelle condizioni standard di temperatura di 22 °C e umidità relativa del 55%-60%.
1. Preparazione della soluzione LPC
- Sciogliere 25 mg di polvere di LPC (vedere Tabella dei materiali) con 250 μL di cloroformio e soluzione mista di metanolo (1:1) per ottenere una soluzione LPC al 10% e trasferirla in un tubo centrifugo da 500 μL.
NOTA: Se l'LPC non è completamente disciolto, posizionare il tubo della centrifuga in un pulitore ad ultrasuoni e ultrasuoni a 40 kHz per ~ 1 ora per ottenere una soluzione uniforme. - Dividere la soluzione in 3 μL/tubo e conservare a -80 °C.
NOTA: la soluzione può essere conservata per ~ 2 anni. - Prima dell'intervento chirurgico, diluire la soluzione (fase 1.2.) con 27 μL di soluzione di NaCl allo 0,9% e mantenere la soluzione a bagnomaria a temperatura costante a 37 °C.
NOTA: Preparare la soluzione poco prima di iniziare l'iniezione.
2. Preparazione chirurgica
- Utilizzare un ago da 32 G, 2 pollici per collegarlo a una siringa da 5 μL (vedere Tabella dei materiali). Assicurarsi che la siringa del microlitro non sia ostruita. Prelevare 5 μL di soluzione LPC per la preparazione dell'iniezione.
- Anestetizzare il mouse in una camera di induzione collegata ad un vaporizzatore isoflurano con il 3% di isoflurano miscelato con ossigeno al 100% ad una velocità di circa 0,3 L/min.
- Confermare la profondità dell'anestesia dalla mancanza del riflesso del pizzico della punta mentre la respirazione è liscia.
- Rasare la testa del mouse tra le orecchie usando un rasoio elettrico. Applicare colliri lubrificanti per prevenire la secchezza corneale durante la procedura.
- Quindi, posizionare il mouse in una cornice stereotassica (vedere Tabella dei materiali) con il lato dorsale verso l'alto e fissare la testa con un cono nasale e un morsetto dentale. Mantenere l'anestesia con 1,2% -1,6% di isoflurano attraverso il naso.
NOTA: La concentrazione di isoflurano può essere regolata in base allo stato respiratorio dei topi.
3. Procedura chirurgica
NOTA: gli animali vengono posizionati su una piastra riscaldante durante tutte le procedure.
- Fissare il mouse all'apparato stereotassico con barre auricolari bilaterali. Assicurarsi che le barre auricolari siano livellate e che la testa sia orizzontale e stabile.
- Disinfettare la pelle della testa pulendo più volte con iodoforo seguito da alcool in movimento circolare. Quindi utilizzare un bisturi per tagliare una piccola incisione di circa 1,5 cm lungo la linea mediana del cuoio capelluto per esporre il cranio.
- Pulire il cranio con un batuffolo di cotone immerso nell'1% di perossido di idrogeno fino a quando la bregma, la lambda e la fontanella posteriore sono esposte. Posizionare la siringa sull'apparecchio stereotassico.
NOTA: Utilizzare il perossido di idrogeno con cura ed evitare di toccare i tessuti circostanti. - Garantire il posizionamento orizzontale della testa dell'animale (sia anteriore che posteriore e sinistra e destra).
- Regolare la manopola dell'asse Z del telaio stereotassico in modo che la punta dell'ago e il cranio tocchino senza piegarsi, quindi misurare la coordinata dell'asse Z. Controllare le coordinate Z di bregma e fontanella posteriore.
- Regolare la barra auricolare in modo che la differenza tra le coordinate Z di bregma e fontanella posteriore non sia superiore a 0,02 mm. Quindi, seguire lo stesso metodo per misurare le coordinate Z delle posizioni corrispondenti sui lati sinistro e destro della linea mediana. Regola la barra delle orecchie per assicurarti che la sinistra e la destra siano allo stesso livello.
- Individuare il corpo calloso. Impostare l'origine XYZ su bregma.
NOTA: il primo sito di iniezione è di 1,0 mm laterale al bregma, profondo 2,4 mm e anteriore di 1,1 mm. Il secondo sito di iniezione è laterale di 1,0 mm rispetto al bregma, profondo 2,1 mm e anteriore di 0,6 mm. Ad esempio, la coordinata del bregma è (0,0,0). Misurare la coordinata Z della posizione corrispondente contrassegnata come (-1, 1.1, X) e (-1, 0.6, Y). Si può determinare che la prima coordinata del sito di iniezione del corpo calloso è (-1, 1.1, −[X + 2.4]), e il secondo sito di iniezione è (-1, 0.6, −[Y + 2.1]). - Una volta determinato il sito di iniezione, fare un segno con un marcatore sterile sul cranio e registrare le coordinate.
- Forare delicatamente il sito contrassegnato con un trapano a teschio (vedere Tabella dei materiali). Fare attenzione ad evitare qualsiasi sanguinamento.
- Spostare lentamente l'ago alle coordinate indicate e iniziare l'iniezione. Per indurre la demielinizzazione del corpo calloso, iniettare 2 μL di soluzione di LPC (fase 1.) in ogni sito di iniezione (fase 3.5.) ad una velocità di 0,4 μL/min.
- Dopo l'iniezione, tenere l'ago in ogni sito per altri 10 minuti.
NOTA: Assicurarsi che l'intervallo di due iniezioni non sia superiore a 20 minuti. - Sutura la pelle con una sutura 4-0 e attendi che l'animale si svegli entro 10 minuti. Somministrare analgesici postoperatoriamente in conformità con le normative istituzionali sulla cura degli animali.
NOTA: Il tempo raccomandato per l'eutanasia può essere determinato in base allo scopo dell'esperimento.
4. Estrazione del campione per la demielinizzazione focale
NOTA: per i dettagli relativi a questo passaggio, consultare il rapporto14 pubblicato in precedenza.
- Sciogliere il colorante rosso neutro (vedere Tabella dei materiali) in una soluzione all'1% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- ore prima di sacrificare i topi (per i dettagli, vedere il riferimento precedente10), iniettare 500 μL di colorante rosso neutro all'1% in PBS mediante iniezione intraperitoneale per ciascun topo.
- Eseguire la perfusione cardiaca12 con 30 ml di PBS allo 0,1% preraffreddati a 4 °C.
- Taglia il cervello in 1 mm con uno stampo cerebrale (vedi Tabella dei materiali).
- Visualizzare la lesione macchiata di rosso neutro al microscopio e dissociare la lesione.
NOTA: Rimuovere il più possibile il tessuto normale circostante per migliorare l'accuratezza dell'analisi successiva. Il tessuto della lesione può essere esaminato con RT-PCR, microscopia elettronica e analisi western blot.
5. Colorazione istologica e immunofluorescenza
- Per la colorazione istologica e l'immunofluorescenza12, dopo la perfusione cardiaca (fase 4.3.), rimuovere il cervello10, fissare in PFA al 4% durante la notte (a 4 °C) e disidratare completamente in saccarosio al 30%.
- Tagliare in sezioni coronali del cervello di 20 mm utilizzando un'affettatricecongelata 10 a temperatura costante (-20 °C).
- Utilizzare le fette per la colorazione Luxol fast blue (LFB), l'immunofluorescenza e il western blot10.
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Representative Results
L'iniezione a due punti dell'LPC ha determinato una demielinizzazione più duratura
LPC porta principalmente a danni rapidi con tossicità alla mielina e scissione dell'integrità dell'assone15. Il giorno dell'iniezione è stato considerato come giorno 0. I topi sono stati conservati per un periodo di 10-28 giorni (10 dpi e 28 dpi). La colorazione Luxol fast blue (LFB)10 è stata utilizzata per valutare l'area di demielinizzazione nei topi in questi punti temporali. Nel modello di iniezione a due punti, c'è stata una demielinizzazione significativa sui 10 dpi rispetto al gruppo sham, dimostrando che l'iniezione localizzata di LPC può demielinare con successo il corpo calloso. Un grado relativamente elevato di demielinizzazione esiste ancora a 28 dpi, indicando una demielinizzazione persistente e stabile dovuta all'iniezione di LPC a due punti (Figura 1D-E).
Per valutare ulteriormente la perdita della guaina mielinica, sono stati selezionati 10 giorni come punto temporale chiave in cui la demielinizzazione è relativamente evidente. Attraverso la colorazione immunofluorescenza della proteina di base della mielina degradata (dMBP), è stato osservato un notevole aumento di dMBP nel gruppo iniettato con LPC a 10 dpi (Figura 1F), che rappresenta la perdita di mielina nel corpo calloso. Inoltre, la proteina del tessuto lesionale ottenuto (fase 4.) è stata utilizzata per analizzare l'espressione di MBP da western blot. Dopo la modellazione secondo il protocollo, MBP ha mostrato una perdita significativa (Figura 1G). Questi risultati erano coerenti con l'LFB e la colorazione di immunofluorescenza.
La morfologia della mielina nel corpo calloso 10 giorni dopo l'iniezione di LPC è stata osservata al microscopio elettronico (il tessuto della lesione è stato estratto secondo il passo 4.). L'ovvia demielinizzazione verifica il successo della modellazione (Figura 2).
L'iniezione di LPC a due punti ha influenzato la rigenerazione della mielina
La differenziazione e la maturazione degli oligodendrociti (OLG) svolgono un ruolo cruciale nella riparazione della guaina mielinica nella SM. La rigenerazione della mielina avviene principalmente differenziando le cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) in oligodendrociti mielinizzanti. Pertanto, il processo di riparazione della mielina sarà influenzato una volta bloccata la differenziazione degli OPC in OLG. Gst-π è il marker della maturazione della differenziazione OPC16. Dopo 10 giorni di iniezione di LPC, si può vedere dall'immunofluorescenza che il Gst-π diminuito rispetto al gruppo sham (Figura 3A). Allo stesso tempo, la capacità di proliferazione degli oligodendrociti può essere riflessa dal rapporto tra Ki67 (gli oligodendrociti proliferano) e Olig2 (cellule totali di lignaggio degli oligodendrociti)17,18. Il più alto rapporto di co-localizzazione Ki67/Olig2+ rappresenta una maggiore proliferazione di oligodendrociti dopo 10dpi (Figura 3B). Queste immagini suggeriscono che l'area della lesione tenta di riparare attraverso la maturazione e la proliferazione delle OPC dopo l'iniezione di LPC.
L'iniezione di LPC a due punti ha compromesso la memoria spaziale dei topi
Per analizzare la capacità di memoria spaziale dell'iniezione di LPC nei topi, è stato utilizzato il labirinto d'acqua Morris (WMM)19 e non ha mostrato alcuna differenza nella velocità di nuoto tra topi sham e iniettati LPC. Tuttavia, quando la piattaforma è stata rimossa nel labirinto d'acqua di Morris, la latenza per trovare la piattaforma nascosta è stata ridotta (apprendimento spaziale compromesso) e il tempo trascorso nel quadrante target è aumentato (ridotta ritenzione della memoria) (Figura 4). I risultati suggeriscono che la memoria spaziale dei topi demielinizzati è significativamente compromessa nel modello di iniezione LPC a due punti. Il numero di animali utilizzati in diversi esperimenti è elencato nella Tabella 1. Ogni topo ha ricevuto una formazione a partire dal giorno 2 o dal giorno 20.
Figura 1: Iniezione a due punti della demielinizzazione indotta da LPC. (A) Rappresentazione dei siti di iniezione (1,0 mm laterali, 2,4 mm di profondità e 1,1 mm anteriori). (B) Rappresentazione dei siti di iniezione (1,0 mm laterali, 2,1 mm di profondità e 0,6 mm anteriori). (C) Illustrazione dei punti temporali di rilevamento. (D) Rilevamento delle lesioni della sostanza bianca tramite colorazione LFB. Colorazione LFB a 10 giorni dopo l'iniezione (dpi) e 28 dpi, che mostra demielinizzazione persistente del corpo calloso (barra della scala = 200 μm). (E) Quantificazione dell'area di demielinizzazione in diversi punti temporali. I dati sono rappresentati come media ± SD, ANOVA unidirezionale seguita dai test di confronto multipli di Bonferroni. ****p < 0,0001, n = 6 per gruppo. (F) Immagini rappresentative di immunocolorazione dMBP nel corpo calloso (barra di scala = 100 μm). Rispetto alla finzione, che non aveva quasi dMBP, il dMBP ovvio poteva essere visto dopo l'iniezione di LPC. (G) Analisi Western blot dell'espressione MBP. MBP ha mostrato una perdita significativa dopo l'iniezione di LPC. β-actina è stata utilizzata come controllo del carico per misurare l'espressione al basale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Le immagini al microscopio elettronico confermano l'ultrastruttura mielinizzata nel corpo calloso di sham rispetto a quello demielinizzato nei topi iniettati con LPC (barra di scala = 1 μm). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: L'iniezione a due punti ha influenzato la maturazione e la proliferazione delle OPC. (A) Immagini rappresentative di GST-π nel corpo calloso di topi iniettati con sham e LPC (barra di scala = 20 μm). Il rosso indica GST-π. (B) Immagini rappresentative della co-localizzazione di Olig2 e Ki67 (barra di scala = 20 μm). Il rosso significa Ki67 e il verde significa Olig2. Le immagini sono state catturate utilizzando un sistema di microscopia confocale con linee laser a 488 nm e 594 nm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Compromissione della memoria spaziale indotta dall'iniezione di LPC. (A) Immagini rappresentative del percorso di nuoto dei topi in ciascun gruppo in presenza della piattaforma (fase di apprendimento). (B) Immagini rappresentative dei percorsi di nuoto dei topi in ciascun gruppo dopo aver rimosso la piattaforma (fase di memoria). Il numero di animali utilizzati è elencato nella tabella 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Gruppo | Finto | Gruppo LPC |
| Colorazione LFB | 6 | 12 (10 dpi, 6; 28 dpi, 6) |
| Microscopia | 4 | 4 |
| Se | 6 | 6 |
| Macchia occidentale | 4 | 4 |
| Labirinto d'acqua di Morrris | 12 | 12 |
Tabella 1: Il numero di animali utilizzati per le diverse prove.
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Discussion
La SM, una malattia demielinizzante cronica del SNC, è una delle cause più comuni di disfunzione neurologica nei giovani adulti20. Clinicamente, circa il 60%-80% dei pazienti con SM sperimenta il ciclo di recidive e remissioni prima di sviluppare una SM21,22 secondaria-progressiva, e alla fine porta a disturbi cumulativi del movimento e deficit cognitivi nel tempo23. Attualmente, nessun singolo modello sperimentale copre l'intera varietà di caratteristiche cliniche, patologiche o immunologiche della malattia24. Per simulare il processo patologico e la patogenesi della SM in diverse fasi, ci sono tre modelli animali demielinizzanti comuni con i loro vantaggi e limiti, tra cui il modello EAE, l'alimentazione degli animali CPZ e i modelli di demielinizzazione indotta da LPC.
Nei topi, l'EAE è indotta da una risposta immunitaria a seguito dell'iniezione di antigeni mielinici, con conseguente attivazione microgliale e infiltrazione dei linfociti T e B perivascolari, e il danno mielinico di accompagnamento è spesso associato alla recidiva della malattia20,25. Simula meglio le caratteristiche del periodo di recidiva-remittenzione della SM. Tuttavia, ha anche diverse limitazioni. Ad esempio, l'EAE è principalmente una malattia che colpisce la sostanza bianca del midollo spinale, mentre la SM causa principalmente demielinizzazione della corteccia cerebrale e la posizione e i tempi delle lesioni sono casuali, rendendo difficile ottenere lesioni con precisione19.
CPZ e LPC sono le sostanze più comunemente utilizzate per indurre modelli tossico-demielinizzanti. Sono tutti in grado di causare demielinizzazione del SNC dopo la somministrazione. Nel modello CPZ, l'alimentazione di topi giovani con il chelante di rame cuprizone ha provocato la morte degli oligodendrociti e la successiva demielinizzazione reversibile. Dopo il ritiro di cuprizone, è stato innescato un processo di rimielinizzazione spontanea entro 4 giorni26,27. CPZ provoca principalmente demielinizzazione estesa, mentre l'iniezione di LPC tende verso la demielinizzazione focale. A causa della tossina e della risposta infiammatoria, la classica iniezione a un punto di LPC innesca una forma rapida e altamente riproducibile di demielinizzazione28.
Tuttavia, nessuno dei modelli di cui sopra può imitare correttamente il processo patologico della SM progressiva caratterizzata da demielinizzazione persistente. Pertanto, il presente protocollo propone un modello per un'iniezione a due punti di LPC direttamente nel corpo calloso per indurre demielinizzazione a lungo termine. I passaggi critici del protocollo includono la regolazione orizzontale della testa dell'animale e la localizzazione delle coordinate di iniezione. Nel passaggio 3.5., è necessario assicurarsi di regolare prima il livello di bregma e fontanella posteriore e quindi regolare i livelli sinistro e destro. Allo stesso tempo, è necessario notare che, dopo aver regolato i livelli sinistro e destro, il punto zero deve essere riposizionato prima delle operazioni successive. Questo passaggio è fondamentale perché è direttamente correlato alla precisione del posizionamento. Nel passaggio 3.6., quando si determinano le coordinate dell'asse Z, è necessario assicurarsi che l'estremità dell'ago e il cranio rimangano in contatto esatto e il ricercatore possa osservare se l'ago è piegato. Nel passaggio 3.10., l'ago rimane in posizione per 10 minuti per evitare che il farmaco fuoriesca dal passaggio dell'ago.
Il presente protocollo presenta alcune limitazioni. Come altri modelli demielinizzanti indotti dalla tossicità, manca la modellazione dei processi immunologici. In secondo luogo, sebbene il modello di iniezione a due punti possa mantenere la demielinizzazione per un tempo relativamente lungo, è ancora inevitabilmente accompagnato da un leggero grado di rigenerazione della mielina mentre la malattia progredisce in una fase successiva. Potrebbe non essere un modello più adatto per simulare la sclerosi multipla secondaria progressiva rispetto all'encefalomielite autoimmune sperimentale indotta da glicoproteina oligodendrocitaria mielinica (MOG)29,30. Il classico modello di iniezione LPC a un punto produce solo demielinizzazione infiammatoria localizzata accompagnata da rimielinizzazione spontanea. Ricerche precedenti hanno dimostrato che l'infiltrazione di cellule T, cellule B e macrofagi dopo l'iniezione di LPC è un fattore chiave nella riparazione della mielina15. Tuttavia, rispetto al modello di iniezione classico, il modello LPC a iniezione a due punti induce una rapida demielinizzazione focale del corpo calloso e mantiene il grado di demielinizzazione per un periodo più lungo con poca rimielinizzazione.
A causa della complessità della SM, diversi stadi della malattia richiedono modelli diversi per essere meglio descritti. L'iniezione a due punti di LPC tramite un telaio stereotassico è un modello murino sperimentale stabile, efficiente e riproducibile. Questo modello può portare a demielinizzazione a lungo termine, accompagnata da una minore riparazione della mielina nel tempo. Ciò significa che il modello di iniezione a due punti può essere utilizzato non solo per studiare le malattie da demielinizzazione, ma anche per studiare gli interventi di riparazione della mielina. Inoltre, questo modello può facilmente e rapidamente valutare la demielinizzazione dopo l'intervento attraverso l'immunofluorescenza e metodi istologici, e la disfunzione cognitiva della SM può essere riflessa dalla compromissione della memoria spaziale dei topi demielinizzati nel test comportamentale. In conclusione, questo modello di demielinizzazione stabile potrebbe facilitare studi patologici e preclinici sia sulla progressione secondaria della SM che sulla SM recidivante-remittente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Sovvenzioni: 82071380, 81873743).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
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