Summary
本プロトコールは、マウスにおいて安定かつ再現可能な脱髄モデルを生成するための定位フレーム を介した リゾホスファチジルコリンの2点注射を記載する。
Abstract
受容体媒介性リゾリン脂質シグナル伝達は、多様な神経疾患、特に多発性硬化症(MS)の病態生理学に寄与する。リゾホスファチジルコリン(LPC)は、炎症に関連する内因性リゾリン脂質であり、ミエリン脂質に対する毒性を伴う迅速な損傷を誘発し、局所脱髄をもたらす可能性がある。ここでは、重度の脱髄を直接引き起こし、外科的処置によってマウスにおいて実験的脱髄傷害を迅速かつ安定に複製することができる定位2点LPC注射のための詳細なプロトコルが提示される。したがって、このモデルは脱髄疾患、特にMSと非常に関連しており、関連する臨床的に関連する研究の進歩に貢献することができる。また、免疫蛍光法およびルクソール高速青色染色法を用いて、LPCを注射したマウスの脳梁における脱髄の経時変化を描写した。さらに、行動法を用いて、モデリング後のマウスの認知機能を評価した。全体として、定位フレーム を介した リゾホスファチジルコリンの2点注射は、さらなる研究のためにマウスにおいて脱髄モデルを生成するための安定的かつ再現性のある方法である。
Introduction
受容体媒介性リゾリン脂質シグナル伝達は、ほとんどすべての器官系の多様な生理学的プロセスを伴う1。中枢神経系(CNS)において、このシグナル伝達は、多発性硬化症(MS)などの自己免疫性神経疾患の病原性において重要な役割を果たしている。多発性硬化症は、病理学的脱髄および炎症反応を特徴とする慢性免疫媒介性障害であり、神経学的機能障害および認知障害を引き起こす2,3。初期の疾患の間に連続的な再発および寛解の後、ほとんどの患者は最終的に二次進行期に進行し、脳に不可逆的な損傷およびその結果生じる障害を引き起こす可能性がある4。二次進行性経過の病理学的特徴は、炎症性病変によって引き起こされる脱髄プラークであると考えられている5。MSの既存の治療法は、再発のリスクを大幅に減らすことができます。しかしながら、進行性MS6によって引き起こされる長期脱髄損傷に対する有効な治療法はまだ存在しない。したがって、白質変性に焦点を当てた前臨床治療薬を研究するためには、安定して確立され、容易に再現可能なモデルが必要である。
脱髄および髄鞘再形成は、多発性硬化症を発症する際の2つの主要な病理学的プロセスである。脱髄は、炎症誘発性表現型7を有するミクログリアによって誘発される軸索周囲のミエリン鞘の喪失であり、神経インパルスの遅い伝導をもたらし、ニューロンおよび神経学的障害の喪失をもたらす。髄鞘再形成は希突起膠細胞によって媒介される内因性修復応答であり、障害は神経変性および認知障害につながる可能性がある8。炎症反応は、ミエリン損傷の程度と修復の両方に影響を及ぼし、プロセス全体にとって重要です。
したがって、持続的な炎症性脱髄の安定した動物モデルは、MSの治療戦略のさらなる探求にとって有意義であるMSの複雑さのために、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)、毒性脱髄モデル、クプリゾン(CPZ)、およびリゾホスファチジルコリン(LPC)を含む、インビボで脱髄病変を模倣する様々なタイプの動物モデルが確立されている9。.LPCは炎症に関連する内因性リゾリン脂質であり、ミエリン脂質に対する毒性を伴う急速な損傷を誘発し、局所脱髄をもたらす可能性がある。以前の報告および研究10,11に基づいて、いくつかの修正を加えた2点注入の詳細なプロトコルが提供される。一般に、古典的な一点LPC注射モデルは、注射部位で局所脱髄のみを生じ、しばしば自発的髄鞘再形成を伴う12,13。しかし、2点注射LPCモデルは、LPCがマウス脳梁において脱髄を直接誘導し、ミエリン再生をほとんど伴わずにより、より耐久性のある脱髄を引き起こすことができることを実証することができる。
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Protocol
すべての動物の処置は、中国華中科技大学同済医科大学の動物ケア研究所委員会によって承認されました。C57BL/6雄雌マウス(野生型、WT;20-25g;8-10週齢)を本研究に使用した。マウスを市販の供給源から入手した( 材料表を参照のこと)。マウスを、水および食物を自由に供給した特定の病原体フリー(SPF)動物施設に収容 した。それらは、22°Cの温度および55%〜60%の相対湿度の標準条件下で、明暗サイクルの交互の12時間周期に保持された。
1. LPC溶液調製
- LPC粉末25mg( 材料表参照)をクロロホルム250μLとメタノール混合溶液(1:1)で溶解し、10%LPC溶液を作り、500μLの遠沈管に移した。
注:LPCが完全に溶解していない場合は、遠沈管を超音波洗浄機に入れ、40kHzで〜1時間超音波処理して均一な溶液を得ます。 - 溶液を3 μL/チューブに分割し、-80 °Cで保存します。
注:ソリューションは〜2年間保存できます。 - 手術前に、溶液を27μLの0.9%NaCl溶液で希釈し(ステップ1.2)、溶液を37°Cの恒温水槽に保管する。
注:注射を開始する直前に溶液を準備してください。
2. 手術準備
- 32 G、2 インチの針を使用して、5 μL シリンジに接続します( 材料表を参照)。マイクロリットルシリンジが遮られていないことを確認します。注射剤の調製のために5μLのLPC溶液を回収する。
- 3%イソフルランと100%酸素を約0.3 L/minの速度で混合したイソフルラン気化器に接続された誘導チャンバ内でマウスを麻酔する。
- 呼吸がスムーズな状態でつま先ピンチ反射の欠如によって麻酔の深さを確認します。
- 電気シェーバーを使用して耳の間のマウスの頭を剃ります。手順中に角膜の乾燥を防ぐために潤滑点眼剤を適用します。
- 次に、マウスを背側を上にした定位フレーム( 材料表を参照)に置き、鼻錐と歯のクランプで頭を固定します。鼻を通して1.2%-1.6%のイソフルランで麻酔を維持します。
注:イソフルラン濃度は、マウスの呼吸状態に応じて調整することができる。
3. 外科手術
注:動物は、すべての手順の間、加熱パッドの上に置かれます。
- マウスを両側イヤーバー付きの定位装置に固定します。イヤーバーが水平で、頭が水平で安定していることを確認します。
- ヨードフォアで数回拭き取り、続いてアルコールを円運動させて頭の皮膚を消毒します。次に、メスを使用して頭皮の正中線に沿って約1.5cmの小さな切開部を切断し、頭蓋骨を露出させます。
- ブレグマ、ラムダ、および後部フォンタネルが露出するまで、1%過酸化水素に浸した綿棒で頭蓋骨を拭きます。シリンジを定位装置の上に置きます。
注:過酸化水素は注意して使用し、周囲の組織に触れないでください。 - 動物の頭の水平位置(前後と左右の両方)を確認してください。
- 定位フレームのZ軸ノブを調整して、針先と頭蓋骨が曲がらずにちょうど触れるようにしてから、Z軸座標を測定します。ブレグマと後部フォンタネルのZ座標を確認してください。
- ブレグマと後部フォンタネルのZ座標の差が0.02mm以下になるようにイヤーバーを調整します。そして、同様の方法に従い、正中線の左右両側における対応する位置のZ座標を測定した。イヤーバーを調整して、左右が同じレベルになるようにします。
- 脳梁を見つけます。XYZ の原点をブレグマに設定します。
注:最初の注射部位は、ブレグマの横方向1.0mm、深さ2.4mm、および前方1.1mmである。第2の注射部位は、ブレグマの側方1.0mm、深さ2.1mm、および前部0.6mmである。たとえば、ブレグマの座標は (0,0,0) です。(-1, 1.1, X) および (-1, 0.6, Y) としてマークされた対応する位置の Z 座標を測定します。脳梁の第1の注射部位座標は(-1, 1.1, -[X+2.4])であり、第2の注射部位は(-1, 0.6, -[Y+2.1])であると求めることができる。 - 注射部位が決まったら、頭蓋骨に滅菌マーカーで印を付け、座標を記録します。
- 頭蓋骨ドリルでマークされた部位を静かに掘削します( 材料表を参照)。出血を避けるように注意してください。
- 針を指定された座標までゆっくりと動かし、注射を開始します。脳梁脱髄を誘導するには、LPC溶液2 μLを各注射部位(ステップ3.5)に0.4 μL/minの速度で注入します。
- 注射後、針を各部位にさらに10分間保持する。
注:2回の注射の間隔が20分を超えないようにしてください。 - 4-0縫合糸で皮膚を縫合し、動物が10分以内に目を覚ますのを待ちます。鎮痛薬は、施設の動物ケア規則に従って術後に投与する。
注:安楽死の推奨時間は、実験の目的に応じて決定することができます。
4. 局所脱髄のためのサンプル抽出
注: この手順の詳細については、以前に発行されたレポート14 を参照してください。
- 中性赤色染料( 材料表を参照)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の1%溶液に溶解する。
- マウスを犠牲にする数時間前(詳しくは、前の参考文献10を参照のこと)に、各マウスの腹腔内注射によりPBS中の1%中性赤色色素500μLを注射する。
- 心臓灌流12 を4°Cで予冷した30mLの0.1% PBSで行う。
- 脳型で脳を1mmにスライスします( 材料表を参照)。
- ニュートラルレッドに染色された病変部を顕微鏡下で可視化し、病変部を解離させる。
注:その後の分析の精度を向上させるために、周囲の正常組織をできるだけ取り除きます。病変組織は、RT-PCR、電子顕微鏡、およびウェスタンブロット分析で検査することができます。
5. 組織学的染色と免疫蛍光
- 組織学的染色および免疫蛍光12の場合、心臓灌流後(ステップ4.3)、脳10を取り出し、4%PFA中で一晩(4°Cで)固定し、30%スクロース中で完全に脱水した。
- 凍結スライサー10を用いて一定温度(−20°C)で20mm 冠状脳切片に切断した。
- スライスをルクソールファストブルー(LFB)染色、免疫蛍光、およびウェスタンブロット10に使用します。
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Representative Results
LPCの2点注射は、より耐久性のある脱髄をもたらした
LPCは主に、ミエリンに対する毒性および軸索完全性の切断を伴う急速な損傷をもたらす15。注射の日を0日目とした。マウスを10〜28日間(10dpiおよび28dpi)の期間保存した。ルクソールファストブルー(LFB)染色10を用いて、これらの時点におけるマウスにおける脱髄の面積を評価した。2点注射モデルでは、偽群と比較して10dpiで有意な脱髄があり、LPCの局所注入が脳梁を首尾よく脱髄できることを示した。比較的高い脱髄度が28dpiで依然として存在し、2点LPC注射による持続的かつ安定した脱髄を示す(図1D-E)。
ミエリン鞘の喪失をさらに評価するために、脱髄が比較的明らかとなる重要な時点として10日間を選択した。分解されたミエリン塩基性タンパク質(dMBP)を免疫蛍光染色することにより、LPC注射群において10dpiでdMBPの顕著な増加が観察され(図1F)、これは脳梁におけるミエリン喪失を表す。また、得られた病変組織のタンパク質(工程4)を用いて、ウェスタンブロットによりMBPの発現を解析した。プロトコールに従ってモデリングした後、MBPは有意な損失を示した(図1G)。これらの結果は、LFBおよび免疫蛍光染色と一致した。
LPC注入後10日目の脳梁におけるミエリンの形態を電子顕微鏡で観察した(工程4に従って病変組織を抽出した。明らかな脱髄は、モデリングの成功を検証します(図2)。
2点LPC注射はミエリン再生に影響を与えた
希突起膠細胞(OLG)の分化および成熟は、MSにおけるミエリン鞘の修復において重要な役割を果たしているミエリン再生は、主に希突起膠細胞前駆細胞(OPC)を髄髄性希突起膠細胞に分化させることによって起こる。したがって、ミエリン修復プロセスは、OPCのOLGへの分化がブロックされると影響を受ける。Gst-πはOPC分化成熟16のマーカーである。LPC注射の10日後、偽群と比較してGst−πが減少したことが免疫蛍光によって分かる(図3A)。同時に、希突起膠細胞の増殖能は、Ki67(希突起膠細胞が増殖する)とOlig2(希突起膠細胞系譜細胞全体)の比率によって反映され得る17,18。Ki67/Olig2+共局在比が高いほど、10dpi後の希突起膠細胞の増殖が進んでいることを表します(図3B)。これらの画像は、病変領域がLPC注射後のOPCの成熟および増殖を通じて修復を試みることを示唆する。
2点LPC注射はマウスの空間記憶を損なった
マウスにおけるLPC注射の空間記憶能力を分析するために、モリス水迷路(WMM)19 を使用し、偽マウスとLPC注射マウスの間で遊泳速度に差を示さなかった。しかし、プラットフォームがMorrisの水迷路で取り除かれると、隠れたプラットフォームを見つけるまでの待ち時間が短縮され(空間学習が損なわれ)、ターゲット象限で費やされた時間が増加し(メモリ保持の障害)、(図4)。この結果は、脱髄マウスの空間記憶が2点LPC注射モデルにおいて有意に損なわれることを示唆している。異なる実験に用いた動物の数を 表1に列挙する。各マウスは、2日目または20日目からトレーニングを受けた。
図1:LPC誘発脱髄の2点注射(A)注射部位(側方1.0mm、深さ2.4mm、前部1.1mm)の表現。(B)注射部位(横方向1.0mm、深さ2.1mm、前部0.6mm)の表現。(C)検出時点の説明図。(d)LFB染色による白質病変の検出。LFB染色は、注射後10日目(dpi)および28dpiで、脳梁の持続的な脱髄を示す(スケールバー=200μm)。(e)異なる時点における脱髄領域の定量化。データは、SD、一元配置分散分析、ボンフェローニの多重比較検定±続く平均として表されます。****p < 0.0001、n = 6 グループあたり。(f)脳梁におけるdMBP免疫染色の代表的な画像(スケールバー=100μm)。dMBPがほとんどなかった偽物と比較して、LPC注入後に明らかなdMBPが見られました。(g)MBP発現のウェスタンブロット解析。MBPはLPCの注入後に有意な損失を示した。βアクチンをベースライン発現を測定するためのローディングコントロールとして使用した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:電子顕微鏡画像は、LPC注射マウスの脱髄されたものと比較して、偽脳梁の有髄超微細構造を確認する(スケールバー= 1μm)。 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:2点注射はOPCの成熟および増殖に影響を与えた。 (A)偽マウスおよびLPC注射マウスの脳梁におけるGST πの代表的な画像(スケールバー= 20μm)。赤はGST πを示します。(B)Olig2とKi67の共局在化の代表的な画像(スケールバー=20μm)。赤はKi67、緑はOlig2を表します。画像は、488nmおよび594nmのレーザーラインを有する共焦点顕微鏡システムを用いて撮影された。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:LPC注入によって誘発される空間記憶障害。(A)プラットフォームの存在下における各群におけるマウスの遊泳経路の代表的な画像(情報相)。(b)プラットフォームを取り外した後の各群におけるマウスの遊泳経路の代表的な画像(記憶相)。使用した動物数を 表1に列挙する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 群 | 真似事 | LPCグループ |
| LFB染色 | 6 | 12 (10 dpi, 6; 28 dpi, 6) |
| 電子顕微鏡 | 4 | 4 |
| もし | 6 | 6 |
| ウェスタンブロット | 4 | 4 |
| モリス水迷路 | 12 | 12 |
表1:異なる試験に使用した動物の数。
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Discussion
中枢神経系の慢性脱髄疾患であるMSは、若年成人20における神経機能障害の最も一般的な原因の1つです。臨床的には、MS患者の約60%〜80%が、二次進行性MSを発症する前に再発および寛解のサイクルを経験し21,22、そしてそれは最終的に時間の経過とともに累積的な運動障害および認知障害をもたらす23。現在、疾患の臨床的、病理学的、または免疫学的特徴の多様性全体をカバーする単一の実験モデルは存在しない24。異なる段階でのMSの病理学的プロセスおよび病因をシミュレートするために、EAEモデル、給餌動物CPZ、およびLPC誘発脱髄モデルを含む、利点および限界を有する3つの一般的な脱髄動物モデルがある。
マウスにおいて、EAEはミエリン抗原の注射後の免疫応答によって誘導され、ミクログリア活性化および血管周囲TおよびBリンパ球の浸潤をもたらし、付随するミエリン損傷はしばしば疾患の再発と関連している20、25。MS再発寛解期間の特性をよりよくシミュレートします。ただし、いくつかの制限もあります。例えば、EAEは主に脊髄の白質に影響を及ぼす疾患であるのに対し、MSは主に大脳皮質の脱髄を引き起こし、病変の位置やタイミングがランダムであるため、病変を正確に得ることは困難である19。
CPZおよびLPCは、毒性脱髄モデルを誘導するために最も一般的に使用される物質である。それらはすべて、投与後にCNS脱髄を引き起こすことができる。CPZモデルでは、若いマウスに銅キレート化クプリゾンを給餌すると、希突起膠細胞死およびその後の可逆的脱髄がもたらされた。クプリゾンの離脱後、4日以内に自発的な髄鞘再形成プロセスが引き起こされた26,27.CPZは主に広範な脱髄をもたらすが、LPC注射は局所脱髄に向かって傾斜する。毒素および炎症反応のために、LPCの古典的な一点注射は、迅速かつ再現性の高い形態の脱髄を誘発する28。
しかしながら、上記のモデルのいずれも、持続的な脱髄を特徴とする進行性MSの病理学的過程を適切に模倣することはできない。したがって、本プロトコールは、LPCを脳梁に直接2点注入して長期脱髄を誘導するためのモデルを提案する。プロトコルの重要なステップには、動物の頭の水平調整と注射座標の位置決めが含まれます。ステップ3.5では、最初にブレグマと後部フォンタネルのレベルを調整してから、左右のレベルを調整する必要があります。同時に、左右のレベルを調整した後、後続の操作の前にゼロ点を再配置する必要があることに注意する必要があります。このステップは、位置決めの精度に直接関係するため、非常に重要です。ステップ3.6では、Z軸の座標を決定する際に、針の端と頭蓋骨が正確に接触したままであり、研究者は針が曲がっているかどうかを観察できることを確認する必要があります。ステップ3.10では、薬物が針路から流出するのを防ぐために、針は10分間所定の位置にとどまります。
現在のプロトコルにはいくつかの制限があります。他の毒性誘発脱髄モデルと同様に、免疫学的プロセスのモデリングを欠いている。第二に、2点注射モデルは脱髄を比較的長期間維持することができるが、疾患が後の段階に進行するにつれて、依然として必然的にわずかな程度のミエリン再生を伴う。ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質(MOG)誘発実験的自己免疫性脳脊髄炎よりも二次進行性多発性硬化症をシミュレートするためのより適切なモデルではないかもしれない29、30。古典的な一点LPC注射モデルは、自発的な髄鞘再形成を伴う局所的な炎症性脱髄のみを生じる。これまでの研究では、LPC注射後のT細胞、B細胞、マクロファージの浸潤がミエリン修復の重要な要素であることが示されています15。しかし、古典的な注射モデルと比較して、2点注射LPCモデルは、脳梁の迅速な局所脱髄を誘導し、髄鞘再形成をほとんど伴わずに脱髄の程度を長期間維持する。
MSの複雑さのために、異なる疾患段階は、異なるモデルがよりよく記述される必要がある。定位フレーム を介した LPCの2点注入は、安定で効率的で再現可能な実験マウスモデルである。このモデルは、長期間の脱髄をもたらし得、時間の経過とともにより少ないミエリン修復を伴う。つまり、2点注射モデルは、脱髄疾患の研究だけでなく、ミエリン修復介入の研究にも使用できる。さらに、このモデルは、免疫蛍光および組織学的方法を介して介入後の脱髄を容易かつ迅速に評価することができ、MSの認知機能障害は、行動試験における脱髄マウスの空間記憶障害によって反映され得る。結論として、安定した脱髄のこのモデルは、MSの二次進行および再発寛解型MSの両方に関する病理学的および前臨床試験を容易にする可能性がある。
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Disclosures
著者らには開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金:82071380、81873743)の支援を受けました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
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