本プロトコールは、マウスにおいて安定かつ再現可能な脱髄モデルを生成するための定位フレーム を介した リゾホスファチジルコリンの2点注射を記載する。
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この記事について
サマリー
要約
受容体媒介性リゾリン脂質シグナル伝達は、多様な神経疾患、特に多発性硬化症(MS)の病態生理学に寄与する。リゾホスファチジルコリン(LPC)は、炎症に関連する内因性リゾリン脂質であり、ミエリン脂質に対する毒性を伴う迅速な損傷を誘発し、局所脱髄をもたらす可能性がある。ここでは、重度の脱髄を直接引き起こし、外科的処置によってマウスにおいて実験的脱髄傷害を迅速かつ安定に複製することができる定位2点LPC注射のための詳細なプロトコルが提示される。したがって、このモデルは脱髄疾患、特にMSと非常に関連しており、関連する臨床的に関連する研究の進歩に貢献することができる。また、免疫蛍光法およびルクソール高速青色染色法を用いて、LPCを注射したマウスの脳梁における脱髄の経時変化を描写した。さらに、行動法を用いて、モデリング後のマウスの認知機能を評価した。全体として、定位フレーム を介した リゾホスファチジルコリンの2点注射は、さらなる研究のためにマウスにおいて脱髄モデルを生成するための安定的かつ再現性のある方法である。
概要
受容体媒介性リゾリン脂質シグナル伝達は、ほとんどすべての器官系の多様な生理学的プロセスを伴う1。中枢神経系(CNS)において、このシグナル伝達は、多発性硬化症(MS)などの自己免疫性神経疾患の病原性において重要な役割を果たしている。多発性硬化症は、病理学的脱髄および炎症反応を特徴とする慢性免疫媒介性障害であり、神経学的機能障害および認知障害を引き起こす2,3。初期の疾患の間に連続的な再発および寛解の後、ほとんどの患者は最終的に二次進行期に進行し、脳に不可逆的な損傷およびその結果生じる障害を引き起こす可能性がある4。二次進行性経過の病理学的特徴は、炎症性病変によって引き起こされる脱髄プラークであると考えられている5。MSの既存の治療法は、再発のリスクを大幅に減らすことができます。しかしながら、進行性MS6によって引き起こされる長期脱髄損傷に対する有効な治療法はまだ存在しない。したがって、白質変性に焦点を当てた前臨床治療薬を研究するためには、安定して確立され、容易に再現可能なモデルが必要である。
脱髄および髄鞘再形成は、多発性硬化症を発症する際の2つの主要な病理学的プロセスで....
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プロトコル
すべての動物の処置は、中国華中科技大学同済医科大学の動物ケア研究所委員会によって承認されました。C57BL/6雄雌マウス(野生型、WT;20-25g;8-10週齢)を本研究に使用した。マウスを市販の供給源から入手した( 材料表を参照のこと)。マウスを、水および食物を自由に供給した特定の病原体フリー(SPF)動物施設に収容 した。それらは、22°Cの温度および55%〜60%の相対湿度の標準条件下で、明暗サイクルの交互の12時間周期に保持された。
1. LPC溶液調製
- LPC粉末25mg( 材料表参照)をクロロホルム250μLとメタノール混合溶液(1:1)で溶解し、10%LPC溶液を作り、500μLの遠沈管に移した。
注:LPCが完全に溶解していない場合は、遠沈管を超音波洗浄機に入れ、40kHzで〜1時間超音波処理して均一な溶液を得ます。 - 溶液を3 μL/チューブに分割し、-80 °Cで保存します。
注:ソリューションは〜2年間保存できます。 - 手術前に、溶液を27μLの0.9%NaCl溶液で希釈し(ステップ1.2)、溶液を37°Cの恒温水槽に保管する。
注:注射を開始する直前に溶液を準備してください。
2.....
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結果
LPCの2点注射は、より耐久性のある脱髄をもたらした
LPCは主に、ミエリンに対する毒性および軸索完全性の切断を伴う急速な損傷をもたらす15。注射の日を0日目とした。マウスを10〜28日間(10dpiおよび28dpi)の期間保存した。ルクソールファストブルー(LFB)染色10を用いて、これらの時点におけるマウスにおける脱髄の面積を評価した。2点注射モデルでは、偽群と比較して10dpiで有意な脱髄があり、LPCの局所注入が脳梁を首尾よく脱髄できることを示した。比較的高い脱髄度が28dpiで依然として存在し、2点LPC注射による持続的かつ安定した脱髄を示す(図1D-E)。
ミエリン鞘の喪失をさらに評価するために、脱髄が比較的明らかとなる重要な時点として10日間を選択した。分解されたミエリン塩基性タンパク質(dMBP)を免疫蛍光.......
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ディスカッション
中枢神経系の慢性脱髄疾患であるMSは、若年成人20における神経機能障害の最も一般的な原因の1つです。臨床的には、MS患者の約60%〜80%が、二次進行性MSを発症する前に再発および寛解のサイクルを経験し21,22、そしてそれは最終的に時間の経過とともに累積的な運動障害および認知障害をもたらす23。現在、疾患の臨床的、病理学的、または免疫学的特徴の多様性全体をカバーする単一の実験モデルは存在しない24。異なる段階でのMSの病理学的プロセスおよび病因をシミュレートするために、EAEモデル、給餌動物CPZ、およびLPC誘発脱髄モデルを含む、利点および限界を有する3つの一般的な脱髄動物モデルがある。
マウスにおいて、EAEはミエリン抗原の注射後の免疫応答によって誘導され、ミクログリア活性化および血管周囲TおよびBリンパ球の浸潤をもた.......
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開示事項
著者らには開示するものは何もありません。
謝辞
この研究は、中国国家自然科学財団(助成金:82071380、81873743)の支援を受けました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| L-α-卵黄からのリゾホスファチジルコリン | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32ゲージニードル | ハミルトン | 7762-05 | |
| 10 μlシリンジ | ハミルトン | 80014 | |
| 高速頭蓋骨ドリル | strong、韓国 | strong204 | |
| ドリル | ヘイガー&ドイツ、マイジンガー | 参照 500 104 001 001 005 | |
| Matrx 動物無害換気装置 | MIDMARK | VMR | |
| マウス用ポータブル定位固定装置 | 報酬 | 68507 | |
| マイクロシリンジ | 報酬 | KDS LEGATO 130 | |
| イソフルラン | VETEASY | ||
| パラホルムアルデヒド | Servicebio | G1101 | |
| リン酸塩緩衝液 | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL高速ブルーサービス | バイオ | G1030-100ML | |
| 縫合 | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| 脳型 | 報酬 | 68707 | |
| 電子顕微鏡固定剤 | Servicebio | G1102-100ML | |
| ニュートラルレッド (C.I. 50040)、顕微鏡用 Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| 抗ミエリン塩基性タンパク質抗体 | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal 抗体 (SolA15) | Thermo Fisher サイエンティフィック | 14-5698-95 | |
| ベータアクチンモノクローナル抗体 | プロテインテック | 66009-1-IG | |
| ミエリン塩基性タンパク質ポリクローナル抗体 | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 ポリクローナル抗体 | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 アフィニピュア ロバ反ウサギ IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| アレクサフロー 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP ヤギ抗ウサギ IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP ヤギ抗マウス IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| 成体 C57BL/6 オスとメスのマウス | 湖南省 SJA Laboratory Animal Co., Ltd |
参考文献
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864(2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet
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