Summary
Настоящий протокол описывает двухточечную инъекцию лизофосфатидилхолина через стереотаксическую рамку для создания стабильной и воспроизводимой модели демиелинизации у мышей.
Abstract
Рецептор-опосредованная лизофосфолипидная сигнализация способствует патофизиологии различных неврологических заболеваний, особенно рассеянного склероза (РС). Лизофосфатидилхолин (LPC) является эндогенным лизофосфолипидом, связанным с воспалением, и он может вызывать быстрое повреждение с токсичностью липидов миелина, что приводит к очаговому демиелинизации. Здесь представлен подробный протокол стереотаксической двухточечной инъекции LPC, которая может непосредственно вызвать тяжелую демиелинизацию и быстро и стабильно воспроизвести экспериментальную демиелинизацию у мышей с помощью хирургической процедуры. Таким образом, эта модель очень актуальна для демиелинических заболеваний, особенно РС, и она может способствовать соответствующему продвижению клинически значимых исследований. Кроме того, иммунофлуоресценция и методы быстрого синего окрашивания Luxol были использованы для изображения временного хода демиелинизации в мозолистом теле мышей, которым вводили LPC. Кроме того, поведенческий метод использовался для оценки когнитивной функции мышей после моделирования. В целом, двухточечная инъекция лизофосфатидилхолина через стереотаксическую рамку является стабильным и воспроизводимым методом создания модели демиелинизации у мышей для дальнейшего изучения.
Introduction
Рецептор-опосредованная передача лизофосфолипидов включает в себя разнообразные физиологические процессы практически всех систем органов1. В центральной нервной системе (ЦНС) эта сигнализация играет решающую роль в патогенах аутоиммунных неврологических заболеваний, таких как рассеянный склероз (РС). Рассеянный склероз является хроническим иммуноопосредованным расстройством, характеризующимся патологической демиелинизацией и воспалительной реакцией, вызывающей неврологическую дисфункцию и когнитивные нарушения 2,3. После непрерывного рецидива и ремиттирования во время раннего заболевания большинство пациентов в конечном итоге прогрессируют до вторично-прогрессирующей стадии, что может привести к необратимому повреждению мозга и, как следствие, инвалидности4. Считается, что патологической отличительной чертой вторично-прогрессирующего течения являются демиелинизирующие бляшки, вызванные воспалительными поражениями5. Существующие методы лечения РС могут значительно снизить риск рецидива. Тем не менее, до сих пор нет эффективной терапии для долгосрочного демиелинизирующего повреждения, вызванного прогрессирующимMS 6. Таким образом, стабильно установленная и легко воспроизводимая модель требуется для изучения доклинических терапевтических средств, которые фокусируются на дегенерации белого вещества.
Демиелинизация и ремиелинизация являются двумя основными патологическими процессами при развитии рассеянного склероза. Демиелинизация - это потеря миелиновой оболочки вокруг аксонов, индуцированная микроглией с провоспалительными фенотипами7, и это приводит к медленной проводимости нервных импульсов и приводит к потере нейронов и неврологическим расстройствам. Ремиелинизация представляет собой эндогенную реакцию репарации, опосредованную олигодендроцитами, где расстройства могут привести к нейродегенерации и когнитивным нарушениям8. Воспалительная реакция имеет решающее значение для всего процесса, влияя как на степень повреждения миелина, так и на восстановление.
Таким образом, стабильная животная модель стойкой воспалительной демиелинизации имеет значение для дальнейшего изучения терапевтических стратегий для РС. Из-за сложности РС были установлены различные типы моделей животных для имитации демиелинизирующих поражений in vivo, включая экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (EAE), токсико-демиелинизирующие модели, купризон (CPZ) и лизофосфатидилхолин (LPC)9 . LPC является эндогенным лизофосфолипидом, связанным с воспалением, и он может вызывать быстрое повреждение с токсичностью липидов миелина, что приводит к очаговой демиелинизации. На основе предыдущих отчетов и исследований10,11 приведен подробный протокол двухточечной инъекции с некоторыми модификациями. Как правило, классическая одноточечная модель инъекции LPC производит только местную демиелинизацию в месте инъекции и часто сопровождается спонтанной ремиелинизацией12,13. Тем не менее, двухточечная инъекционная модель LPC может продемонстрировать, что LPC может непосредственно индуцировать демиелинизацию в мозолистом теле мыши и вызывать более длительную демиелинизацию с небольшой регенерацией миелина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры для животных были одобрены Комитетом института по уходу за животными Медицинского колледжа Тунцзи, Университет науки и технологии Хуачжун, Китай. Для настоящего исследования использовались взрослые самцы и самки мышей C57BL/6 (дикий тип, WT; 20-25 г; 8-10 недель). Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов). Мышей размещали в специальном животном учреждении без патогенов (SPF) с водой и пищей, поставляемой ad libitum. Их выдерживали в чередующемся 12-часовом периоде светлого и темного цикла в стандартных условиях температуры 22 °С и относительной влажности воздуха 55%-60%.
1. Приготовление раствора LPC
- Растворить 25 мг порошка LPC (см. Таблицу материалов) с 250 мкл смешанного раствора хлороформа и метанола (1:1), чтобы получить 10% раствор LPC и перенести его в центрифужную трубку объемом 500 мкл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если LPC не полностью растворен, поместите трубку центрифуги в ультразвуковой очиститель и ультразвук на частоте 40 кГц в течение ~ 1 ч для получения однородного раствора. - Разделить раствор на 3 мкл/пробирку и хранить при температуре −80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может храниться ~2 года. - Перед операцией раствор разбавляют (стадия 1.2.) 27 мкл 0,9% раствора NaCl, и держат раствор на водяной бане постоянной температуры при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор непосредственно перед началом инъекции.
2. Хирургическая подготовка
- Используйте иглу 32 г, 2 дюйма для подключения к шприцу объемом 5 мкл (см. Таблицу материалов). Убедитесь, что микролитровый шприц беспрепятственный. Выводят 5 мкл раствора LPC для приготовления инъекций.
- Обезболивают мышь в индукционной камере, подключенной к испарителю изофлурану 3% изофлурану, смешанному со 100% кислородом со скоростью около 0,3 л/мин.
- Подтвердите глубину анестезии отсутствием рефлекса защемления пальцев ног при плавном дыхании.
- Побрить головку мыши между ушами с помощью электробритвы. Наносите смазывающие глазные капли, чтобы предотвратить сухость роговицы во время процедуры.
- Затем поместите мышь в стереотаксическую рамку (см. Таблицу материалов) спинной стороной вверх и закрепите голову носовым конусом и зубным зажимом. Поддерживайте анестезию с 1,2% -1,6% изофлурана через нос.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация изофлурана может быть скорректирована в соответствии с респираторным статусом мышей.
3. Хирургическая процедура
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные помещаются на грелку во время всех процедур.
- Прикрепите мышь к стереотаксическому аппарату с помощью двусторонних ушных вкладышей. Убедитесь, что ушные вкладыши ровные, а голова горизонтальная и устойчивая.
- Дезинфицируйте кожу на голове, протирая несколько раз йодофором с последующим спиртом круговыми движениями. Затем используйте скальпель, чтобы разрезать небольшой разрез около 1,5 см вдоль средней линии кожи головы, чтобы обнажить череп.
- Протрите череп ватным тампоном, смоченным в 1% перекиси водорода, пока не обнажаются брегма, лямбда и задний родничок. Поместите шприц на стереотаксический аппарат.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перекись водорода с осторожностью и избегайте прикосновения к окружающим тканям. - Обеспечьте горизонтальное расположение головы животного (как спереди, так и сзади, а также влево и вправо).
- Отрегулируйте ручку оси Z стереотаксической рамки так, чтобы кончик иглы и череп просто соприкасались без изгиба, затем измерьте координату оси Z. Проверьте координаты Z брегмы и заднего родничка.
- Отрегулируйте ушную перекладину так, чтобы разница между Z-координатами брегмы и заднего родничка составляла не более 0,02 мм. Затем следуйте тому же методу, чтобы измерить Z-координаты соответствующих позиций на левой и правой сторонах средней линии. Отрегулируйте амбушюру, чтобы левая и правая были на одном уровне.
- Найдите мозолистое тело. Задайте для источника XYZ значение bregma.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первый участок инъекции находится на расстоянии 1,0 мм сбоку от брегмы, глубиной 2,4 мм и передней частью 1,1 мм. Второе место инъекции составляет 1,0 мм сбоку от брегмы, глубиной 2,1 мм и передней частью 0,6 мм. Например, координата брегмы (0,0,0). Измерьте координату Z соответствующего местоположения, обозначенного как (-1, 1.1, X) и (-1, 0,6, Y). Можно определить координату первого места инъекции мозолистого тела (-1, 1,1, −[X + 2,4]), а второго места инъекции — (-1, 0,6, −[Y + 2,1]). - Как только место инъекции определено, сделайте отметку стерильным маркером на черепе и запишите координаты.
- Аккуратно просверлите отмеченный участок с помощью сверла черепа (см. Таблицу материалов). Позаботьтесь о том, чтобы избежать кровотечения.
- Медленно переместите иглу к заданным координатам и начните инъекцию. Чтобы индуцировать демиелинизацию мозолистого тела, вводят 2 мкл раствора LPC (стадия 1.) в каждое место инъекции (стадия 3.5.) со скоростью 0,4 мкл/мин.
- После инъекции держите иглу в каждом месте в течение дополнительных 10 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что интервал двух инъекций составляет не более 20 мин. - Зашить кожу швом 4-0 и подождать, пока животное проснется в течение 10 минут. Вводите анальгетики после операции в соответствии с институциональными правилами ухода за животными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое время для эвтаназии может быть определено в соответствии с целью эксперимента.
4. Извлечение проб для фокальной демиелинизации
ПРИМЕЧАНИЕ: Подробную информацию об этом шаге см. в ранее опубликованном докладе14.
- Растворить нейтральный красный краситель (см. Таблицу материалов) в 1% растворе в фосфат-буферном физиологическом растворе (PBS).
- за несколько часов до жертвоприношения мышей (подробности см. в предыдущей ссылке10) вводят 500 мкл 1% нейтрального красного красителя в PBS путем внутрибрюшинной инъекции для каждой мыши.
- Выполняют сердечную перфузию12 с 30 мл 0,1% PBS предварительно охлажденной при 4 °C.
- Нарежьте мозг на 1 мм с помощью мозговой формы (см. Таблицу материалов).
- Визуализируйте поражение, окрашенное нейтральным красным цветом под микроскопом, и диссоциируйте поражение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите как можно больше окружающих нормальных тканей для повышения точности последующего анализа. Ткань поражения может быть исследована с помощью ОТ-ПЦР, электронной микроскопии и анализа вестерн-блоттинга.
5. Гистологическое окрашивание и иммунофлуоресценция
- Для гистологического окрашивания и иммунофлуоресценции12, после перфузии сердца (стадия 4.3.), удаляют мозг10, фиксируют в 4% PFA на ночь (при 4 °C) и полностью обезвоживают в 30% сахарозы.
- Нарежьте на 20 мм корональные срезы мозга с помощью замороженного слайсера10 при постоянной температуре (−20 °C).
- Используйте ломтики для окрашивания Luxol fast blue (LFB), иммунофлуоресценции и вестерн-блоттинга10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Двухточечная инъекция LPC привела к более длительной демиелинизации
LPC в основном приводит к быстрому повреждению с токсичностью миелина и расщеплению целостности аксона15. День инъекции считался днем 0. Мышей держали в течение 10-28 дней (10 dpi и 28 dpi). Быстрое синее окрашивание Luxol (LFB)10 использовалось для оценки области демиелинизации у мышей в эти моменты времени. В двухточечной модели инъекции наблюдалась значительная демиелинизация на 10 dpi по сравнению с фиктивной группой, показывая, что локализованная инъекция LPC может успешно демиелинизировать мозолистое тело. Относительно высокая степень демиелинизации все еще существует при 28 dpi, что указывает на стойкую и стабильную демиелинизацию из-за двухточечной инъекции LPC (рисунок 1D-E).
Для дальнейшей оценки потери миелиновой оболочки было выбрано 10 дней в качестве ключевого момента времени, когда демиелинизация относительно очевидна. Благодаря иммунофлуоресцентному окрашиванию деградированного основного белка миелина (dMBP) наблюдалось значительное увеличение dMBP в группе, вводимой LPC, при 10 dpi (рисунок 1F), что представляет собой потерю миелина в мозолистом теле. Также полученный белок пораженной ткани (стадия 4.) использовали для анализа экспрессии MBP путем вестерн-блоттинга. После моделирования по протоколу, MBP показал значительные потери (рисунок 1G). Эти результаты соответствовали LFB и иммунофлуоресцентному окрашиванию.
Морфологию миелина в мозолистом теле через 10 дней после инъекции LPC наблюдали с помощью электронного микроскопа (ткань поражения экстрагировали согласно шагу 4.). Очевидная демиелинизация подтверждает успешность моделирования (рисунок 2).
Двухточечная инъекция LPC повлияла на регенерацию миелина
Дифференцировка и созревание олигодендроцитов (OLG) играют решающую роль в восстановлении миелиновой оболочки при РС. Регенерация миелина происходит в основном путем дифференцировки клеток-предшественников олигодендроцитов (ОПК) в миелинизирующие олигодендроциты. Таким образом, процесс восстановления миелина будет зависеть после того, как дифференциация OPC в OLG будет заблокирована. Gst-π является маркером созревания дифференцировки OPC16. После 10 дней инъекции LPC по иммунофлуоресценции можно увидеть, что Gst-π уменьшился по сравнению с фиктивной группой (рисунок 3A). В то же время пролиферационная способность олигодендроцитов может быть отражена соотношением Ki67 (пролиферация олигодендроцитов) и Olig2 (общие клетки линии олигодендроцитов) 17,18. Более высокий коэффициент колокализации Ki67/Olig2+ представляет собой большую пролиферацию олигодендроцитов после 10dpi (рисунок 3B). Эти изображения свидетельствуют о том, что область поражения пытается восстановиться через созревание и распространение OPC после инъекции LPC.
Двухточечная инъекция LPC нарушила пространственную память мышей
Для анализа способности пространственной памяти инъекции LPC у мышей был использован водный лабиринт Морриса (WMM)19 , который не показал разницы в скорости плавания между фиктивными и LPC-инъекционными мышами. Однако, когда платформа была удалена в водном лабиринте Морриса, задержка для поиска скрытой платформы была уменьшена (нарушение пространственного обучения), а время, проведенное в целевом квадранте, увеличилось (нарушение удержания памяти) (рисунок 4). Результаты показывают, что пространственная память демиелинизированных мышей значительно нарушена в двухточечной модели инъекции LPC. Количество животных, используемых в различных экспериментах, приведено в таблице 1. Каждая мышь проходила обучение, начиная со 2-го или 20-го дня.
Рисунок 1: Двухточечная инъекция демиелинизации, индуцированной LPC. (A) Представление мест инъекции (1,0 мм сбоку, глубиной 2,4 мм и передней частью 1,1 мм). (B) Представление мест инъекции (1,0 мм сбоку, глубиной 2,1 мм и передней частью 0,6 мм). (C) Иллюстрация временных точек обнаружения. (D) Обнаружение поражений белого вещества с помощью окрашивания LFB. Окрашивание LFB через 10 дней после инъекции (dpi) и 28 dpi, показывающее стойкую демиелинизацию мозолистого тела (шкала бар = 200 мкм). Е) количественная оценка зоны демиелинизации в различные моменты времени. Данные представлены в виде среднего ± SD, односторонней ANOVA, за которой следуют многочисленные сравнительные тесты Бонферрони. ****p < 0,0001, n = 6 на группу. (F) Репрезентативные изображения иммуноокрашивания dMBP в мозолистом теле (шкала бар = 100 мкм). По сравнению с фикцией, которая почти не имела dMBP, очевидный dMBP можно было увидеть после инъекции LPC. (G) Западный анализ экспрессии MBP. MBP показал значительные потери после инъекции LPC. β-актин использовался в качестве элемента управления нагрузкой для измерения базового выражения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Изображения электронной микроскопии подтверждают ультраструктуру миелинизированной в мозолистом теле фикции по сравнению с демиелинизированной у мышей, введенных LPC (шкала = 1 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Двухточечная инъекция повлияла на созревание и распространение OPC. (A) Репрезентативные изображения GST-π в мозолистом теле фиктивных и LPC-инъекционных мышей (шкала бар = 20 мкм). Красный цвет означает GST-π. (B) Репрезентативные изображения совместной локализации Olig2 и Ki67 (шкала = 20 мкм). Красный цвет означает Ki67, а зеленый — Olig2. Снимки были получены с помощью системы конфокальной микроскопии с лазерными линиями 488 нм и 594 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Нарушение пространственной памяти, вызванное инъекцией LPC. (A) Репрезентативные изображения плавательной дорожки мышей в каждой группе в присутствии платформы (фаза обучения). (B) Репрезентативные изображения плавательных дорожек мышей в каждой группе после удаления платформы (фаза памяти). Количество использованных животных приведено в таблице 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Группа | Притворство | LPC-Group |
| Окрашивание LFB | 6 | 12 (10 т/д, 6; 28 т/д, 6) |
| Электронная микроскопия | 4 | 4 |
| Если | 6 | 6 |
| Вестерн Блот | 4 | 4 |
| Водный лабиринт Морррис | 12 | 12 |
Таблица 1: Количество животных, использованных для различных испытаний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
РС, хроническое демиелинизирующее заболевание ЦНС, является одной из наиболее распространенных причин неврологической дисфункции у молодых людей20 лет. Клинически примерно 60%-80% пациентов с РС испытывают цикл рецидивов и ремиссий до развития вторично-прогрессирующего РС21,22, и это в конечном итоге приводит к кумулятивным нарушениям движения и когнитивному дефициту с течением времени23. В настоящее время ни одна экспериментальная модель не охватывает все многообразие клинических, патологических или иммунологических особенностей заболевания24. Для моделирования патологического процесса и патогенеза РС на разных стадиях существуют три общие демиелинизирующие животные модели с их преимуществами и ограничениями, включая модель EAE, CPZ кормовых животных и модели демиелинизации, индуцированной LPC.
У мышей EAE индуцируется иммунным ответом после инъекции миелиновых антигенов, что приводит к активации микроглии и инфильтрации периваскулярных Т- и В-лимфоцитов, а сопутствующее повреждение миелина часто связано с рецидивом заболевания20,25. Он лучше имитирует характеристики РС рецидивирующе-ремиттирующего периода. Тем не менее, он также имеет несколько ограничений. Например, EAE - это в первую очередь заболевание, влияющее на белое вещество спинного мозга, тогда как РС в основном вызывает демиелинизацию коры головного мозга, а расположение и сроки поражения случайны, что затрудняет точное получение поражений19.
CPZ и LPC являются наиболее часто используемыми веществами для индуцирования токсико-демиелинизирующих моделей. Все они способны вызывать демиелинизацию ЦНС после введения. В модели CPZ кормление молодых мышей медным хелатором купризоном приводило к гибели олигодендроцитов и последующей обратимой демиелинизации. После отмены купризона в течение 4 дней был запущен процесс спонтанной ремиелинизации26,27. CPZ в основном приводит к обширной демиелинизации, в то время как инъекция LPC склоняется к фокальной демиелинизации. Из-за токсина и воспалительной реакции классическая одноточечная инъекция LPC вызывает быструю и высоковоспроизводимую форму демиелинизации28.
Однако ни одна из вышеперечисленных моделей не может должным образом имитировать патологический процесс прогрессирующего РС, характеризующийся стойкой демиелинизацией. Поэтому в настоящем протоколе предлагается модель двухточечной инъекции LPC непосредственно в мозолистое тело, чтобы вызвать долгосрочную демиелинизацию. Критические шаги в протоколе включают горизонтальную регулировку головы животного и определение координат инъекции. На шаге 3.5 необходимо сначала отрегулировать уровень брегмы и заднего родничка, а затем отрегулировать левый и правый уровни. При этом нужно отметить, что после корректировки левого и правого уровней нулевая точка должна быть перемещена перед последующими операциями. Этот шаг имеет решающее значение, потому что он напрямую связан с точностью позиционирования. На этапе 3.6., при определении координат оси Z, необходимо убедиться, что конец иглы и череп остаются в точном контакте, и исследователь может наблюдать, согнута ли игла. На этапе 3.10 игла остается на месте в течение 10 мин, чтобы предотвратить вытекание препарата из прохода иглы.
Настоящий протокол имеет некоторые ограничения. Как и другим моделям демиелинизирующих, индуцированным токсичностью, ему не хватает моделирования иммунологических процессов. Во-вторых, хотя двухточечная инъекционная модель может поддерживать демиелинизацию в течение относительно длительного времени, она все же неизбежно сопровождается незначительной степенью регенерации миелина по мере прогрессирования заболевания на более позднюю стадию. Это не может быть более подходящей моделью для моделирования вторичного прогрессирующего рассеянного склероза, чем миелиновый олигодендроцитарный гликопротеин (MOG), индуцированный экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом29,30. Классическая одноточечная инъекционная модель LPC производит только локализованную воспалительную демиелинизацию, сопровождающуюся спонтанной ремиелинизацией. Предыдущие исследования показали, что инфильтрация Т-клеток, В-клеток и макрофагов после инъекции LPC является ключевым фактором в восстановлении миелина15. Однако, по сравнению с классической инъекционной моделью, двухточечная инъекционная модель LPC индуцирует быструю фокальную демиелинизацию мозолистого тела и поддерживает степень демиелинизации в течение более длительного периода с небольшой ремиелинизацией.
Из-за сложности рассеянного склероза различные стадии заболевания требуют лучшего описания разных моделей. Двухточечная инъекция LPC через стереотаксическую рамку является стабильной, эффективной и воспроизводимой экспериментальной моделью мыши. Эта модель может привести к долгосрочной демиелинизации, сопровождающейся меньшим восстановлением миелина с течением времени. Это означает, что двухточечная инъекционная модель может использоваться не только для изучения заболеваний демиелинизации, но и для изучения вмешательств по восстановлению миелина. Кроме того, эта модель может легко и быстро оценить демиелинизацию после вмешательства с помощью иммунофлуоресцентных и гистологических методов, а когнитивная дисфункция РС может быть отражена нарушением пространственной памяти демиелинизированных мышей в поведенческом тесте. В заключение, эта модель стабильной демиелинизации может способствовать патологическим и доклиническим исследованиям как вторичного прогрессирования РС, так и рецидивирующе-ремиттирующего РС.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (гранты: 82071380, 81873743).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-α-Lysophosphatidylcholine from egg yolk | Sigma-Aldrich | L4129-25MG | |
| 32 gauge Needle | HAMILTON | 7762-05 | |
| 10 μl syringe | HAMILTON | 80014 | |
| high speed skull drill | strong,korea | strong204 | |
| drill | Hager & Meisinger, Germany | REF 500 104 001 001 005 | |
| Matrx Animal Aneathesia Ventilator | MIDMARK | VMR | |
| Portable Stereotaxic Instrument for Mouse | Reward | 68507 | |
| Micro syringe | Reward | KDS LEGATO 130 | |
| Isoflurane | VETEASY | ||
| Paraformaldehyde | Servicebio | G1101 | |
| Phosphate buffer | BOSTER | PYG0021 | |
| LuxoL fast bLue | Servicebio | G1030-100ML | |
| Suture | FUSUNPHARMA | 20152021225 | |
| Brain mold | Reward | 68707 | |
| Electron microscope fixative | Servicebio | G1102-100ML | |
| Neutral red (C.I. 50040), for microscopy Certistain | Sigma-Aldrich | 1.01376 | |
| Anti-Myelin Basic Protein Antibody | Millipore | #AB5864 | |
| Anti-GST-P pAb | MBL | #311 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (SolA15) | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-95 | |
| Beta Actin Monoclonal Antibody | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| Myelin Basic Protein Polyclonal Antibody | Proteintech | 10458-1-AP | |
| OLIG2 Polyclonal Antibody | Proteintech | 13999-1-AP | |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34206ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | YEASEN | 34412ES60 | |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | YEASEN | 34212ES60 | |
| HRP Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | abclonal | AS014 | |
| HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | abclonal | AS003 | |
| Adult C57BL/6 male and female mice | Hunan SJA Laboratory Animal Co. Ltd |
References
- Gaire, B. P., Choi, J. W. Critical roles of lysophospholipid receptors in activation of neuroglia and their neuroinflammatory responses. International Journal of Molecular Sciences. 22 (15), 7864 (2021).
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Dobson, R., Giovannoni, G. Multiple sclerosis - a review. European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).
- Mahad, D. H., Trapp, B. D., Lassmann, H. Pathological mechanisms in progressive multiple sclerosis. The Lancet Neurology. 14 (2), 183-193 (2015).
- Filippi, M., et al. Multiple sclerosis. Nature Reviews Disease Primers. 4 (1), 43 (2018).
- Villoslada, P., Steinman, L. New targets and therapeutics for neuroprotection, remyelination and repair in multiple sclerosis. Expert Opinion on Investigational Drugs. 29 (5), 443-459 (2020).
- Lassmann, H. Multiple sclerosis pathology. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 8 (3), 028936 (2018).
- Franklin, R. J., Ffrench-Constant, C. Remyelination in the CNS: From biology to therapy. Nature Reviews Neuroscience. 9 (11), 839-855 (2008).
- Gentile, A., et al. Immunomodulatory effects of exercise in experimental multiple sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, 2197 (2019).
- Chen, M., et al. Deficiency of microglial Hv1 channel is associated with activation of autophagic pathway and ROS production in LPC-induced demyelination mouse model. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 333 (2020).
- Luo, Q., et al. A stable and easily reproducible model of focal white matter demyelination. Journal of Neuroscience Methods. 307, 230-239 (2018).
- Blakemore, W. F., Franklin, R. J. Remyelination in experimental models of toxin-induced demyelination. Current Topics in Microbiology and Immunology. 318, 193-212 (2008).
- Degaonkar, M. N., Raghunathan, P., Jayasundar, R., Jagannathan, N. R. Determination of relaxation characteristics during preacute stage of lysophosphatidyl choline-induced demyelinating lesion in rat brain: An animal model of multiple sclerosis. Magnetic Resonance Imaging. 23 (1), 69-73 (2005).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Plemel, J. R., et al. Mechanisms of lysophosphatidylcholine-induced demyelination: A primary lipid disrupting myelinopathy. Glia. 66 (2), 327-347 (2018).
- Nave, K. A. Myelination and support of axonal integrity by glia. Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).
- Liu, Z., et al. Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms. Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).
- Kassis, H., et al. Histone deacetylase expression in white matter oligodendrocytes after stroke. Neurochemistry International. 77, 17-23 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: Procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocols. 1 (2), 848-858 (2006).
- Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, Pt 8 1972-1983 (2006).
- Karussis, D. The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review. Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).
- Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics. Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
- Kutzelnigg, A., et al. Cortical demyelination and diffuse white matter injury in multiple sclerosis. Brain. 128, Pt 11 2705-2712 (2005).
- Lassmann, H., Bradl, M. Multiple sclerosis: Experimental models and reality). Acta Neuropathologica. 133 (2), 223-244 (2017).
- Lamport, A. C., Chedrawe, M., Nichols, M., Robertson, G. S. Experimental autoimmune encephalomyelitis accelerates remyelination after lysophosphatidylcholine-induced demyelination in the corpus callosum. Journal of Neuroimmunology. 334, 576995 (2019).
- Torkildsen, O., Brunborg, L. A., Myhr, K. M., Bo, L. The cuprizone model for demyelination. Acta Neurologica Scandinavica. Supplementum. 188, 72-76 (2008).
- Zhan, J., et al. The cuprizone model: Dos and do nots. Cells. 9 (4), 843 (2020).
- Torre-Fuentes, L., et al. Experimental models of demyelination and remyelination. Neurologia (Barcelona, Spain). 35 (1), 32-39 (2020).
- Merkler, D., et al. Myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune encephalomyelitis in the common marmoset reflects the immunopathology of pattern II multiple sclerosis lesions. Multiple Sclerosis Journal. 12 (4), 369-374 (2006).
- Ucal, M., et al. Widespread cortical demyelination of both hemispheres can be induced by injection of pro-inflammatory cytokines via an implanted catheter in the cortex of MOG-immunized rats. Experimental Neurology. 294, 32-44 (2017).
