Method Article

혈관화된 복합 동종 이식을 위한 생체 내 관류 기반 생물반응기를 사용한 쥐 뒷다리의 조달 및 탈세포화

DOI:

10.3791/64069

⸱

June 9th, 2022

 ,  , 
1Latner Thoracic Research Surgical Laboratories, University Health Network, Toronto General Hospital, 2Institute of Medical Science, Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto, 3Institute of Laboratory Medicine and Pathobiology, Temerty Faculty of Medicine, University of Toronto, 4Division of Plastic & Reconstructive Surgery, Department of Surgery, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 복합 쥐 뒷다리에 대한 수술 기술과 탈세포화 과정을 설명합니다. 탈세포화는 생체 외 기계 관류 시스템을 통해 저농도 도데실 황산나트륨을 사용하여 수행됩니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

심한 외상성 부상 및 조직 손실 환자는 복잡한 외과 적 재건이 필요합니다. 혈관화 복합 동종 이식(VCA)은 여러 조직을 복합 서브유닛으로 이식하기 위한 진화하는 재건 방법입니다. VCA의 유망한 특성에도 불구하고, 장기 면역 억제 요구 사항은 악성 종양, 말단 기관 독성 및 기회 감염의 위험 증가로 인해 상당한 한계입니다. 무세포 복합 스캐폴드의 조직 공학은 면역억제의 필요성을 감소시키는 잠재적인 대안이다. 본원에서, 래트 뒷다리의 조달 및 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS)를 사용한 후속 탈세포화가 설명된다. 제시된 조달 전략은 총 대퇴 동맥을 기반으로합니다. 기계 관류 기반 생물 반응기 시스템이 구축되어 뒷다리의 생체 외 탈세포화에 사용되었습니다. 성공적인 관류 탈세포화가 수행되어 뒷다리의 흰색 반투명 모양이 나타났습니다. 뒷다리 전체에 온전하고 향수가있는 혈관 네트워크가 관찰되었습니다. 조직학적 분석은 모든 조직 구획에서 핵 내용물의 제거와 조직 구조의 보존을 보여주었습니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

VCA는 복잡한 외과적 재건이 필요한 환자를 위한 새로운 옵션입니다. 외상성 부상이나 종양 절제술은 재건하기 어려울 수 있는 체적 조직 손실을 초래합니다. VCA는 피부, 뼈, 근육, 신경 및 혈관과 같은 여러 조직을 기증자로부터 수혜자1에게 복합 이식편으로 이식하는 것을 제공합니다. 유망한 특성에도 불구하고 VCA는 장기간의 면역 억제 요법으로 인해 제한적입니다. 이러한 약물을 평생 사용하면 기회 감염, 악성 종양 및 말단 장기 독성의 위험이 증가합니다 1,2,3. 면역억제의 필요성을 감소 및/또는 제거하는 데 도움이 되도록 VCA에 대한 탈세포화 접근법을 사용하는 조직 공학 스캐폴드는 큰 가능성을 보여줍니다.

조직 탈세포화는 세포 및 핵 내용물을 제거하면서 세포외 기질 구조를 유지하는 것을 수반합니다. 이 탈세포화된 스캐폴드는 환자-특이적 세포4로 재채워질 수 있다. 그러나 복합 조직의 ECM 네트워크를 보존하는 것은 추가적인 과제입니다. 이것은 스캐폴드 내에서 다양한 조직 밀도, 구조 및....

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

토론토 종합병원 연구소로부터 입수한 사체 수컷 루이스 래트(300-430 g)를 모든 실험에 사용하였다. 모든 수술 절차에서 무균 기술을 유지하기 위해 멸균 도구와 용품이 사용되었습니다( 재료 표 참조). 모든 절차는 토론토 종합 병원 연구소, 대학 건강 네트워크 (토론토, 온타리오, 캐나다)의 동물 관리위원회의 지침에 따라 수행되었습니다. 총 4 개의 뒷다리가 탈세포화되었습니다.

1. 수술 전 준비

  1. 5 % 헤파린 화 식염수 50mL를 준비하십시오. 50mL 식염수 백에서 5mL 주사기를 사용하여 식염수 2.5mL를 꺼내 버립니다. 5mL 주사기를 사용하여 2.5mL의 헤파린을 식염수 백에 추가합니다. 식염수 백을 뒤집어 내용물을 혼합합니다.
  2. 사체 쥐를 파란색 패드 아래에 앙와위 자세로 놓습니다. 전기 면도기를 사용하여 뒷다리와 사타구니 부위를 원주 방향으로 면도하고 머리카락을 제거하십시오.
  3. 쥐를 수술실로 데려와 거즈를 사용하여 포비돈 요오드 스크럽 용액을 뒷다리와 사타구니 부위에 바르십시오. 그런 다음 70 % 이소 프로필 알코올을 바르고 거즈를 사용하여 스크럽 용액을 닦아냅니다.
  4. 1.2단계의 파란색 패드를 버....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

조달 프로토콜은 후속 관류 단계를 위해 대퇴 동맥을 분리하고 캐뉼러하는 데 성공했습니다. 그림 1A, B 의 대표적인 해부 이미지는 분기점에서 충분한 거리를 둔 대퇴 혈관의 절개 위치와 노출을 보여줍니다. 도 2 는 바이오리액터 및 관류 회로를 제조하는데 필요한 장치를 나타낸다. 탈세포화의 종점은 조직의 흰색, 반투명과 같은 외관을 관찰함으로써 결정되었습니다. 생체외 기계 관류 시스템은 쥐 뒷다리의 관류 탈세포화에 성공적이었다. 단일 패스 폐쇄 시스템 회로가 유지되었습니다(그림 3). 토착 뒷다리의 총 형태는 0.25% SDS 관류 5일 후 흰색의 창백한 모양으로 변했습니다(그림 4).

세포 내용물의 제거는 핵이 발견되지 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

쥐 뒷다리는 VCA5에서 실험 모델로 유용합니다. 무세포 스캐폴드의 조직 공학은 VCA와 관련된 장기 면역억제 요법의 단점을 해결하는 첫 번째 단계입니다. 복합 이식편의 사용은 각각 고유한 기능, 면역원성 및 구조적 특성을 갖는 여러 조직의 존재를 고려할 때 추가적인 문제를 제기합니다. 본 프로토콜은 무세포 복합 래트 뒷다리를 얻기 위한 성공적인 방법을 나타낸다. 이러한 스캐폴드는 추가로 재세포화될 수 있으며 VCA에 대한 개념 증명 모델을 나타냅니다.

성공적인 조달 및 탈세포화를 보장하기 위해 수술 및 탈세포화 단계에서 다양한 중요한 단계가 있습니다. 천연 혈관 구조 전체에 세제와 살균 용액의 전신 분포를 보장하기 위해 중요한 단계에는 상복부 혈관의 결찰뿐만 아니라 대퇴 혈관의 결찰 전에 동정맥 네트워크의 분기점에서 충분한 거리를 확보하는 것이 포함됩니다. 설명된 멸균 절차는 세포 부착, 생존및 성장을 .......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

그림 3A 는 BioRender.com 년에 작성되었습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% 염화나트륨 주사 USP 50mLBaxter CorporationJB1308M
1mL 일회용 혈청학 피펫VWR75816-102
연구 기관에서 얻은10cc 일회용 주사기
기관에서 얻은3방향 마개
5cc 일회용 주사기연구 기관에서 얻은
70 % 이소 프로필 알코올연구 기관에서 얻은
Acrodisc 주사기 필터 0.2 µ mVWRCA28143-310
Adson 집게, 스트레이트파인 사이언스 도구11006-12
Angiocatheter 24 G 19 mm (¾ ”) VWR38112
항생제-항진균 용액 (100x) 100 mL멀티셀450-115-EL
뼈 절단기파인 사이언스 도구12029-12
커넥터  1/16"에서 1/8" 튜브용McMasterCarr5117K52
여성 루어에서 바브 어댑터 (PVDF) - 1/8" IDMcMasterCarr51525K328
미세 집게Fine Science Tools11254-20
미세 무딘 팁이 있는 Fine ForcepsFine Science Tools11253-20
헤파린 나트륨 주입 10,000 IU/10 mLLEO Pharma Inc.006174-09
남성 루어-바브 어댑터(PVDF) - 1/8" IDMcMasterCarr51525K322
마이크로 니들 홀더WLorenz04-4125
마이크로가위WLorenzSP-4506
과아세트산시그마 Aldrich269336-100ML
연동 펌프, 3채널콜 파머RK-78001-68
인산염 완충 식염수 1x 500 mLWisent311-425-CL
포비돈 수술 스크럽 솔루션연구 기관에서 얻은
펌프 튜빙, 3-Stop, Tygon E-LFLCole ParmerRK-96450-40
펌프 튜브, 백금 경화 실리콘Cole ParmerRK-96410-16
메스 블레이드 - # 10Fine Science Tools10010-00
메스 핸들 - #3 Fine Science Tools10003-12
나트륨 도데실 설페이트 시약 등급: 순도: >99%, 1kgBioshopSDS003.1
외과용 봉합사 #6-0CovidienVS889
연구 ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
  2. Duisit, J., et al.

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