Summary
تقنية التقشير هي طريقة تحضير شبكة cryo-EM التي تسمح بفصل العينات البيولوجية متعددة الطبقات والمركزة إلى طبقات مفردة لتقليل السماكة وزيادة تركيز العينة وتسهيل معالجة الصور.
Abstract
تقنية تحضير شبكة التقشير والبقع cryo-EM هي طريقة حقن عكسي معدلة بشكل كبير بهدف تحقيق تقليل في طبقات العينات متعددة الطبقات. يمكن أن تساعد إزالة الطبقات قبل التجميد بالغطس في تقليل سمك العينة إلى مستوى مناسب لجمع بيانات cryo-EM ، وتحسين تسطيح العينة ، وتسهيل معالجة الصور. تسمح تقنية التقشير بفصل الأغشية متعددة الصفائح إلى طبقات مفردة ، وبلورات 2D ذات الطبقات إلى بلورات فردية ، وهياكل مكدسة تشبه الصفيحة من البروتينات القابلة للذوبان ليتم فصلها بالمثل إلى طبقات مفردة. غالبا ما يطرح سمك العينة العالي لهذه الأنواع من العينات مشاكل لا يمكن التغلب عليها لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة صور cryo-EM ، خاصة عندما يجب إمالة مرحلة المجهر لجمع البيانات. علاوة على ذلك ، يمكن إعداد شبكات ذات تركيزات عالية من أي من هذه العينات لجمع البيانات بكفاءة حيث يمكن زيادة تركيز العينة قبل إعداد الشبكة وتعديل تقنية التقشير لطخة لتؤدي إلى توزيع كثيف للعينة أحادية الطبقة.
Introduction
تم تطوير تقنية التقشير من أجل فصل البلورات ثنائية الأبعاد المكدسة من البروتينات الغشائية إلى طبقات مفردة للحصول على عينات رقيقة مناسبة لجمع البيانات cryo-EM 2D و 3D وتسهيل معالجة الصور1. البروتوكول مناسب بالمثل لأنواع أخرى من العينات متعددة الصفائح وكذلك لتحقيق تركيزات عالية للعينات من أي نوع عينة على الشبكة دون زيادة السماكة في Z.
يتم تقليل طبقات العينة إلى طبقة واحدة من خلال تطبيق مزيج من الضغط الشعري وقوى القص في بروتوكول يمتد بشكل كبير ويعدل طريقة الحقن الخلفي2. تؤدي خطوة النشاف الأولى إلى شطيرة ضيقة والالتزام بفيلم الكربون وشريط شبكي على جانبي العينة متعددة الطبقات أثناء النشاف على الميكرون الفرعي بدلا من حجم مسام ورق الترشيح 20-25 ميكرومتر في طريقة الحقن الخلفي. يحدث فصل أو تقشير طبقة فردية عند فرض فصل الطبقات المحصورة بمجرد ضغط الشبكة عموديا على قطرة تريهالوز ، مما يجبر فيلم الكربون بعيدا عن شريط الشبكة (الشكل 1). يحدث تغيير موضع فيلم الكربون بعيدا عن نقطة الاتصال الأصلية مع شريط الشبكة في الخطوة التالية ، عندما يتم مسح الشبكة مرة أخرى على ورق ترشيح submicron. يمكن تحسين عدد التكرارات لهذه الخطوات لعينات محددة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام البروتوكول لزيادة تركيزات العينات مع تجنب التجميع في Z. نظرا للاعتماد على الالتزام بشريط الشبكة وفيلم الكربون بالإضافة إلى الفصل القسري ، قد لا يكون هذا النهج مناسبا للجزيئات شديدة الهشاشة مثل بعض البروتينات الحساسة و / أو غير المستقرة ومجمعات البروتين.
لا تتطلب تقنية التقشير معدات متخصصة ولا إمدادات باهظة الثمن. غير أن قابلية التطبيق على عينات محددة ستتطلب اعتبارات متأنية للبارامترات البيولوجية. القرار أسهل بالنسبة لبلورات 2D حيث أن فيلم الكربون مطلوب لضمان التسطيح ، ومع ذلك فإن التلاعب عبر تقنية التقشير قد يؤثر على السلامة البيولوجية للعينة أو الترتيب البلوري. تقتصر ملاءمة تقنية التقشير واللطخة للجسيمات المفردة على تلك التي تتطلب طبقة كربونية ومستقرة للتلاعب. قد لا تكون العينات ذات التفاعلات البيولوجية الحرجة بين الطبقات مناسبة للتوصيف بمساعدة تقنية التقشير بسبب تعطيل مثل هذه التفاعلات.
يتم تحسين تقنية التقشير ("التقشير اللطخ") بسرعة أكبر عن طريق الاختبار والفحص باستخدام البقع السلبية أو العينات غير الملوثة بواسطة TEM في درجة حرارة الغرفة. بمجرد تحديد العدد الأمثل لتكرارات التقشير ، يمكن تحديد وقت التحكم في السماكة قبل التزجيج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خطوات التحضير لتقنية التقشير
ملاحظة: يتطلب التحضير وضع العناصر التالية بجوار بعضها البعض.
- قم بتكديس قطعتين من ورق الترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
- ضع فيلم بارافين بطول ~ 8 سم × 10 سم بجوار ورق الترشيح بحيث يكون الورق متجها لأعلى.
- ضع قطعة من ورق الترشيح submicron فوق قطعتين إضافيتين من ورق الترشيح # 4 (الشكل 1-1).
- ضع الملقط المضاد للشعيرات الدموية بحيث تكون الساق المثنية متجهة لأعلى والساق المستقيمة متجهة لأسفل. بعد ذلك ، حدد شبكة 600 شبكة مع الجانب الأملس / اللامع لأعلى. ضع الملقط على طبق بتري أو أي سطح مرتفع آخر لتجنب ملامسة الشبكة النظيفة مع العناصر الأخرى.
- قم بإزالة الورق من فيلم البارافين واسحب الجوانب (~ 5 مم) لإنشاء حافة صغيرة. ماصة قطرتان 150 ميكرولتر من محلول تريهالوز 4٪ ~ 1-2 سم من جانب قصير من فيلم البارافين و ~ 1 سم على فيلم البارافين.
- على مقعد منفصل أو على الأرض ، صب النيتروجين السائل في وعاء صغير من رغوة البوليسترين (انظر جدول المواد).
تنبيه: تلقي التدريب على التعامل السليم باستخدام القفازات ودرع الوجه من أجل تجنب لدغة الصقيع. - ضع حاوية شبكة cryo-EM صغيرة في النيتروجين السائل وقم بتغطية حاوية رغوة البوليسترين بمناديل خالية من النسالة.
2. وضع فيلم الكربون على الشبكة
- استخدم ملقط Dumont # 5 (انظر جدول المواد) لتعويم فيلم الكربون من الميكا عن طريق لمس جانب واحد من الميكا بزاوية طفيفة لأسفل (~ 20 درجة -40 درجة) على إحدى قطرات محلول تريهالوز واترك توتر الماء يرفع ببطء فيلم الكربون عن طريق تحريك الميكا لأسفل. حرر الميكا بمجرد أن يطفو فيلم الكربون على سطح القطرة.
- افحص بصريا فيلم الكربون لتجنب استخدام الكربون مع تلف في شكل كسور.
- أدخل الشبكة التي يحملها الملقط المضاد للشعيرات الدموية بزاوية (~ 20 درجة -30 درجة) في قطرة تريهالوز في موضع مجاور ، ثم تركزت تحت فيلم الكربون. التقط فيلم الكربون (الشكل 1-2).
- حافظ على الشبكة في نفس الاتجاه وقم بخفضها ببطء على سطح القطرة الثانية من trehalose دون كسر التوتر السطحي للقطرة لإزالة فيلم الكربون غير الضروري الذي قد يكون ملفوفا حول حافة الشبكة إلى الجانب الخشن.
3. فصل بلورات 2D متعددة الطبقات إلى طبقات واحدة
- قم بتدوير الملقط المضاد للشعيرات الدموية (انظر جدول المواد) وضعه على طبق بتري بحيث يكون الجانب الكربوني للشبكة متجها لأسفل (الشكل 1-3).
- ماصة 1.3 ميكرولتر من العينة في الغضروف المفصلي trehalose طفيف على قمة الشبكة. ماصة الحل ~ 8-10 مرات لخلط وتوزيع trehalose والعينة على جانبي الشبكة.
- أثناء احتضان المحلول لمدة دقيقة واحدة ، ماصة واحدة أو أكثر من قطرات 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز على فيلم البارافين.
- قم بتدوير الشبكة مرة أخرى إلى موضعها الأصلي مع توجيه فيلم الكربون لأعلى.
- استخدم الملقط المضاد للشعيرات الدموية للضغط على الشبكة على ورقة الترشيح تحت الميكرون (الشكل 1-4). بمجرد امتصاص المحلول بواسطة ورقة الترشيح ويكون فيلم الكربون مسطحا ، انتظر لمدة 3 ثوان قبل رفع الشبكة وتحريكها عموديا على قطرة 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز (الشكل 1-5).
ملاحظة: كرر هذه الخطوة عدة مرات للعينات المكدسة للغاية، أو يتم إعداد الشبكة للتزجيج في الخطوات التالية. - امسح الشبكة على قطعتي ورق الترشيح ، ثم ارفع الشبكة من ورق الترشيح (الشكل 1-6). بعد حوالي 13 ثانية ، اعتمادا على الرطوبة والمخزن المؤقت للعينة ، قم بغمر الشبكة في النيتروجين السائل في حاوية الستايروفوم الصغيرة ووضع الشبكة في حاوية شبكة cryo-EM أو نقلها مباشرة لفحص cryo-EM أو جمع البيانات.
ملاحظة: من أجل تحسين البروتوكول بسرعة ، قم بتلطيخ الشبكة المقشرة بشكل سلبي في هذه الخطوة بدلا من إغراقها في النيتروجين السائل. قم بتلطيخ العينة سلبا عن طريق تطبيق 3 ميكرولتر من أسيتات اليورانيل بنسبة 1٪ على الشبكة ، واحتضان الشبكة لمدة 30 ثانية ، وصمة عار بقطعة ممزقة من ورق ترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر. يتم غمر شبكات بلورات ثنائية الأبعاد المزججة في التريهالوز أو التانين أو الجلوكوز يدويا بشكل روتيني للتزجيج حيث يمنع التريهالوز والتانين والجلوكوز تكوين الجليد البلوري بمعدلات تستخدم للغطس اليدوي2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ستؤدي تجربة التقشير الناجحة إلى طبقات مفردة من العينات بتركيزات عالية في كثير من الأحيان. من المتوقع أن تظل بعض المناطق في معظم مربعات الشبكة تحتوي على طبقات متعددة ، خاصة عند عدد أقل من التكرارات لخطوات التقشير. ومع ذلك ، فإن غالبية مربعات الشبكة ستحتوي على مناطق واسعة من الطبقات المفردة كما لوحظ لبلورات ثنائية الأبعاد من سينسيز الليكوترين C4 البشري (الشكل 2) والليبوزومات (المضافة في الخطوة 3.2 ، الشكل 3). قد يلزم اختبار خطوات إضافية لمسح التقشير للعينات التي لا تظهر الانخفاض المطلوب في الطبقات.
سيكون أهم مؤشر على نجاح تجربة التقشير هو جودة البيانات والسلامة البيولوجية التي لوحظت بعد جمع بيانات cryo-EM عالية الدقة ومعالجة الصور. سيحتاج تفسير البيانات إلى تضمين دراسة متأنية للضرر أو التشويه المحتمل لمناطق الاتصال بين الطبقات.
عادة ما تظهر مناطق شبكة EM التي حدث فيها نشاف التقشير تركيزا أعلى للعينة من المناطق التي لم يحدث فيها. يحدث هذا التأثير المركز الواضح بسبب التصاق العينة متعددة الصفائح بكل من فيلم الكربون وأسطح شريط الشبكة ، يليه التصاق إضافي بكلا السطحين أثناء تحضير لطخة التقشير أثناء فصلهما بشكل متكرر ، وإعادة وضعهما قليلا ، والاتصال مرة أخرى. والنتيجة هي أن الطبقات المختلفة للعينة الأصلية متعددة الصفائح تنتشر على مساحة جانبية أكبر (الشكل 3 والشكل 4). يمكن أن تحتوي هذه المناطق على بلورات أو أغشية 2D أكبر. يمكن ملاحظة كلتا الظاهرتين ومقارنتهما بسهولة في المناطق التي تكون فيها "منطقة التقشير" مجاورة لمنطقة لا تتأثر بخطوة التقشير (الشكل 3). تم جمع الصور في الأشكال 2-4 في ظل ظروف جرعة منخفضة بجهد متسارع يبلغ 120 كيلو فولت باستخدام مجهر إلكتروني ناقل (انظر جدول المواد).
الشكل 1: تمثيل تخطيطي لتقنية التقشير. تعتمد الخطوتان الأوليان (1-2 و 1-3) والخطوة الأخيرة (1-6) من تقنية التقشير على طريقة الحقن الخلفي2 وتتبع الخطوات الوسيطة بروتوكول التقشير واللطخة (المعدل من Johnson et al.1). في الخطوة 1 ، (أ) يتم تكديس قطعتين من ورق ترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر ، (ب) بجوار قطعة من فيلم البارافين مع قطرتين من محلول تريهالوز و (ج) قطعة من ورق الترشيح دون الميكرون على قطعتين إضافيتين من ورق الترشيح. في الخطوة 2 ، (أ) يتم تعويم فيلم الكربون على قطرة تريهالوز الأولى و (ب) يتم التقاطه باستخدام ملقط مضاد للشعيرات الدموية ، وبعد ذلك يتم لمسه على سطح القطرة الثانية (غير معروضة) دون كسر التوتر السطحي لإزالة فيلم الكربون الزائد من المحيط. في الخطوة 3 ، (أ) يتم تدوير الملقط الذي يحمل الشبكة بمقدار 180 درجة (جانب فيلم الكربون من الشبكة متجها الآن لأسفل) و (ب) يتم سحب العينة في الغضروف المفصلي للتريهالوز. في الخطوة 4 ، تم تدوير الشبكة مرة أخرى إلى الاتجاه الأصلي مع توجيه فيلم الكربون لأعلى ويتم خفض العينة ببطء على ورق الترشيح دون الميكرون. يتم رفع الشبكة لأعلى وفي الخطوة 5 يتم إنزالها عموديا على قطرة 1.7 ميكرولتر من محلول تريهالوز. يشار إلى الخطوتين 4 و 5 باسم "التقشير" ويمكن تكرارهما ثلاث مرات أو أكثر ، اعتمادا على مقدار التراص. قد يلزم تحسين عدد التكرارات لعينات مختلفة. في الخطوة 6 ، (أ) يتم مسح العينة على طبقتين من ورق ترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر ، قبل (ب) يتم غمرها يدويا في النيتروجين السائل. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: عينة بلورية ثنائية D تخضع لطريقة التقشير واللطخة. تم تقليص المنطقة الموجودة على يسار السهم إلى حد كبير إلى بلورات 2D أحادية الطبقة في منطقة تلامس بين فيلم الكربون وشريط الشبكة الذي تم تقشيره ثم إزاحته ، في حين أن المنطقة الموجودة على يمين السهم لم تكن في منطقة متأثرة ببقعة التقشير. يمكن بسهولة اختيار المناطق الملطخة بالقشر ويتم ملاحظتها في معظم الشبكة. بلورات 2D المعروضة مكدسة وبلورات 2D أحادية الطبقة من سينسيز الليكوترين C4 البشري. شريط المقياس يتوافق مع 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: الجسيمات الشحمية المعرضة لبقعة التقشير. يمكن تطبيق لطخة التقشير بنجاح لمقاطعة حواف الجسيمات الشحمية والحويصلات المنهارة لينتج عنها مناطق ذات طبقات فوسفوليبيد كبيرة ، معظمها أحادية الطبقة كما لوحظ في النصف السفلي من الصورة. لم يكن النصف العلوي في منطقة تلامس بين شريط الشبكة وفيلم الكربون ، وبالتالي يحتوي على الجسيمات الشحمية الكاملة مع طبقتين فوسفوليبيد. شريط المقياس يتوافق مع 1 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: بصمة قشر اللطخة. يظهر مربع الشبكة لشبكة 400 شبكة البصمة (المسماة "B") لشريط الشبكة والمناطق الناتجة عن التقشير بالإضافة إلى المناطق (المسماة "C") التي لم تكن على اتصال بشريط الشبكة ، أو تعرضت لعدد أقل من تكرارات بقع التقشير. شريط المقياس يتوافق مع 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: نشاف شبكة EM محضرة بالحقن الخلفي على ورق ترشيح دون ميكرون ، باستخدام فيلم كربون رقيق جدا. الصور عبارة عن إطارات مفردة من مقطع فيديو (انظر الفيديو 1) تم التقاطه عند (A) التلامس الأولي مع الغشاء ، و (B) 1000 مللي ثانية بعد الاتصال ، و (C) 2000 مللي ثانية بعد الاتصال. يشير السهم إلى مربعات الشبكة التي أدى فيها الضغط الشعري إلى تمزق فيلم الكربون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
فيديو 1: يتم وضع الشبكة على ورق الترشيح submicron لخطوة التقشير. يتم شفط فيلم الكربون ببطء وإحكام على الشبكة في الاتجاه من أسفل اليسار إلى أعلى اليمين ، والذي يساندويتش بإحكام عينة بين شريط الشبكة وفيلم الكربون. يتم إزاحة طبقة الكربون وبالتالي طبقات العينات الفردية في كل خطوة لاحقة من خطوات التقشير ، مما يسمح بالتحسين مع تكرارات إضافية لعينات أكثر طبقات. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعد لطخة التقشير طريقة قوية للتغلب على تكديس وسمك بلورات 2D متعددة الطبقات وعينات مماثلة لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة الصور. سيعتمد قرار استخدام لطخة التقشير على المعلمات البيولوجية للعينة وسيتطلب أيضا تقييما بمجرد توفر نموذج 3D cryo-EM. وستكون الأهمية البيولوجية للمخالطين والمرونة المحتملة لمناطق الاتصال ذات أهمية خاصة في هذا التقييم.
سيتم تحديد عدد بقع التقشير في البداية عن طريق الملاحظة بعد إعداد شبكة البقع السلبية القياسية ، حيث تتطلب الطبقات أو السمك المفرط استراتيجيات بديلة لإعداد شبكة cryo-EM القياسية. يمكن استخدام البلورات الرقيقة متعددة الطبقات المكدسة في السجل مباشرة ل microED3 أو FIB المطحون في حالة البلورات السميكة4. عادة لا تكون لطخة التقشير ضرورية لبلورات 2D مزدوجة الطبقات حيث يمكن معالجة الطبقات بشكل فردي أو معا ، عندما تكون الطبقات في السجل5. يمكن أن يكون مفيدا لتعريض جانبي بلورات البروتين الغشائي 2D للروابط أو المثبطات ، مرة واحدة في المحلول قبل التقشير ، ومرة واحدة بعد خطوة التقشير النهائية. بالإضافة إلى ذلك ، قد يسمح تقليل بلورات 2D ثنائية الطبقات الكبيرة والمرتبة جيدا بحيود الإلكترون 6,7. ستكون الطبقات المتعددة ، سواء المستحثة أو التي تحدث بيولوجيا ، من بلورات 2D من الغشاء والبروتينات القابلة للذوبان هي الأهداف الأكثر احتمالا لبقعة التقشير ، على الرغم من أنه يمكن تطبيق البروتوكول على مجموعة من العينات ويعمل على تركيز عينات مختلفة ل cryo-EM (الشكل 4).
سيؤدي الاختبار الأولي مع البقع السلبية إلى تقليل الوقت والتكلفة بشكل كبير لتحسين العينات حيث لا يلزم التجميد ، وإعداد حاملات عينات cryo-EM ، والنقل إلى cryo-EM ، واستخدام cryo-EM. فقط وقت التجفيف قبل خطوة التجميد يجب تحسينه بشكل منفصل. سيكون وقت التجفيف مطابقا أو مشابها جدا للوقت المستخدم لتجفيف شبكة الحقن الخلفي القياسية لنفس العينة1.
في حين أن الشبكات المكونة من 600 شبكة تؤدي عموما إلى الحفاظ الجيد على فيلم الكربون ، فإن زيادة عدد تكرارات التقشير وطبقات فيلم الكربون الرقيق قد تؤدي إلى زيادة كسر فيلم الكربون (الشكل 5). يمكن فصل بلورات ثنائية الأبعاد مكدسة وجسيمات دهنية وعينات ذات طبقات من صفائف كبيرة من البروتينات القابلة للذوبان بنجاح (الأشكال 2-4).
يتم تقييم العينة بعناية بواسطة cryo-EM لضمان تجنب الآثار الضارة على جودة العينة. يمكن تحقيق ذلك عن طريق معالجة الصور لمقارنة صور البلورات المكدسة وغير المكدسة. لأغراض التقييم ولتحقيق هدف نموذج ثلاثي الأبعاد ، تتم معالجة الصور عبر برامج 2dx المتوفرة في Focus 8,9 ، والتي تنفذ أيضا مناهج الجسيمات المفردة لمعالجة عيوب الشبكة وعدم تجانس البروتين مع إمكانية زيادة الجودة المتأصلة في بلورات 2D الأصلية10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.
Acknowledgments
تم دعم جزء من هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة HL090630 (ISK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
- Wisedchaisri, G., Gonen T. Phasing electron diffraction data by molecular replacement: strategy for structure determination and refinement. Methods in Molecular Biology. 955, 243-272 (2013).
- Gipson B., Zeng X., Zhang Z. Y., Stahlberg, H. 2dx-user-friendly image processing for 2D crystals. Journal of Structural Biology. 157 (1), 64-72 (2007).
- Biyani, N. et al. Focus: The interface between data collection and data processing in cryo-EM. Journal of Structural Biology. 198 (2), 124-133 (2017).
- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
