تقنية التقشير هي طريقة تحضير شبكة cryo-EM التي تسمح بفصل العينات البيولوجية متعددة الطبقات والمركزة إلى طبقات مفردة لتقليل السماكة وزيادة تركيز العينة وتسهيل معالجة الصور.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تقنية التقشير واللطخة: طريقة تحضير عينة Cryo-EM لفصل الطبقات المفردة عن العينات البيولوجية متعددة الطبقات أو المركزة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تقنية تحضير شبكة التقشير والبقع cryo-EM هي طريقة حقن عكسي معدلة بشكل كبير بهدف تحقيق تقليل في طبقات العينات متعددة الطبقات. يمكن أن تساعد إزالة الطبقات قبل التجميد بالغطس في تقليل سمك العينة إلى مستوى مناسب لجمع بيانات cryo-EM ، وتحسين تسطيح العينة ، وتسهيل معالجة الصور. تسمح تقنية التقشير بفصل الأغشية متعددة الصفائح إلى طبقات مفردة ، وبلورات 2D ذات الطبقات إلى بلورات فردية ، وهياكل مكدسة تشبه الصفيحة من البروتينات القابلة للذوبان ليتم فصلها بالمثل إلى طبقات مفردة. غالبا ما يطرح سمك العينة العالي لهذه الأنواع من العينات مشاكل لا يمكن التغلب عليها لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة صور cryo-EM ، خاصة عندما يجب إمالة مرحلة المجهر لجمع البيانات. علاوة على ذلك ، يمكن إعداد شبكات ذات تركيزات عالية من أي من هذه العينات لجمع البيانات بكفاءة حيث يمكن زيادة تركيز العينة قبل إعداد الشبكة وتعديل تقنية التقشير لطخة لتؤدي إلى توزيع كثيف للعينة أحادية الطبقة.
المقدمة
تم تطوير تقنية التقشير من أجل فصل البلورات ثنائية الأبعاد المكدسة من البروتينات الغشائية إلى طبقات مفردة للحصول على عينات رقيقة مناسبة لجمع البيانات cryo-EM 2D و 3D وتسهيل معالجة الصور1. البروتوكول مناسب بالمثل لأنواع أخرى من العينات متعددة الصفائح وكذلك لتحقيق تركيزات عالية للعينات من أي نوع عينة على الشبكة دون زيادة السماكة في Z.
يتم تقليل طبقات العينة إلى طبقة واحدة من خلال تطبيق مزيج من الضغط الشعري وقوى القص في بروتوكول يمتد بشكل كبير ويعدل طريقة الحقن الخلفي2. تؤدي خطوة النشاف الأولى إلى شطيرة ضيقة والالتزام بفيلم الكربون وشريط شبكي على جانبي العينة متعددة الطبقات أثناء النشاف على الميكر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خطوات التحضير لتقنية التقشير
ملاحظة: يتطلب التحضير وضع العناصر التالية بجوار بعضها البعض.
- قم بتكديس قطعتين من ورق الترشيح بحجم المسام 20-25 ميكرومتر (انظر جدول المواد).
- ضع فيلم بارافين بطول ~ 8 سم × 10 سم بجوار ورق الترشيح بحيث يكون الورق متجها لأعلى.
- ضع قطعة من ورق الترشيح submicron فوق قطعتين إضافيتين من ورق الترشيح # 4 (الشكل 1-1).
- ضع الملقط المضاد للشعيرات الدموية بحيث تكون الساق المثنية متجهة لأعلى والساق المستقيمة متجهة لأسفل. بعد ذلك ، حدد شبكة 600 شبكة مع الجانب الأملس / اللامع لأعلى. ضع الملقط على طبق بتري أو ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ستؤدي تجربة التقشير الناجحة إلى طبقات مفردة من العينات بتركيزات عالية في كثير من الأحيان. من المتوقع أن تظل بعض المناطق في معظم مربعات الشبكة تحتوي على طبقات متعددة ، خاصة عند عدد أقل من التكرارات لخطوات التقشير. ومع ذلك ، فإن غالبية مربعات الشبكة ستحتوي على مناطق واسعة من الطبقات المفردة كما لوحظ لبلورات ثنائية الأبعاد من سينسيز الليكوترين C4 البشري (الشكل 2) والليبوزومات (المضافة في الخطوة 3.2 ، الشكل 3). قد يلزم اختبار خطوات إضافية لمسح التقشير للع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تعد لطخة التقشير طريقة قوية للتغلب على تكديس وسمك بلورات 2D متعددة الطبقات وعينات مماثلة لجمع بيانات cryo-EM ومعالجة الصور. سيعتمد قرار استخدام لطخة التقشير على المعلمات البيولوجية للعينة وسيتطلب أيضا تقييما بمجرد توفر نموذج 3D cryo-EM. وستكون الأهمية البيولوجية للمخالطين والمرونة المحتملة لمناطق الاتصال ذات أهمية خاصة في هذا التقييم.
سيتم تحديد عدد بقع التقشير في البداية عن طريق الملاحظة بعد إعداد شبكة البقع السلبية القياسية ، حيث تتطلب الطبقات أو السمك المفرط استراتيجيات بديلة لإعدا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس للمؤلفين مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر.
شكر وتقدير
تم دعم جزء من هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة HL090630 (ISK).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 600 شبكة شبكات | SPI | 2060-C-XA | |
| ملقط مضاد للشعيرات الدموية | تيد بيلا | 510-5 | |
| الكربون لطلاء الميكا | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM عند 120 كيلو فولت أو 200 كيلو فولت. يتم جمع البيانات عالية الدقة عند 300 كيلو فولت. | ||
| Dumpont # 5 ملقط | Ted Pella | 5622 | |
| صندوق شبكي لتخزين التبريد | Ted Pella | 160-40 | |
| مناديل كيم المبللة | |||
| النيتروجين | |||
| ميكا | تيد بيلا | 56 | الميكا مغلفة بالكربون ومقطعة إلى مربعات أكبر بكثير من شبكة TEM. قد يتطلب سمك الكربون تحسينا لتجنب الكربون الرقيق الذي ينكسر بسهولة على بقع التقشير المتعددة. |
| وصمة عار | 1-2٪ أسيتات اليورانيل مناسبة للعديد من العينات. يمكن استبدال البقع الأخرى مثل حمض الفوسفوتونغستيك. | ||
| بارافيلم | |||
| يمكن إعادة تدوير حاوية شحن البوليسترين لهذا الغرض ومبطنة بورق الألمنيوم. | |||
| ورق ترشيح Submicron | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| مجهر إلكتروني ناقل | الحركة JEOL | JEM-1400 | أي TEM يعمل بجهد متسارع من 80-120 كيلو فولت سيكون مناسبا لفحص الشبكات الملطخة سالبا. |
| تريهالوز | تحضير محلول تريهالوز بنسبة 4٪. | ||
| Whatman # 4 ورق الترشيح | MilliporeSigma | WHA1004150 | هذا يتوافق مع 20-25 & ورق ترشيح بحجم المسام في البروتوكول. |
المراجع
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
- Kühlbrandt, W., Downing, K. H. Two-dimensional structure of plant light harvesting complex at 3.7 Å resolution by electron crystallography. Journal .of Molecular Biology. 207 (4), 823-828 (1989).
- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
