Summary
La technique peel-blot est une méthode de préparation de grille cryo-EM qui permet de séparer des échantillons biologiques multicouches et concentrés en couches uniques afin de réduire l’épaisseur, d’augmenter la concentration des échantillons et de faciliter le traitement des images.
Abstract
La technique de préparation de la grille cryo-EM par transfert peel-blot est une méthode de rétro-injection considérablement modifiée dans le but d’obtenir une réduction des couches d’échantillons multicouches. Cette élimination des couches avant la congélation peut aider à réduire l’épaisseur de l’échantillon à un niveau approprié pour la collecte de données cryo-EM, à améliorer la planéité de l’échantillon et à faciliter le traitement de l’image. La technique peel-blot permet de séparer les membranes multilamellaires en couches simples, les cristaux 2D stratifiés en cristaux individuels et les structures empilées en feuilles de protéines solubles à séparer également en couches uniques. L’épaisseur élevée de ces types d’échantillons pose souvent des problèmes insurmontables pour la collecte de données cryo-EM et le traitement d’images cryo-EM, en particulier lorsque la platine du microscope doit être inclinée pour la collecte de données. De plus, des grilles de concentrations élevées de l’un de ces échantillons peuvent être préparées pour une collecte efficace des données, car la concentration de l’échantillon avant la préparation de la grille peut être augmentée et la technique du transfert de pelage ajustée pour aboutir à une distribution dense de l’échantillon à une seule couche.
Introduction
La technique peel-blot a été développée afin de séparer les cristaux bidimensionnels empilés de protéines membranaires en couches uniques afin d’obtenir des échantillons suffisamment minces pour la collecte de données cryo-EM 2D et 3D et de faciliter le traitement des images1. Le protocole convient également à d’autres types d’échantillons multilamellaires ainsi qu’à l’obtention de concentrations élevées d’échantillons de l’un ou l’autre type d’échantillon sur la grille sans augmenter l’épaisseur en Z.
La réduction des couches d’échantillon en une seule couche est obtenue en appliquant une combinaison de pression capillaire et de forces de cisaillement dans un protocole qui étend considérablement et modifie la méthode de rétroinjection2. Une première étape de buvard entraîne une prise en sandwich serrée et une adhérence au film de carbone et à une barre de grille de chaque côté de l’échantillon multicouche pendant le buvard sur submicron plutôt que la taille des pores du papier filtre de 20 à 25 μm dans la méthode de rétroinjection. La séparation, ou le pelage, d’une couche individuelle se produit lorsque l’on force la séparation des couches en sandwich une fois que la grille est pressée verticalement sur une goutte de tréhalose, forçant le film de carbone à s’éloigner de la barre de grille (Figure 1). Le repositionnement du film de carbone loin du point de contact d’origine avec la barre de grille se produit à l’étape suivante, lorsque la grille est à nouveau épongée sur du papier filtre submicronique. Le nombre d’itérations de ces étapes peut être optimisé pour des échantillons spécifiques. De plus, le protocole peut être utilisé pour augmenter les concentrations des échantillons tout en évitant l’agrégation en Z. En raison de la dépendance à l’adhérence à la barre de grille et au film de carbone ainsi que de la séparation forcée, cette approche peut ne pas convenir aux molécules très fragiles telles que certaines protéines et complexes protéiques délicats et / ou instables.
La technique du peel-blot ne nécessite ni équipement spécialisé ni fournitures coûteuses. L’applicabilité à des échantillons spécifiques nécessitera toutefois un examen attentif des paramètres biologiques. La décision est plus facile pour les cristaux 2D car un film de carbone est nécessaire pour assurer la planéité, mais la manipulation via la technique du peel-blot peut affecter l’intégrité biologique de l’échantillon ou l’ordre cristallin. L’adéquation de la technique peel-blot aux particules uniques est limitée et peut être testée pour celles qui nécessitent un film de carbone et sont stables à la manipulation. Les spécimens présentant des interactions biologiques critiques entre les couches peuvent ne pas convenir à la caractérisation à l’aide de la technique du peel-blot en raison de la perturbation de ces interactions.
La technique du peel-blot (« peel-blot ») est optimisée le plus rapidement par le test et le dépistage avec des échantillons négatifs ou non colorés par TEM à température ambiante. Une fois que le nombre optimal d’itérations peel-blot a été identifié, le temps nécessaire pour contrôler l’épaisseur avant la vitrification peut être déterminé.
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Protocol
1. Étapes de préparation pour la technique peel-blot
REMARQUE: La préparation nécessite que les éléments suivants soient placés les uns à côté des autres.
- Empiler deux morceaux de papier filtre de 20 à 25 μm de taille pore (voir le tableau des matériaux).
- Placez un film de paraffine de ~8 cm x 10 cm de long à côté du papier filtre avec le papier tourné vers le haut.
- Placez un morceau de papier filtre submicronique sur deux autres morceaux de papier filtre #4 (Figure 1-1).
- Positionnez la pince anti-capillaire avec la jambe pliée vers le haut et la jambe droite vers le bas. Ensuite, sélectionnez une grille à 600 mailles avec le côté lisse / brillant vers le haut. Placez les pinces sur une boîte de Petri ou une autre surface surélevée pour éviter le contact de la grille propre avec d’autres articles.
- Retirez le papier du film de paraffine et tirez sur les côtés (~5 mm) pour créer un petit bord. Pipeter deux gouttes de 150 μL de solution de tréhalose à 4 % ~1-2 cm d’un côté court du film de paraffine et ~1 cm d’intervalle sur le film de paraffine.
- Sur un banc séparé ou sur le sol, versez de l’azote liquide dans un petit contenant en mousse de polystyrène (voir Tableau des matériaux).
ATTENTION : Recevez une formation sur la manipulation appropriée à l’aide de gants et d’un écran facial afin d’éviter les engelures. - Placez un petit récipient cryo-EM dans l’azote liquide et couvrez le récipient en mousse de polystyrène avec des lingettes non pelucheuses.
2. Placer le film de carbone sur le réseau
- Utilisez la pince Dumont #5 (voir Tableau des matériaux) pour faire flotter le film de carbone du mica en touchant un côté du mica à un léger angle vers le bas (~20°-40°) sur l’une des gouttes de solution de tréhalose et laissez lentement la tension de l’eau se soulever du film de carbone en déplaçant le mica vers le bas. Libérez le mica une fois que le film de carbone flotte à la surface de la gouttelette.
- Inspectez visuellement le film de carbone pour éviter d’utiliser du carbone endommagé sous forme de fractures.
- Insérez la grille maintenue par la pince anticapillaire à un angle (~20°-30°) dans une goutte de tréhalose à une position adjacente, puis centrée sous le film de carbone. Ramassez le film de carbone (figure 1-2).
- Gardez la grille dans la même orientation et abaissez-la lentement sur la surface de la deuxième goutte de tréhalose sans rompre la tension superficielle de la goutte pour éliminer le film de carbone inutile qui aurait pu s’enrouler autour du bord de la grille du côté rugueux.
3. Séparation de cristaux 2D multicouches en couches simples
- Faites pivoter les pinces anticapillaires (voir le tableau des matériaux) et placez-les sur une boîte de Pétri avec le côté carbone de la grille vers le bas (figure 1-3).
- Pipeter 1,3 μL de l’échantillon dans le ménisque du tréhalose léger au-dessus de la grille. Pipeter la solution ~8-10 fois pour mélanger et répartir le tréhalose et échantillonner des deux côtés de la grille.
- Pendant l’incubation de la solution pendant 1 min, pipeter une ou plusieurs gouttes de 1,7 μL de solution de tréhalose sur le film de paraffine.
- Faites pivoter la grille dans sa position d’origine avec le film de carbone tourné vers le haut.
- Utilisez les pinces anticapillaires pour presser la grille sur le papier filtre submicronique (Figure 1-4). Une fois que la solution a été absorbée par le papier filtre et que le film de carbone est à plat, attendre 3 secondes avant de soulever la grille et de la déplacer verticalement sur la goutte de 1,7 μL de solution de tréhalose (Figure 1-5).
REMARQUE: Répétez cette étape plusieurs fois pour les échantillons fortement empilés, ou la grille est préparée pour la vitrification dans les étapes suivantes. - Épongez la grille sur les deux feuilles de papier filtre, puis soulevez la grille du papier filtre (Figure 1-6). Après environ 13 s, selon l’humidité et le tampon d’échantillon, plongez la grille dans l’azote liquide dans le petit récipient en polystyrène expansé et placez la grille dans le récipient cryo-EM grid ou transférez-la directement pour le dépistage cryo-EM ou la collecte de données.
REMARQUE: Afin d’optimiser rapidement le protocole, tachez négativement la grille pelée à cette étape plutôt que de la plonger dans de l’azote liquide. Colorer négativement l’échantillon en appliquant 3 μL d’acétate d’uranyle à 1% sur la grille, incuber la grille pendant 30 s et l’éponger avec un morceau déchiré de papier filtre de 20 à 25 μm de la taille des pores. Les grilles de cristaux 2D vitrifiés dans du tréhalose, du tanin ou du glucose sont régulièrement plongées à la main pour la vitrification car le tréhalose, le tanin et le glucose empêchent la formation de glace cristalline à des taux utilisés pour plonger à la main2.
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Representative Results
Une expérience réussie de transfert de pelage aboutira à des couches uniques d’échantillons à des concentrations souvent élevées. Il faut s’attendre à ce que certaines régions de la plupart des carrés de la grille contiennent encore plusieurs couches, en particulier à moins d’itérations des étapes de transfert de pelage. La majorité des carrés de grille, cependant, contiendront de vastes régions de couches simples comme observé pour les cristaux 2D de leucotriènesC4 synthase humaine (Figure 2) et de liposomes (ajoutés à l’étape 3.2, Figure 3). D’autres étapes de peel-blot peuvent devoir être testées pour les échantillons qui ne montrent pas la réduction souhaitée des couches.
L’indication la plus importante d’une expérience réussie par peel-blot sera la qualité des données et l’intégrité biologique observées après la collecte de données cryo-EM à haute résolution et le traitement d’images. L’interprétation des données devra inclure un examen attentif des dommages potentiels ou de la distorsion des régions de contact entre les couches.
Les régions de la grille EM dans lesquelles le peeling a été buvardé affichent généralement une concentration d’échantillon plus élevée que les régions dans lesquelles il ne s’est pas produit. Cet effet de concentration apparent est causé par l’adhérence de l’échantillon multilamellaire à la fois au film de carbone et aux surfaces de la barre de grille, suivie d’une adhérence supplémentaire aux deux surfaces pendant la préparation par peel-blot, car elles se séparent à plusieurs reprises, se repositionnent légèrement et entrent à nouveau en contact. Le résultat est que les différentes couches de l’échantillon multilamellaire original sont réparties sur une plus grande surface latérale (Figure 3 et Figure 4). Ces régions peuvent même contenir des cristaux ou des membranes 2D plus grandes. Les deux phénomènes sont facilement observés et comparés dans les zones où une « zone de pelure » est adjacente à une zone non affectée par l’étape du transfert de peau (figure 3). Les images des figures 2 à 4 ont été recueillies dans des conditions de faible dose à une tension d’accélération de 120 kV à l’aide d’un microscope électronique à transmission (voir le tableau des matériaux).
Figure 1 : Représentation schématique de la technique peel-blot. Les deux premières étapes (1-2 et 1-3) et la dernière étape (1-6) de la technique peel-blot sont basées sur la méthode d’injection arrière2 et les étapes intermédiaires suivent le protocole peel-blot (modifié à partir de Johnson et al.1). À l’étape 1, (A) deux morceaux de papier filtre de format pore de 20 à 25 μm sont empilés, (B) adjacents à un morceau de film de paraffine avec deux gouttes de solution de tréhalose et (C) un morceau de papier filtre submicronique sur deux morceaux supplémentaires de papier filtre. À l’étape 2, (A) le film de carbone est flotté sur la première gouttelette de tréhalose et (B) ramassé avec une pince anti-capillaire, après quoi il est touché à la surface de la deuxième gouttelette (non représenté) sans rompre la tension superficielle pour éliminer l’excès de film de carbone de la périphérie. À l’étape 3, (A) les pinces qui maintiennent la grille sont tournées de 180° (le côté film de carbone de la grille est maintenant orienté vers le bas) et (B) l’échantillon est pipeté dans le ménisque du tréhalose. À l’étape 4, la grille a été tournée vers l’orientation d’origine avec le film de carbone vers le haut et l’échantillon est lentement abaissé sur le papier filtre submicronique. La grille est soulevée et, à l’étape 5, abaissée verticalement sur une goutte de 1,7 μL de solution de tréhalose. Les étapes 4 et 5 sont appelées « peel-blot » et peuvent être répétées trois fois ou plus, selon la quantité d’empilage. Il peut être nécessaire d’optimiser le nombre d’itérations pour différents échantillons. À l’étape 6, (A) l’échantillon est buvardé sur deux couches de papier filtre de format pore de 20-25 μm, avant (B) il est plongé à la main dans de l’azote liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Échantillon de cristaux 2Dsoumis à la méthode par peel-blot. La région à gauche de la flèche a été largement réduite à des cristaux 2D à couche unique dans une région de contact entre le film de carbone et la barre de grille qui a été écaillée puis déplacée, tandis que la région à droite de la flèche n’était pas dans une région affectée par la tache de pelage. Les régions écorchées peuvent facilement être sélectionnées et sont observées sur la majeure partie de la grille. Les cristaux 2D représentés sont des cristaux 2D empilés et monocouches de leucotrièneC4 synthase humaine. La barre d’échelle correspond à 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Liposomes soumis au peel-blot. Le peel-blot peut être appliqué avec succès pour interrompre les bords des liposomes et des vésicules effondrés pour obtenir des régions avec de grandes bicouches phospholipidiques principalement monocouches, comme observé dans la moitié inférieure de l’image. La moitié supérieure n’était pas dans une zone de contact entre la barre de grille et le film de carbone et contient donc des liposomes complets avec deux bicouches phospholipidiques. La barre d’échelle correspond à 1 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : L’empreinte par transfert de pelage. Le carré de la grille d’une grille de 400 mailles montre l’empreinte (étiquetée « B ») de la barre de grille et les régions écaillées résultantes, ainsi que les régions (étiquetées « C ») qui n’étaient pas en contact avec une barre de grille ou qui n’ont pas fait l’objet de moins d’itérations de transfert de pelage. La barre d’échelle correspond à 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Éponger une grille EM préparée par rétroinjection sur un papier filtre submicronique, en utilisant un film de carbone trop mince. Les images sont des images uniques d’une vidéo (voir vidéo 1) prise à (A) contact initial avec la membrane, (B) 1000 ms après contact, et (C) 2000 ms après contact. La flèche indique les carrés de la grille dans lesquels la pression capillaire a rompu le film de carbone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1: La grille est placée sur le papier filtre submicronique pour l’étape de peel-blot. Le film de carbone est lentement et étroitement aspiré sur la grille dans la direction allant du bas à gauche vers le haut à droite, ce qui prend étroitement en sandwich l’échantillon entre la barre de grille et le film de carbone. Le film de carbone et donc les couches d’échantillons individuelles sont déplacés à chaque étape ultérieure de peel-blot, ce qui permet une optimisation avec des itérations supplémentaires pour des échantillons plus fortement stratifiés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
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Discussion
Le peel-blot est une méthode puissante pour surmonter l’empilement et l’épaisseur de cristaux 2D multicouches et d’échantillons similaires pour la collecte de données cryo-EM et le traitement d’images. Une décision sur l’utilisation du peel-blot sera basée sur les paramètres biologiques de l’échantillon et devra également être évaluée une fois qu’un modèle 3D cryo-EM sera disponible. L’importance biologique des contacts et la flexibilité potentielle des régions de contact seront particulièrement importantes dans cette évaluation.
Le nombre de peel-blots sera d’abord établi par observation après la préparation standard de la grille de coloration négative, où des couches ou une épaisseur excessives nécessiteront des stratégies alternatives à la préparation standard de la grille cryo-EM. Les cristaux minces multicouches empilés dans le registre peuvent être directement utilisés pour microED3 ou broyés FIB dans le cas de cristaux plus épais4. Le peel-blot ne sera généralement pas nécessaire pour les cristaux 2D à double couche car les couches peuvent être traitées individuellement ou ensemble, lorsque les couches sont dans le registre5. Il pourrait être potentiellement bénéfique pour exposer les deux côtés des cristaux 2D de protéines membranaires à des ligands ou des inhibiteurs, une fois en solution avant le peel-blot, et une fois après l’étape finale de peel-blot. De plus, la réduction de gros cristaux 2D à double couche bien ordonnés peut permettre la diffractionélectronique 6,7. Les multicouches, induites ou biologiques, de cristaux 2D de protéines membranaires et solubles seront les cibles les plus probables pour le peel-blot, même si le protocole peut être appliqué à une gamme d’échantillons et servir à concentrer divers échantillons pour la cryo-EM (Figure 4).
Les tests initiaux avec une coloration négative réduiront considérablement le temps et le coût d’optimisation des échantillons, car la congélation, la préparation des porte-échantillons cryo-EM, le transfert vers un cryo-EM et l’utilisation d’un cryo-EM ne sont pas nécessaires. Seul le temps de séchage avant l’étape de congélation devra être optimisé séparément. Le temps de séchage sera identique ou très similaire au temps utilisé pour sécher une grille de rétroinjection standard du même échantillon1.
Alors que les grilles à 600 mailles permettent généralement une bonne préservation du film de carbone, un nombre accru d’itérations pelées et de couches de film de carbone plus minces peuvent entraîner une augmentation de la rupture du film de carbone (figure 5). Les cristaux 2D empilés, les liposomes et les échantillons en couches de grands réseaux de protéines solubles peuvent être séparés avec succès (figures 2-4).
L’échantillon est soigneusement évalué par cryo-EM pour s’assurer que les effets néfastes sur la qualité de l’échantillon sont évités. Ceci peut être réalisé par traitement d’image pour comparer des images de cristaux empilés et non empilés. À la fois à des fins d’évaluation et pour atteindre l’objectif d’un modèle 3D, le traitement d’image est effectué via les programmes 2dx disponibles dans Focus8,9, qui met également en œuvre des approches à particule unique pour traiter les imperfections du réseau et l’hétérogénéité des protéines avec la possibilité d’augmenter considérablement la qualité inhérente des cristaux 2D originaux10.
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Disclosures
Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts.
Acknowledgments
Une partie de ce travail a été soutenue par la subvention HL090630 (ISK) des NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 600-mesh grids | SPI | 2060-C-XA | |
| Anti-capillary forceps | Ted Pella | 510-5 | |
| Carbon to coat mica | |||
| Cryo-EM | Cryo-EM grids may be screened at 120 kV or 200 kV. High-resolution data is collected at 300 kV. | ||
| Dumpont #5 forceps | Ted Pella | 5622 | |
| Grid box for cryo-EM storage | Ted Pella | 160-40 | |
| Kim Wipes | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Mica | Ted Pella | 56 | The mica is carbon-coated and cut into squares that are slighlty larger than a TEM grid. The carbon thickness may require optimization to avoid thin carbon that breaks easily upon multiple peel blots. |
| Negative stain | 1-2% uranyl acetate is suitable for many samples. Other stains such as phosphotungstic acid can be substituted. | ||
| Parafilm | |||
| Polystyrene container | Used for vitrifying the peel-blot grid. A polystyrene shipping container can be recycled for this purpose and lined with aluminium foil. | ||
| Submicron filter paper | MilliporeSigma | DAWP04700 | |
| Transmission electron microscope | JEOL | JEM-1400 | Any TEM operated at an accelerating voltage of 80-120 kV will be suitable for screening of negatively stained grids. |
| Trehalose | Prepare 4% trehalose solution. | ||
| Whatman #4 filter paper | MilliporeSigma | WHA1004150 | This corresponds to the 20-25 μm pore size filter paper in the protocol. |
References
- Johnson, M. C., Uddin, Y. M., Neselu, K., Schmidt-Krey, I. 2D crystallography of membrane protein single-, double- and multi-layered ordered arrays. Methods in Molecular Biology. 2215, 227-245 (2021).
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- Nannenga, B. L., Gonen, T. MicroED: a versatile cryoEM method for structure determination. Emerging Topics in Life Sciences. 2 (1), 1-8 (2018).
- Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J., Gonen, T. Collection of continuous rotation microED data from ion beam-milled crystals of any size. Structure. 27 (3), 545-548 (2019).
- Gonen, T. et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638(2005).
- Gonen, T. The collection of high-resolution electron diffraction data. Methods in Molecular Biology. 955, 153-169 (2013).
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- Righetto, R., Stahlberg, H.Single particle analysis for high-resolution 2D electron crystallography. Methods in Molecular Biology. 2215, 267-284 (2021).
